專利名稱：用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因分析檢測產(chǎn)品，具體地說是涉及一種基因檢測芯片及其配套的試劑，更具體地說是用于檢測與惡性腫瘤治療藥物反應(yīng)性密切相關(guān)的一系列基因突變的基因檢測芯片和配套的試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
惡性腫瘤作為困擾人類身心健康的重大疾病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題據(jù)世界衛(wèi)生組織2007年度報道，2006年全球因癌癥死亡的有630萬人，約占總死亡人數(shù)的12％，是僅次于心血管疾病的第2大死因。從1996年以來全球每年新確診的腫瘤患者均在1030萬以上，到1999年底全球腫瘤患者總數(shù)已逾4000萬人。世界衛(wèi)生組織2001年報道，世界癌癥發(fā)病率和死亡率比1990年上升了22％，今后20年還將上升大約50％。2005年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計資料表明我國每年新生腫瘤患者總數(shù)約212.7萬人左右，其中，每年有106萬左右的惡性腫瘤新生患者；同時，全國約有268.5萬左右的腫瘤現(xiàn)有患者，其中，惡性腫瘤現(xiàn)有患者約148.5萬左右。
抗腫瘤藥物是當前和今后相當長的時間內(nèi)用于治療惡性腫瘤及其并發(fā)癥的重要手段。抗腫瘤藥主要指直接殺滅腫瘤細胞而起作用的藥物，大多數(shù)抗腫瘤藥物的作用機制主要是阻止脫氧核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白質(zhì)的合成，或直接對這些大分子發(fā)生作用，從而抑制腫瘤細胞的分裂增殖，使之死亡，有些藥物也可以通過改變體內(nèi)激素平衡而抑制腫瘤生長。這些藥物在使用過程中的一個突出問題是藥物反應(yīng)(包括療效和不良反應(yīng))的個體差異，接受藥物治療的患者中有相當一部分病情未得到良好控制，另有相當數(shù)量的患者由于不能耐受抗腫瘤藥物的強烈毒副反應(yīng)而放棄治療，有的甚至死于強烈的毒副反應(yīng)。因此根據(jù)藥物反應(yīng)的個體差異針對每個癌癥患者的具體情況選擇合適種類和劑量的抗腫瘤藥物，在提高藥物有效性的同時最大限度地減少藥物毒副反應(yīng)的發(fā)生，成為未來醫(yī)學的發(fā)展趨勢。
藥物反應(yīng)的個體差異是臨床上極其普遍的現(xiàn)象，產(chǎn)生這種差異的原因有許多，包括性別、年齡、體重、疾病狀況在內(nèi)的多種因素都可以導致不同病人對同一種藥物的反應(yīng)出現(xiàn)量與質(zhì)的差別，然而20多年來的遺傳藥理學研究結(jié)果表明其中最重要、最根本的因素是遺傳因素，即藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運體和受體(藥物作用靶點)的基因多態(tài)性導致了其編碼蛋白的功能改變，進一步使血藥濃度和藥物敏感性顯著不同，一言以蔽之，遺傳變異導致了藥物反應(yīng)個體差異。
經(jīng)過長期研究，目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多個基因突變與相應(yīng)抗腫瘤藥物的反應(yīng)性(療效和毒副反應(yīng))密切相關(guān)，其中主要包括下列內(nèi)容(表1)

