專利名稱：：一種基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針基因突變檢測(cè)方法及其專用芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因分析領(lǐng)域中一種鑒別基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑盒。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組時(shí)代的到來(lái)，鑒定并描述的人類致病基因和藥物相關(guān)基因越來(lái)越多，基因突變作為基因發(fā)生的可遺傳性變異，往往可以導(dǎo)致基因的功能發(fā)生改變，因此通過對(duì)有顯著功能意義的基因突變進(jìn)行檢測(cè)，可以推動(dòng)臨床疾病的預(yù)防、診斷和治療，這己成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，而大規(guī)?？焖俚幕蛲蛔儥z測(cè)方法也受到了人們的高度重視。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)基因突變進(jìn)行檢測(cè)的方法主要有以下幾種直接測(cè)序法根據(jù)突變位點(diǎn)所在基因的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，對(duì)突變位點(diǎn)的基因型進(jìn)行直接解讀，這是目前對(duì)基因突變進(jìn)行檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是這種方法操作復(fù)雜，成本較高，需要用到專門的測(cè)序儀，因此僅用于科研，不適于在臨床檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，即PCR-RFLP，原理為將待測(cè)的DNA片段PCR擴(kuò)增后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)酶切片段的大小和數(shù)目來(lái)判斷目的基因是否存在基因突變。這種方法應(yīng)用較廣，但標(biāo)準(zhǔn)化程度差，對(duì)混合基因型的檢測(cè)能力低，檢測(cè)基因突變時(shí)，對(duì)于l個(gè)堿基以上的突變，需要多個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)分別檢出，另外還需要進(jìn)行凝膠的溴乙錠染色，存在著較大的環(huán)境污染和對(duì)人體健康的損害。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)想多態(tài)性分析，即PCR-SSCP法，原理是在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依據(jù)其堿基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改變。由于該法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。用PCR-SSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突變檢出率可達(dá)70%-95%，但當(dāng)片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50%左右，而且該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過序列分析來(lái)確定。與PCR-RFLP—樣，該法由于需要制備聚丙烯酰胺凝膠，也存在較大的環(huán)境污染。等位基因特異性引物PCR，即PCR-SSP，該方法是利用與等位基因序列互補(bǔ)的引物，對(duì)待測(cè)樣本DNA進(jìn)行特異性PC財(cái)廣增，等位基因特異性引物僅與其匹配的特異突變序列結(jié)合并特異性地?cái)U(kuò)增出等位基因特異性片段，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)特異性PC財(cái)廣增產(chǎn)物的出現(xiàn)與否，對(duì)待側(cè)樣本的基因型別進(jìn)行判斷。這種方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，對(duì)設(shè)備要求不高，結(jié)果判斷容易，但缺點(diǎn)是反應(yīng)條件不易控制，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量，而且同樣存在環(huán)境的污染。以上的幾種方法都僅適用于小樣本量和少量基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)，要實(shí)現(xiàn)大樣本高通量的基因檢測(cè)，目前最理想的方法是基因芯片檢測(cè)技術(shù)，與其他技術(shù)相比較，基因芯片具有體積小、重量輕、成本低，便于攜帶，防污染，分析過程高通量、高度自動(dòng)化和速度快，所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)該種技術(shù)得到了人們的極大關(guān)注并取得了迅速發(fā)展，并有多個(gè)基于基因芯片技術(shù)進(jìn)行的基因突變的檢測(cè)的產(chǎn)品問世。目前用于突變檢測(cè)的大多是序列特異性探針雜交法(SSOP)基因芯片技術(shù)，該種技術(shù)利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特點(diǎn)，對(duì)發(fā)生突變的眾多基因設(shè)計(jì)序列特異性的寡核苷酸探針，將這些探針固定于同一張基片上，將待測(cè)的包含突變位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外擴(kuò)增后與芯片雜交，根據(jù)雜交的信號(hào)判斷突變位點(diǎn)的基因型。