以上所述的基因突變均與抗腫瘤藥物在人體內(nèi)的反應(yīng)性密切相關(guān)，這里所說的反應(yīng)性包括了藥物的療效和安全性兩個方面，同種同劑量的藥物作用于擁有不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本無效，還有的人會出現(xiàn)藥物的毒副反應(yīng)，因此利用各種基因檢測技術(shù)在治療之前先確定腫瘤以及病人的上述基因突變位點的基因型，根據(jù)檢測的結(jié)果調(diào)整患者的用藥種類與劑量，指導和優(yōu)化腫瘤的化療方案，可以使藥物發(fā)揮最佳的療效，最大限度地防止毒副反應(yīng)發(fā)生，這就是基因?qū)蛐缘膫€體化用藥新模式。目前該種用藥模式已被越來越多的科研人員、臨床醫(yī)生及患者所接受，2006年在我國舉行的第15屆“國際遺傳藥理學大會”(IUPHAR會議)上，來自27個國家的數(shù)百名代表共同探討了基因?qū)騻€體化用藥的發(fā)展現(xiàn)狀和在各國的推廣情況，預(yù)測了全面“個體化用藥”時代的到來。
目前國內(nèi)外已有實驗室或醫(yī)療機構(gòu)開展了對CYP2D6和TPMT等與抗腫瘤藥物反應(yīng)性密切相關(guān)的基因位點的檢測工作，最常用的檢測方法有聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP法)、序列特異性PCR、手工或自動測序等方法，這些方法不僅操作繁瑣、檢測周期長、無法做到高通量，而且影響檢測結(jié)果的因素眾多，不易控制，難以滿足臨床實際檢測的要求，目前只在科研領(lǐng)域進行。
基因芯片(gene chip)，又稱DNA芯片，是近些年在生物高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進展之一，它將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產(chǎn)物等)有序地固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜)上形成陣列，通過與實際樣本或擴增產(chǎn)物進行雜交反應(yīng)和對熒光等雜交信號的檢測，只需一次試驗，就可高通量地獲得所有待檢基因的信息。與其他方法相比較，基因芯片的檢測方法有多樣品并行處理能力、分析速度快、所需樣品量少、污染少、操作簡單、價格低廉等優(yōu)點。因此利用基因芯片技術(shù)檢測與高血壓藥物反應(yīng)個體差異密切相關(guān)的基因突變，是當下最好的選擇，具有重要的現(xiàn)實意義。
目前尚未有對上述抗腫瘤藥物反應(yīng)相關(guān)基因突變位點進行檢測的基因芯片及其技術(shù)方案被披露。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前惡性腫瘤化療藥物使用過程中普遍存在由于藥物反應(yīng)個體差異所導致的藥物有效性低、毒副反應(yīng)嚴重的現(xiàn)象，提供一種用于檢測與這些藥物的反應(yīng)性密切相關(guān)的基因突變的基因芯片，本發(fā)明的另一目的在于提供一種可方便、快捷、系統(tǒng)地檢測上述基因突變，確定藥物反應(yīng)性的檢測試劑。本發(fā)明的檢測結(jié)果可以輔助臨床醫(yī)生制定個體化的惡性腫瘤化療方案。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的寡核苷酸探針。
所述的固相支持物可采用基因芯片領(lǐng)域常用的各種材料，如但不限于經(jīng)活性基團修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片、各種纖維膜、尼龍膜等，用于修飾的活性基團如但不限于醛基、氨基、巰基、羧基等，本發(fā)明優(yōu)選醛基化修飾的玻片。
所述固定于固相支持物上的寡核苷酸探針可與抗腫瘤藥物治療反應(yīng)相關(guān)基因片段特異性雜交，從而確定基因突變的類型；所述基因探針和PCR引物均是針對下列任意兩個或多個基因突變位點設(shè)計GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
優(yōu)選的方案是所述基因探針和PCR引物均是針對下列突變位點或位點組合設(shè)計的GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)和EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)的組合；EGFR L858R和EGFR L861Q的組合；EGFR缺失突變(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的組合。
更優(yōu)選的方案是所述基因探針和PCR引物均是針對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q這11個突變位點的組合設(shè)計。
本發(fā)明所述的寡核苷酸探針序列如表3所示。
表3



表3中，每一突變位點針對未發(fā)生突變(野生型)和發(fā)生突變(突變型)兩種情況各設(shè)計了正反兩條用于合成探針的序列，正向探針序列對應(yīng)于目標寡核苷酸片段的正義鏈，反向探針序列對應(yīng)于目標寡核苷酸片段的反義鏈，在實際使用時可選擇上述序列中的任意連續(xù)14～25個堿基作為檢測探針的序列，如果序列中包含基因突變位點(用方框標注)，則選擇的連續(xù)14～25個堿基中必須包含該突變位點。針對每個待檢測的基因突變，實驗人員需根據(jù)表3的序列合成至少一條野生型探針和一條突變型探針，正向或反向均可。上述某一個或某幾個或全部的突變位點的檢測探針組成探針組，經(jīng)合成后固定于固相支持物上。
在上述設(shè)計的各探針序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域熟知的方法進行探針合成，并對探針3′端或5′端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來增加雜交容量；以及對其3′端或5′端進行化學基團修飾(比如氨基化修飾)，使探針能通過化學鍵結(jié)合在相應(yīng)的片基上(如醛基化片基)；優(yōu)選對探針的3′端進行氨基修飾，其相較5′端修飾的探針具有更好的雜交效果。
在上述設(shè)計的探針序列的基礎(chǔ)上，為了獲得各個位點準確的雜交信號，必需針對每個位點合成的探針來分別設(shè)計相應(yīng)的陰性質(zhì)控探針以及陽性質(zhì)控探針，來控制雜交過程中非特異雜交對信號值的干擾以及雜交過程的評估，本發(fā)明涉及的惡性腫瘤藥物治療相關(guān)基因(見表4)的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針序列如下 表4


表4中，針對每一突變位點設(shè)計了正反兩條用于合成陰性質(zhì)控探針的序列，正向序列對應(yīng)于目標寡核苷酸片段的正義鏈，反向序列對應(yīng)于目標寡核苷酸片段的反義鏈，在實際使用時可選擇上述序列中的任意連續(xù)14～25個堿基作為檢測探針的序列，如果序列中包含基因突變位點(用方框標注)，則選擇的連續(xù)14～25個堿基中必須包含該突變位點。
根據(jù)表4序列合成的陰性質(zhì)控探針應(yīng)當與根據(jù)表3序列合成的檢測探針在序列和方向的選擇上保持一致。例如當根據(jù)表3序列設(shè)計合成UGT1A1*6的野生型檢測探針為5’-gtacatcagagac

gagcatt-3’(正向探針)，突變型檢測探針為5’-gtacatcagagac

gagcatt-3’(正向探針)時，根據(jù)表4序列設(shè)計合成UGT1A1*6的陰性質(zhì)控探針為5’-gtacatcagagac

gagcatt-3’(正向探針)；當根據(jù)表3序列設(shè)計合成UGT1A1*6的野生型檢測探針為5’-gtacatcagagac

gagcatt-3’(正向探針)，突變型檢測探針為5’-gtgtaaaatgctc

gtct-3’(反向探針)時，根據(jù)表4序列設(shè)計合成的UGT1A1*6的陰性質(zhì)控探針為兩條，分別為5’-gtacatcagagac

gagcatt-3’(正向探針)和5’-gtgtaaaatgctc

gtct-3’(反向探針)。本發(fā)明優(yōu)選根據(jù)表3和表4的序列設(shè)計同向的野生型檢測探針、突變型檢測探針和陰性質(zhì)控探針。
本發(fā)明的各基因檢測位點共用一條陽性質(zhì)控探針，該陽性質(zhì)控探針根據(jù)表4中SEQ IDNO.71設(shè)計。
在上述設(shè)計的各探針序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域熟知的方法進行探針合成，并對探針3′端或5′端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來增加雜交容量；以及對其3′端或5′端進行化學基團修飾(比如氨基化修飾)，使探針能的通過化學鍵結(jié)合在相應(yīng)的片基上(如醛基化片基)；優(yōu)選對探針的3′端進行氨基修飾，其相較5′端修飾的探針具有更好的雜交效果。
本發(fā)明所涉及的野生型檢測探針、突變型檢測探針、陰性質(zhì)控探針、陽性質(zhì)控探針的用途及其設(shè)計方法和修飾方法均是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知的，詳細技術(shù)細節(jié)可參閱《基因芯片技術(shù)》(李瑤編，化學工業(yè)出版社，2004年5月出版)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于檢測樣本中上述基因突變發(fā)生情況的檢測試劑至少包括用于擴增樣本中這些基因的PCR引物以及上述本發(fā)明的基因芯片。本發(fā)明的PCR引物根據(jù)抗腫瘤藥物治療相關(guān)基因的序列特點設(shè)計，通過PCR反應(yīng)可擴增一種或幾種突變基因。在本發(fā)明中，設(shè)計了如下序列用于合成這些PCR引物(表5)。
表5