這種方法的基本原理是與基因特定序列互補(bǔ)的一段序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)對(duì)基因序列的特異性識(shí)別。當(dāng)探針的序列與基因序列完全匹配時(shí)所形成的雜交體熱穩(wěn)定性高于含有錯(cuò)配堿基的雜交體，據(jù)此通過控制雜交溫度和其他雜交條件可以使完全匹配的雜交體與含有錯(cuò)配堿基的雜交體區(qū)分開來(lái)，從而達(dá)到基因分型的目的。上述芯片技術(shù)盡管從理論上可以利用含有錯(cuò)配堿基的探針和目標(biāo)基因形成的雜合體穩(wěn)定性差的現(xiàn)象對(duì)基因序列上的堿基變化進(jìn)行檢測(cè)，但是往往由于堿基錯(cuò)配形式不同、基因序列不同、基因高級(jí)結(jié)構(gòu)的差異等因素造成實(shí)際情況比理論情況要復(fù)雜得多，為了提高探針對(duì)單個(gè)堿基變化的檢測(cè)準(zhǔn)確率，一般傾向于把探針設(shè)計(jì)的較短，但是為了保證探針對(duì)基因識(shí)別的特異性和維持較高的雜交信號(hào)強(qiáng)度又不能使探針過短，而且即使是相同長(zhǎng)度的探針也會(huì)由于其GC含量不同、所檢測(cè)的突變堿基在探針上的相對(duì)位置不同等原因使得這種基于探針雜交的過程變得十分復(fù)雜，短探針與靶序列的雜交特異性問題這時(shí)候就變得非常突出，具體的表現(xiàn)就是野生型探針和突變型探針在雜交時(shí)都會(huì)出現(xiàn)非特異性的雜交信號(hào)，無(wú)法做到檢測(cè)信號(hào)的"全或無(wú)"，必須嚴(yán)格控制雜交條件并反復(fù)摸索才能夠準(zhǔn)確地區(qū)分基因型。目前也有一些方法可以用來(lái)提高探針檢測(cè)基因序列變化，尤其是單個(gè)堿基變化的特異性，例如對(duì)核酸上的戊糖進(jìn)行化學(xué)修飾以提高探針Tm值的方法(LNA法)、用肽核酸代替核酸作為探針的方法(PNA法)。另外，還有人用堿基類似物(如3硝基砒硌)對(duì)寡核苷酸探針中的某個(gè)堿基進(jìn)行替換從而拉大完全匹配和含單堿基突變探針之間Tm值得差異性。這些方法都因?yàn)閷?shí)際操作難度大、成本高等原因局限在實(shí)驗(yàn)室階段，無(wú)法用于大范圍推廣使用。因此，目前迫切需要建立一種操作方便、價(jià)格便宜、實(shí)用性強(qiáng)的方法來(lái)提高探針雜交的特異性，使寡核苷酸芯片在基因序列分析中發(fā)揮更大的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述基因突變檢測(cè)中存在的問題，提供一種利用基因芯片技術(shù)對(duì)基因突變，尤其是藥物相關(guān)基因突變進(jìn)行快速、敏感、高通量和特異性檢測(cè)的方法及其專用芯片和試劑盒。一種基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針基因突變檢測(cè)方法，包括如下步驟以待檢測(cè)的來(lái)自于人體組織的基因組為模板，用針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物組和沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重等位基因特異性PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的根據(jù)該突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的等位基因特異性探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定各基因位點(diǎn)的突變類型；其中所說的引物組包括以下5條引物野生型等位基因內(nèi)引物Innerprimer-W、突變型等位基因內(nèi)引物Innerprimer-M、野生型等位基因外引物Outerprimer-W、突變型等位基因外引物Outerprimer-M、特異性擴(kuò)增輔助引物GC-primer;所述等位基因特異性內(nèi)引物的結(jié)構(gòu)為靠近其5'端的是一段長(zhǎng)度為8-15nt的由G和C組成的與模板DNA不匹配的序列；靠近其3'端的是一段包括17-30nt的序列，且3'端最后一個(gè)堿基恰好位于待檢測(cè)的一個(gè)基因突變位點(diǎn)上，與該位點(diǎn)的突變型或野生型堿基匹配，其余堿基與突變位點(diǎn)前的相應(yīng)片段完全匹配；所述各個(gè)位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助弓I物GC-primer是一段由G和C組成的序列，該序列與所述等位基因特異性內(nèi)引物的靠近5'端部分完全相同；每個(gè)基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)兩組寡核苷酸探針，分別對(duì)應(yīng)于野生型等位基因和突變型等位基因，每組探針又包括一條長(zhǎng)度為14-25nt的等位基因特異性短探針和一條長(zhǎng)度為50-70nt等位基因特異性長(zhǎng)探針，所述的每個(gè)突變位點(diǎn)的野生型等位基因特異性探針和突變型等位基因特異性探針分別與前面所描述的經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增生成的包含該突變位點(diǎn)的野生型堿基和突變型堿基的核苷酸片段匹配；所述等位基因基因特異性短探針與擴(kuò)增片段上包含該基因突變位點(diǎn)的一段序列匹配，所述等位基因基因特異性長(zhǎng)探針與位于擴(kuò)增片段上該基因突變位點(diǎn)下游但不包含該位點(diǎn)的一段序列匹配。