表5中針對每個待檢測的基因突變設(shè)計了F和R兩條序列，在實際使用時，可選擇F序列和R序列上的任意連續(xù)17～25個堿基作為該基因突變位點的F引物(前引物)和R引物(后引物)的序列。在上述設(shè)計的各引物序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域熟知的方法進行引物合成。為便于進行結(jié)果檢測，可以在上述引物合成時進行適當?shù)臉擞?，所述標記基團包括地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等，這些標記及其標記方法以及各標記物的檢測方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明優(yōu)選利用不對稱PCR技術(shù)進行基因擴增，其目的是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA，所有探針(包括檢測探針和陰性質(zhì)控探針)均是針對該單鏈DNA設(shè)計合成，同時對非限制性引物(高濃度引物)進行標記，本發(fā)明優(yōu)選對對非限制性引物(高濃度引物)進行5′端的Cy5標記，使得合成的單鏈PCR產(chǎn)物的5′端帶有熒光標記，以便在后繼的掃描過程中讀取結(jié)果。
本發(fā)明的探針和引物可以針對一個基因突變進行檢測，也可以組合使用檢測多個基因突變。例如以SEQ ID NO.9-16所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.76-79所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于檢測與抗癌藥依立替康的反應(yīng)性密切相關(guān)的UGT1A1*6和UGT1A1*28兩種基因突變，確定患者對依立替康的個體反應(yīng)性；以SEQ ID NO.25-48所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.84-89所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于檢測與吉非替尼和埃羅替尼的藥物反應(yīng)性密切相關(guān)的EGFR缺失突變、EGFR L858R和EGFR L861Q三種基因突變，確定患者對吉非替尼和埃羅替尼的個體反應(yīng)性；較為優(yōu)選的實施方案為，以SEQ ID NO.1-48所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.72-89所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于檢測與多種抗腫瘤藥物反應(yīng)性密切相關(guān)的基因突變，確定患者對大部分常用化療藥物的個體反應(yīng)性。
本發(fā)明的基因芯片可以根據(jù)點樣區(qū)域的數(shù)目分為1人份、2人份和多人份不等，本發(fā)明根據(jù)實際應(yīng)用的需要優(yōu)選2人份的設(shè)計方案，即在基片上設(shè)置2個點樣區(qū)域，分別點上所需的探針，一次可檢測2份生物樣品。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于系統(tǒng)檢測樣本中抗腫瘤藥物治療相關(guān)基因突變的試劑盒，其至少包括本發(fā)明的上述檢測試劑，本發(fā)明的試劑盒還可進一步包含下述試劑中的一種或幾種樣本處理類試劑；(2)PCR擴增類試劑(3)雜交類試劑(4)顯色類試劑。
上述樣本處理類試劑、PCR擴增類試劑、雜交類試劑、顯色類試劑均可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種具體試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的提示自行配制。
本發(fā)明的試劑盒還可包括相應(yīng)的陰性對照和/或陽性對照樣本。
在本發(fā)明試劑盒的操作方法為1.將標記后的待測產(chǎn)物與固定在芯片上的探針進行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交條件與探針和標記后的待測PCR產(chǎn)物的長度、GC含量、鹽濃度、甲酰胺等有關(guān)，我們通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計逐一確定最適合的各組分條件。優(yōu)選的是在本發(fā)明的試劑盒體系中43℃孵育2小時后可獲得具有良好特異性和靈敏度的雜交結(jié)果。2.利用不同的洗脫條件，例如溫度、鹽濃度等最大限度地去除非特異性雜交。3.對樣本檢測結(jié)果進行評估通過樣本中惡性腫瘤藥物治療相關(guān)基因的突變發(fā)生情況評估樣本提供者對抗腫瘤藥物的反應(yīng)性。詳細操作過程見實施例。
本發(fā)明的優(yōu)點是 1.本發(fā)明全面、系統(tǒng)、高通量地檢測已知的與抗腫瘤藥物反應(yīng)個體差異密切相關(guān)的基因突變，并可針對不同藥物制定出相應(yīng)的調(diào)整方案。
2.準確、靈敏、特異性地對上述基因突變進行檢測。
3.操作簡便快捷，對樣品的需要量少，人力投入少，大大降低人為誤差，可避免不同實驗人員操作帶來的結(jié)果差異。
5.與PCR-RFLP和測序法相比較，本發(fā)明污染輕、成本較低。
6.可同時檢測多份生物樣本，多個基因突變。



圖1惡性腫瘤藥物治療相關(guān)基因檢測芯片平面圖； 圖2芯片A(野生型探針I(yè)+突變型探針I(yè))掃描圖； 圖3芯片B(野生型探針I(yè)I+突變型探針I(yè)I)掃描圖； 圖4芯片C(野生型探針I(yè)II+突變型探針I(yè)II)掃描圖； 圖5惡性腫瘤藥物治療相關(guān)基因檢測芯片掃描圖； 圖6惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的制備流程圖。

具體實施例方式 實施例1惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的制備 1.制備用的主要原輔材料及儀器設(shè)備(如表5所示) 表5 2.制備流程 見附圖6。
3.詳細制備過程 3.1.基片處理基片采用玻璃介質(zhì)，表面處理方式采用醛基化修飾。具體步驟為 1、空白超平片的選擇選用76mm×25mm×1mm超平片，其長寬誤差不超過0.2mm，厚度誤差不超過0.1mm，無破損、表面無劃痕； 2、超平片預(yù)處理將超平片浸于新配的重鉻酸鉀洗液中，放置7天后，用去離子水清洗，晾干； 3、超平片氨基化配制氨基硅烷的乙醇溶液，濃度分別為2％，將玻片浸入上述溶液中分別作用15分鐘，取出用去離子水洗凈，晾干； 4、超平片醛基化將上述氨基化處理的超平片分別浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/lM，pH8.0)溶液中，分別作用30分鐘，PBS溶液清洗晾干； 3.2.探針制備探針序列設(shè)計如SEQ ID 1～48所示，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法合成。
(1)在DNA合成儀上合成所需序列的寡核苷酸(包括5’端的10～15個堿基的polyT)； (2)在DNA序列合成儀上，將寡核苷酸poly(T)分子臂引入活潑的脂族氨基臂。
(3)以HPLC純化5’端氨基修飾的寡核苷酸，離心干燥后，溶于100mmol/LNa2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，濃度為2mmol/L。
3.3.基因芯片的制備 按圖所示的惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因檢測芯片平面結(jié)構(gòu)圖，在一塊玻璃介質(zhì)的基片上劃分為兩個基因探針點樣區(qū)域，每個點樣區(qū)域的面積為7mm*7mm，在每個點樣區(qū)域內(nèi)的陣列式分布的基因探針第1行為位點GSTP1*B的野生型和突變型探針，第2行為位點GSTP1*B的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第3行為位點MTHFR 677C＞T的野生型和突變型探針，第4行為位點MTHFR 677C＞T的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第5行為位點UGT1A1*6的野生型和突變型探針，第6行為位點UGT1A1*6的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第7行為位點UGT1A1*28的野生型和突變型探針，第8行為位點UGT1A1*28的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第9行為位點CAD*3的野生型和突變型探針，第10行為位點CAD*3的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第11行為位點TPMT*3C的野生型和突變型探針，第12行為位點TPMT*3C的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第13行為針對EGFR缺失突變的野生型和Del_L747-P753ins S突變型探針，第14行為針對EGFR缺失突變的Del_L747-T751 ins S突變型和Del_E746-A750 ins S突變型探針，第15行為針對EGFR缺失突變的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第16行為位點EGFR L858R的野生型和突變型探針，第17行為位點EGFR L858R的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針；第18行為位點EGFR L861Q的野生型和突變型探針，第19行為位點EGFR L861Q的陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針。
各檢測位點的探針(包括野生型探針和突變型探針)序列及參照探針(包括陽性參照探針和陰性參照探針)序列如下


3.4.點樣與點樣后處理 (1)探針溶液各取2μl，用點樣儀按上述格式打印到處理過的基片上； (2)室溫干燥放置18小時； (3)室溫干燥后立即使用或貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 3.5.惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的組成 檢測系統(tǒng)主要由寡核苷酸芯片、雜交液、洗滌母液、各檢測基因位點的PCR反應(yīng)液(包括引物、dNTP、buffer等)、生物酶和陽性參照DNA標本等組分構(gòu)成，寡核苷酸芯片4℃冷藏保存，其他組分于-20℃冷凍保存，其中PCR反應(yīng)液需避光。各檢測基因位點PCR反應(yīng)液中的引物根據(jù)SEQ ID NO.72-89所示的序列設(shè)計。
實施例2用實施例1中的芯片檢測系統(tǒng)對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變、EGFR L858R、EGFR L861Q九種惡性腫瘤藥物治療相關(guān)基因突變進行檢測。
1.具體試劑和所用儀器 芯片檢測系統(tǒng)的組成(表6)