本發(fā)明所提供的基因突變檢測(cè)方法，是以待檢測(cè)的來(lái)自于人體組織的基因組為模板，用針對(duì)特定突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物組和沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重等位基因特異性PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片上的寡核苷酸探針(等位基因特異性探針)進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定各基因位點(diǎn)的突變類型。所述等位基因特異性探針，是指針對(duì)待測(cè)基因突變位點(diǎn)的特定基因型所設(shè)計(jì)的探針。針對(duì)每一位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物組包括一對(duì)位于不同DNA鏈上的等位基因特異性內(nèi)引物(Innerprimer)和對(duì)應(yīng)的兩條外引物(Outerprimer)，以及各個(gè)突變位點(diǎn)共用的一條特異性擴(kuò)增輔助引物(GC-primer)。所述等位基因特異性引物(包括內(nèi)引物和外引物)，是指針對(duì)待測(cè)基因突變位點(diǎn)的特定基因型所設(shè)計(jì)的引物。具體來(lái)說，每個(gè)基因突變位點(diǎn)的引物組包括以下5條引物野生型等位基因內(nèi)引物Innerprimer-W、突變型等位基因內(nèi)引物Innerprimer-M、野生型等位基因外引物Outerprimer-W、突變型等位基因外引物Outerprimer-M、特異性擴(kuò)增輔助引物GC-primer。所述等位基因特異性內(nèi)引物的結(jié)構(gòu)為靠近其5'端的是一段長(zhǎng)度為8-15nt的由G和C組成的與模板DNA不匹配的序列；靠近其3'端的是一段包括17-30個(gè)堿基的序列，且3'端最后一個(gè)堿基恰好位于待檢測(cè)的一個(gè)基因突變位點(diǎn)上，與該位點(diǎn)的突變型或野生型堿基匹配，其余堿基與突變位點(diǎn)前的相應(yīng)片段完全匹配；優(yōu)選在3'端倒數(shù)第2或第3位處引入一個(gè)人工錯(cuò)配的堿基。所述等位基因特異性外引物可根據(jù)相應(yīng)的等位基因特異性內(nèi)引物和待擴(kuò)增的基因片段設(shè)計(jì)并合成，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員均可以掌握，詳細(xì)操作步驟可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》([美]J.薩姆布魯克著，科學(xué)出版社)。所述各個(gè)位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物(GC-primer)是一段由G和C組成的寡核苷酸序列，用于在反應(yīng)體系中促進(jìn)特異性擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，故名。GC-primer的序列與所述等位基因特異性內(nèi)引物的靠近5'端部分完全相同。GC-primer的5'端標(biāo)記有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)的分子，這些分子包括地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等，這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法以及各標(biāo)記物的檢測(cè)方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)共用特異性擴(kuò)增輔助引物的5'端進(jìn)行Cy5標(biāo)記。所述位于基因芯片上的等位基因特異性探針對(duì)各基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)，每個(gè)基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)兩組探針，分別對(duì)應(yīng)于野生型等位基因和突變型等位基因，每組探針又包括一條等位基因特異性短探針(長(zhǎng)度為14-25nt)和一條等位基因特異性長(zhǎng)探針(長(zhǎng)度為50-70nt)。所述的每個(gè)突變位點(diǎn)的野生型等位基因特異性探針(包括野生型短探針SP-W和野生型長(zhǎng)探針LP-W)和突變型等位基因特異性探針(包括突變型短探針SP-M和突變型長(zhǎng)探針LP-M)分別與前面所描述的經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增生成的包含該突變位點(diǎn)的野生型堿基和突變型堿基的核苷酸片段匹配。即SP-W和LP-W與Innerprimer-W和Outerprimer-W擴(kuò)增生成的片段P,P2匹配，SP-W對(duì)應(yīng)于P^上包含野生型堿基的一段序列，LP-W對(duì)應(yīng)于PtP2上該基因突變位點(diǎn)下游但不包含該位點(diǎn)的一段序列；SP-M和LP-M與Innerprimer-M和Outerprimer-M擴(kuò)增生成的片段&4匹配，SP-M對(duì)應(yīng)于&^上包含野生型堿基的一段序列，LP-M對(duì)應(yīng)于P3P4上該基因突變位點(diǎn)下游但不包含該位點(diǎn)的一段序列。PA和P3P4分別來(lái)自于雙鏈DNA模板的不同單鏈。本發(fā)明的技術(shù)路線參考圖10。用上述引物組進(jìn)行的等位基因特異性PCR擴(kuò)增的原理如下1)野生型等位基因內(nèi)引物和突變型等位基因內(nèi)引物分別與模板DNA雙鏈的兩條單鏈互補(bǔ)，且3'端正好與SNP位點(diǎn)重合，而引物的3'端是否與模板匹配決定了引物的延伸反應(yīng)是否可以進(jìn)行下去；只有當(dāng)野生型等位基因存在時(shí)(即基因型為野生型純合子或突變雜合子)，野生型等位基因內(nèi)引物(Innerprimer-W)和與之對(duì)應(yīng)的野生型等位基因外引物(Outerprimer-W)才可以擴(kuò)增出包括相應(yīng)待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；只有當(dāng)突變型等位基因存在時(shí)(即基因型為突變型純合子或突變雜合子)，突變型等位基因內(nèi)引物(Innerprimer-M)和與之對(duì)應(yīng)的突變型等位基因外引物(Outerprimer-M)才可以擴(kuò)增出包括相應(yīng)待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的突變型堿基在內(nèi)的核苷酸片段。2)在引物的3'端倒數(shù)第2或第3位處引入一個(gè)人工錯(cuò)配的堿基，可以提高上述延伸反應(yīng)的特異性。3)所述各個(gè)位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物(GC-primer)的序列與內(nèi)引物的5'端部分完全一致，在PCR反應(yīng)的最初循環(huán)，該引物不起作用，一旦內(nèi)引物中的任一條或兩條同時(shí)與模板結(jié)合并延伸，與之相對(duì)應(yīng)的外引物向其5'端方向延伸，就形成了一段可以與GC序列完全互補(bǔ)的序列，在以下的循環(huán)延伸反應(yīng)中，將以此片段為模板，在GC-primer和外引物的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，這樣可以使特異性延伸產(chǎn)物的量增加。4)對(duì)GC-primer進(jìn)行5'端標(biāo)記，可以使生成的等位基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端也帶有標(biāo)記，可以被用來(lái)方便地對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，避免了對(duì)每個(gè)待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的每條引物都進(jìn)行標(biāo)記的麻煩。本發(fā)明可以用來(lái)檢測(cè)藥物相關(guān)基因的常見有功能意義的SNP突變，藥物相關(guān)基因是人體內(nèi)編碼與藥物代謝和發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)的藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體及藥物作用耙點(diǎn)的基因，其基因突變可對(duì)人體的藥物反應(yīng)性產(chǎn)生顯著影響，對(duì)其常見基因突變進(jìn)行檢測(cè)，并利用檢測(cè)的結(jié)果調(diào)整用藥方案，是當(dāng)前藥物治療學(xué)領(lǐng)域的一大發(fā)展方向。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所選擇的藥物相關(guān)基因突變位點(diǎn)如下表所示表1本發(fā)明涉及到的藥物相關(guān)基因突變位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>⑧上表中相關(guān)藥物的編號(hào)為①抗高血壓藥物②抗腫瘤藥物③抗糖尿病藥物調(diào)脂藥物(D抗心率失常藥⑥質(zhì)子泵抑制劑⑦中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物/鎮(zhèn)痛藥⑧抗凝藥⑨抗心絞痛上述各個(gè)突變位點(diǎn)的等位基因特異性內(nèi)引物的序列(靠近3'端的序列)以及各個(gè)突變位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物的序列如下表2根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所選取的涉及的藥物相關(guān)基因突變的等位基因特異性內(nèi)引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上表中，針對(duì)每一藥物相關(guān)基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一條野生型等位基因內(nèi)引物(innerP-W)序列和一條突變型等位基因內(nèi)引物(innerP-M)序列，在實(shí)際使用中，可選擇一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的兩個(gè)序列的3'端任意連續(xù)17-30個(gè)堿基(包括3'端的野生型或突變型堿基在內(nèi))作為內(nèi)引物的序列。另外，為了提高等位基因特異性擴(kuò)增的效率，可以在靠近內(nèi)引物的3'端引入一個(gè)人工錯(cuò)配的堿基，一般是在3'端的倒數(shù)第2或第3位上引入，所述人工錯(cuò)配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，所述類似物包括尿嘧啶(U)、肽核酸(PNA)和鎖定核酸(LNA)，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。本發(fā)明所述的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的若干種寡核苷酸探針(等位基因特異性探針)。所述的固相支持物可釆用基因芯片領(lǐng)域常用的各種材料，如但不限于經(jīng)活性基團(tuán)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片、各種纖維膜、尼龍膜等，用于修飾的活性基團(tuán)如但不限于醛基、氨基、巰基、羧基等，本發(fā)明優(yōu)選醛基化修飾的玻片。本發(fā)明所涉及的用于檢測(cè)表1中各突變位點(diǎn)的等位基因特異性短探針序列來(lái)自下述表3中17對(duì)單鏈核苷酸片段中的一對(duì)或任意多對(duì)，由所述17對(duì)單鏈核苷酸片段上的包括基因突變位點(diǎn)(方框內(nèi)的堿基)在內(nèi)的任意連續(xù)14-25個(gè)堿基組成，所述17對(duì)單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是下表中的序列36至序列69。表3本發(fā)明涉及的藥物相關(guān)基因突變的等位基因特異性短探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明所述基因芯片的等位基因特異性長(zhǎng)探針根據(jù)每個(gè)基因突變位點(diǎn)的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化，本發(fā)明優(yōu)選的長(zhǎng)探針序列為下述n對(duì)單鏈核苷酸片段中的一對(duì)或任意多對(duì)，所述17對(duì)單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列70至序列103。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在上述設(shè)計(jì)的各探針序列的基礎(chǔ)上，為了控制雜交過程中各種因素對(duì)雜交信號(hào)值的干擾和對(duì)雜交過程進(jìn)行評(píng)估，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可通過本領(lǐng)域熟知的方法設(shè)計(jì)并合成芯片質(zhì)控對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照等質(zhì)控探針。在上述設(shè)計(jì)的各探針序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行探針合成，并通過對(duì)探針3'端或5'端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來(lái)增加雜交容量；以及對(duì)其3'端或5'端進(jìn)行化學(xué)集團(tuán)修飾(比如氨基化修飾)，使探針能通過化學(xué)鍵結(jié)合到相應(yīng)的固相支持物上(如醛基化玻片)；本發(fā)明優(yōu)選對(duì)探針的3'端進(jìn)行氨基修飾，其相較5'端修飾的探針具有更好的雜交效果。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)基因突變的試劑盒，其至少包括本發(fā)明的上述引物(包括內(nèi)引物、外引物和/或特異性擴(kuò)增輔助引物，不同位點(diǎn)的上述引物可以分開放置，也可以組成引物混合物)和基因芯片(包括固相支持物和寡核苷酸探針，探針可以固定在固相支持物上，也可不固定在固相支持物上)，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包含下述試劑中的一種或幾種從待檢樣本中提取DNA的樣本處理試劑;PCR擴(kuò)增試劑；雜交試劑；顯色試劑。上述樣本處理試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑以及顯色試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時(shí)可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的指示自行配制。本發(fā)明的試劑盒中還可以包括相應(yīng)的陰性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照樣本。本發(fā)明的引物(包括內(nèi)引物、外引物和/或特異性擴(kuò)增輔助引物)、芯片(包括固相支持物、短探針、長(zhǎng)探針、各種指控探針)及其試劑盒(包括引物、芯片和/或其他試劑)可以針對(duì)一個(gè)基因突變進(jìn)行設(shè)計(jì)，也可以組合用于檢測(cè)多個(gè)基因突變。常見的組合包括-1、以SEQIDNO.1-16所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.36-51所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.70-85所示的序列作為制備芯片所需的長(zhǎng)探針序列，這樣組成的芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可用于檢測(cè)常見藥物代謝酶(CYP2C9、CYP2Q9、CYP2D6、CYP3A5、TPMT、ALDH2)的基因突變r(jià)sl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rs776746、rsl065852、rsl142345和rs671，確定患者對(duì)相關(guān)藥的代謝活性。2、以SEQIDNO.17-24所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.52-59所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.86-93所示的序列作為制備芯片所需的長(zhǎng)探針序列，這樣組成的芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可用于檢測(cè)常見藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體(匿l、BCRP、SLC22A1、SLC22A6)的基因突變r(jià)sl045642、rs2231142、rs2282M3和rs4149056，確定患者對(duì)相關(guān)藥的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除能力。3、以SEQIDNO.25-34所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQID16NO.60-69所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.94-103所示的序列作為制備芯片所需的長(zhǎng)探針序列，這樣組成的芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可用于檢測(cè)常見藥物作用革巴點(diǎn)(ADRBl、AGTRl、V麗C1)的基因突變r(jià)sl801252、rsl801253、rs5186、rs9934438和rs7294,確定患者對(duì)相關(guān)藥的敏感性。較為優(yōu)選的實(shí)施方案為，以SEQIDNO.1-34所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.36-69所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDN0.70-103所示的序列作為制備芯片所需的長(zhǎng)探針序列，這樣組成的芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可用于檢測(cè)上述各藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物作用靶點(diǎn)的常見基因突變，確定患者對(duì)相關(guān)藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝清除情況以及機(jī)體對(duì)藥物的敏感性。本發(fā)明的基因芯片可以根據(jù)點(diǎn)樣區(qū)域的數(shù)目分為l人份、2人份和多人份不等，本發(fā)明根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的需要優(yōu)選2人份的設(shè)計(jì)方案，即在基片上設(shè)置2個(gè)點(diǎn)樣區(qū)域，分別點(diǎn)上所需的探針，一次可檢測(cè)2份生物樣品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括1、可以全面、系統(tǒng)、高通量地檢測(cè)基因突變，與PCR—RFLP和測(cè)序法相比較，本發(fā)明環(huán)境污染輕，操作簡(jiǎn)單快捷。2、與常用的SSOP芯片相比較，本發(fā)明通過等位基因特異性擴(kuò)增和設(shè)置兩對(duì)等位基因特異性探針(短探針和長(zhǎng)探針)，極大的提高了探針雜交的特異性，可以克服SSOP芯片檢測(cè)中不可避免的非特異性雜交現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)野生型探針與突變型探針檢測(cè)的"全或無(wú)"，極大地提高了芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。3、另外，本發(fā)明沒有在每個(gè)等位基因特異性引物上設(shè)置標(biāo)記，而是將標(biāo)記統(tǒng)一設(shè)置在特異性擴(kuò)增輔助引物上，一次標(biāo)記就可以滿足各種等位基因特異性擴(kuò)增的需要，減少了芯片檢測(cè)的成本。圖1為實(shí)施例1雙探針基因突變檢測(cè)芯片平面圖2為實(shí)施例2芯片掃描圖3為實(shí)施例3常規(guī)SSOP芯片掃描圖4為實(shí)施例3雙探針基因檢測(cè)芯片掃描圖5實(shí)施例4芯片A掃描圖6實(shí)施例4芯片B掃描圖；圖7:實(shí)施例5芯片C掃描圖；圖8:實(shí)施例5芯片D掃描圖；圖9:實(shí)施例5芯片E掃描圖；圖10:專利技術(shù)路線圖ll:基因突變芯片檢測(cè)系統(tǒng)的制備流程圖。具體實(shí)施例方式下面，結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針基因突變芯片檢測(cè)系統(tǒng)的制備。本實(shí)施例中的探針和引物的設(shè)計(jì)與合成、芯片制備等均是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟練掌握的技能，詳細(xì)操作步驟可參閱《分子克隆試驗(yàn)指南》(([美]J.薩姆布魯克著，科學(xué)出版社)1、制備流程見附圖11。2、制備所需的主要原輔材料及儀器設(shè)備表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.1芯片檢測(cè)位點(diǎn)的選取選取表1中的rsl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rs776746、rsl065852、rsl142345、rs671、rsl045642、rs2231142、rs2282143、rs4149056、rs腿252、rs醒253、rs5186、rs9934438和rs7294這17種基因突變作為本實(shí)施例的目標(biāo)檢測(cè)位點(diǎn)。3.2寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)表3的SEQIDNO.36-69所示的序列，結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選取包括基因突變位點(diǎn)(方框內(nèi)的堿基)在內(nèi)的連續(xù)19個(gè)堿基(基因突變位點(diǎn)位于中間，前后各9個(gè)堿基)組成本實(shí)施例的等位基因特異性短探針。如根據(jù)SEQIDNO.39所示的序列AGGAAGAGATTGAACGTGTCglTGGCAGAAACCGGAGCCCC，取包括基因突變位點(diǎn)(方框內(nèi)的堿基G)在內(nèi)的連續(xù)19個(gè)堿基組成rs3758581的等位基因特異性短探針GAACGTGTC§TTGGCAGAA。本實(shí)施例的等位基因特異性長(zhǎng)探針序列如序列SEQIDN0.70-103所示。上述等位基因特異性短探針和長(zhǎng)探針在確定序列構(gòu)成后委托上海Invitrogen公司合成。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>第一步處理基片——選用76mmX25咖Xlmm超平片，將超平片浸于新配的重鉻酸鉀洗液中，放置7天后，用去離子水清洗，晾干；配制氨基硅烷的乙醇溶液，濃度分別為2%，將玻片浸入上述溶液中分別作用15分鐘，取出用去離子水洗凈，晾干；將上述氨基化處理的超平片分別浸入5%的戊二醛PBS(0.2mol/lM，p朋.O)溶液中，分別作用30分鐘，PBS溶液清洗晾干。第二步設(shè)置點(diǎn)樣區(qū)域一一按圖(1)所示的基因芯片平面結(jié)構(gòu)圖，在一塊玻璃介質(zhì)的基片上劃分為兩個(gè)基因探針點(diǎn)樣區(qū)域，每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)域的面積為10mm*12mm，在每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)如表4所示呈陣列式分布以下基因探針，其中SP-W、LP-W、SP-M、LP-M分別代表每個(gè)基因突變位點(diǎn)的野生型等位基因短探針、野生型等位基因長(zhǎng)探針、突變型等位基因短探針、突變型等位基因長(zhǎng)探針。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>第三步點(diǎn)樣與點(diǎn)樣后處理^針溶液各取2ul，用點(diǎn)樣儀按上述格式打印到處理過的基片上；室溫干燥放置18小時(shí)；干燥后立即使用或貯存于4r備用。3.4引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)表2中SEQIDNO.1-34所示的序列，結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選取每個(gè)位點(diǎn)的innerP-W和innerP-M兩個(gè)序列的3'端連續(xù)17個(gè)堿基(包括3'端的野生型或突變型堿基在內(nèi))作為該位點(diǎn)野生型等位基因內(nèi)引物和突變型等位基因內(nèi)引物的序列，為提高等位基因特異性擴(kuò)增的特異性，在每個(gè)序列的3'端倒數(shù)第3個(gè)堿基處引入一個(gè)人工錯(cuò)配的堿基。如根據(jù)SEQIDN0.4所示的序列5，-CTGCATGCAGGGGCTCCGGTTTCTGCCAAG-3，，取包括3'突變型堿基C在內(nèi)的連續(xù)17個(gè)堿基組成rs3758581的突變型等位基因內(nèi)引物(innerP-M)5，-CTCCGGTTTCTGCCAAg-3，。相應(yīng)的野生型等位基因外引物和突變型等位基因外引物利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的設(shè)計(jì)方法確定其序列。特異性擴(kuò)增輔助引物的序列如SEQIDN0:35所示。上述確定了序列的引物委托上海Invitrogen公司合成，所有等位基因特異性內(nèi)引物的5'端均連接上了與特異性擴(kuò)增輔助引物完全相同的一段GC序列，特異性擴(kuò)增輔助引物的5'端用熒光分子Cy5進(jìn)行標(biāo)記。3.5基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針基因突變芯片檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)成。檢測(cè)系統(tǒng)主要由寡核苷酸芯片、雜交液、洗滌母液、各檢測(cè)基因位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液(包括引物、dNTP、buffer等)、沒有3'-5，端外切酶活性的DNA聚合酶和陽(yáng)性參照DNA標(biāo)本等組分構(gòu)成，寡核苷酸芯片fC冷藏保存，其他組分于-2(TC冷凍保存，其中PCR反應(yīng)液需避光。實(shí)施例2用實(shí)施例1的芯片檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)已知基因型的臨床樣本的相關(guān)基因突變。1、臨床樣本的處理采集某已知基因型(用金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法確定)的待檢測(cè)個(gè)體的外周靜脈血2ml，使用PromegaDNA抽提試劑盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提試劑進(jìn)行抽提，兩種方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。DNA濃度應(yīng)大200ng/ul,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值，此比值應(yīng)介于1.601.80之間。經(jīng)測(cè)序檢測(cè)，該樣本的17個(gè)藥物相關(guān)基因突變的基因型為rsl057910-WW、rs3758581-WW、rsl7878459-麗、rs4986893-WW、rs776746-應(yīng)、rsl065852-麗、rsl142345-麗、rs671-麗、rsl045642-■、rs2231142-WW、rs2282143-麗、rs4149056-Wff、rsl801252-醒、rsl801253-WW、rs5186-WM、rs9934438-麗、rs7294-WW(WW代表野生純合子，1VM代表突變雜合子，MM代表突變純合子)。2、PCR擴(kuò)增針對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系為模板DNA50ng;野生型等位基因外引物0.4拜ol/L;突變型等位基因外引物O.^mol/L;野生型等位基因內(nèi)引物O.7pol/L;突變型等位基因內(nèi)引物0.7pmol/L;特異性擴(kuò)增輔助引物O.7pmol/L;HotstarTaqDNA聚合酶O.375U，2.5mmol/L的dNTP混合物1.2ul;IO倍濃度的PCRBufer1.5ul;滅菌蒸餾水(使最終體積為20ul)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性6min，熱循環(huán)40次(95。C，30S;56°C，30s;72°C，40s)，72。C延伸10min，4"C保存。本實(shí)施例共擴(kuò)增對(duì)應(yīng)17個(gè)基因檢測(cè)位點(diǎn)的17管PCR產(chǎn)物。用PCR方法擴(kuò)增染色體基因特定片段的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，其中的關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)，利用本發(fā)明公布的引物序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或有關(guān)文獻(xiàn)確定反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，獨(dú)立完成該操作步驟。3、芯片雜交取經(jīng)43。C預(yù)熱的雜交液7.5uL，加入15管PCR產(chǎn)物各3iiL，混勾，全部吸取混合液轉(zhuǎn)移到芯片的點(diǎn)樣區(qū)域；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進(jìn)43'C水浴保溫2小時(shí)。本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員依照經(jīng)驗(yàn)可以確定有關(guān)緩沖液、樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時(shí)間等的最適條件。4、洗片打開雜交艙，取出芯片，用洗滌液漂洗30秒，再置于去離子水中于室溫洗滌30秒，取出，在離心機(jī)上瞬時(shí)離心30秒，甩去芯片上殘留液體。5、掃描將干燥后的芯片立即用GenePix4100A掃描儀掃描,PMT設(shè)置為600,激光波長(zhǎng)為635nm;掃描圖像用掃描儀自帶的圖像分析軟件GenePix6.0對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析,并保存分析結(jié)果。通過芯片掃描儀得到的掃描圖譜為一矩陣圖譜，探針分布如表4所示，當(dāng)某一位點(diǎn)的野生型短探針和長(zhǎng)探針同時(shí)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)該位點(diǎn)為野生型，當(dāng)該位點(diǎn)的突變型短探針和長(zhǎng)探針同時(shí)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)該位點(diǎn)為突變型，當(dāng)四個(gè)探針同時(shí)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)為雜合子。圖像分析軟件的定量分析結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>芯片掃描結(jié)果見圖(2)6、分析確定基因型利用與芯片檢測(cè)系統(tǒng)配套的結(jié)果分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析與整理，由上述雜交圖掃描結(jié)果可確定各位點(diǎn)的基因型如下:rsl057910-WW、rs3758581-W、rsl7878459-麗、rs4986893-WW、rs776746-醒、rsl065852-麗、rsll42345_WW、rs671-WM、rsl045642-WM、rs2231142-麗、rs2282143—麗、rs4149056-WW、rsl801252-醒、rsl801253-麗、rs5186_WM、rs9934438-W沐、rs7294-WW。與測(cè)序結(jié)果相對(duì)照，所有位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果均準(zhǔn)確無(wú)誤。實(shí)施例3本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)與常規(guī)SSOP基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的比較。按實(shí)施例l所述的方法制備用于檢測(cè)rsl057910(CYP2C9*3)、rs4986893(CYP2C19*3)和rsl065852(CYP2D6*10)的雙探針基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，探針排布陣列為<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>按發(fā)明者瑋冀,周宏灝申請(qǐng)人:中南大學(xué)