PCR反應(yīng)液1～9為實施例1中分別按照SEQ ID NO.72～73、SEQ ID NO.74～75、SEQID NO.76～77、SEQ ID NO.78～79、SEQ ID NO.80～81、SEQ ID NO.82～83、SEQ IDNO.84～85、SEQ ID NO.86～87、SEQ ID NO.88～89序列設(shè)計的PCR引物。
其他儀器及試劑
PCR儀、電泳儀、雜交儀、激光共聚焦芯片掃描儀(具有635nm波長的通道)、紫外分光光度計、Promega DNA抽提試劑盒。
2.具體檢測過程如下 臨床樣本的處理
采集待檢測個體的外周靜脈血2ml，使用Promega DNA抽提試劑盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提試劑進行抽提，兩種方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。DNA濃度應(yīng)大于200ng/ul，用紫外分光光度計檢測A260/A280比值，此比值應(yīng)介于1.60～1.80之間。
PCR擴增
在0.2mL的Eppendorf管中加入PCR反應(yīng)液18.8μl，模板DNA 0.8μl，及酶10.2μl，酶20.2ul，構(gòu)成20.0μl反應(yīng)體系(利用PCR反應(yīng)液1～9共配成A、B、C、D、E、F、G、H、I共9管反應(yīng)體系)。PCR擴增程序為 37℃600秒 95℃240秒
70℃120秒 注意上述成分充分混勻，最后加入Taq酶并混勻，但不可劇烈振蕩；放置PCR管于PCR儀上。
用PCR方法擴增染色體基因特定片段的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，其中的關(guān)鍵在于引物設(shè)計，利用本發(fā)明公布的引物序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗或有關(guān)文獻確定反應(yīng)體系和擴增程序，獨立完成該操作步驟。
雜交
取經(jīng)43℃預(yù)熱的雜交液7.5μl，加(A)(B)(C)(D)(E)(F)(G)(H)(I)PCR產(chǎn)物各3μl，然后加入陽參1μl，混勻，吸取20μl混合液，轉(zhuǎn)移到芯片的點樣區(qū)域；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進43℃水浴保溫2小時。
本發(fā)明擴增產(chǎn)物與基因芯片之間的雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進行，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員依照經(jīng)驗可以確定有關(guān)緩沖液、樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。
洗片
打開雜交艙，取出芯片，用洗滌液1漂洗30秒，再置于去離子水中于室溫洗滌30秒，取出，在離心機上瞬時離心30秒，甩去芯片上殘留液體。
掃描分析
(1)將干燥后的芯片立即用GenePix4100A掃描儀掃描，PMT設(shè)置為600，激光波長為635nm； (2)掃描圖像用掃描儀自帶的圖像分析軟件GenePix 6.0對掃描結(jié)果進行定量分析，并保存分析結(jié)果； (3)利用與芯片檢測系統(tǒng)配套的結(jié)果分析軟件進行結(jié)果分析與整理。
(4)打印檢測報告單。
3.對檢測結(jié)果的分析過程如下 通過芯片掃描儀得到的掃描圖譜為一矩陣圖譜，自第1行至第19行，由上至下即檢測GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變、EGFR L858R、EGFR L861Q位點的基因型。探針分布情況如下表(表8)所示 對標本進行檢測，當某一位點只有野生型探針出現(xiàn)信號時該位點為野生型，只有突變型探針出現(xiàn)信號時該位點為突變型，當同時出現(xiàn)信號時為雜合子。
根據(jù)檢測出的基因型，參照表1的內(nèi)容提出用藥調(diào)整意見。
實施例3不同堿基數(shù)的探針雜交效果比較 在本發(fā)明中，對于SEQ ID NO.1-48中所示序列的探針實際使用時可以選擇連續(xù)14-25個堿基序列來合成探針，以下實驗旨在證明上述堿基數(shù)的差異并不影響結(jié)果的靈敏度和特異性。
針對GSTP1*B合成以下不同長度的突變及正常探針 野生型探針I(yè)(SEQ ID NO.1第13～26位堿基序列，共14個堿基) 5’-gggaga

gtatttg-3’ 突變型探針I(yè)(SEQ IDNO.3第13～26位堿基序列，共14個堿基) 5’-gggaga

gtatttg-3’ 野生型探針I(yè)I(SEQ ID NO.1第12～30位堿基序列，共19個堿基) 5’-tgagggaga

gtatttgca-3’ 突變型探針I(yè)I(SEQ IDNO.3第12～30位堿基序列，共19個堿基) 5’-tgagggaga

gtatttgca-3’ 野生型探針I(yè)II(SEQ ID NO.1第10～32位堿基序列，共23個堿基) 5’-gat gagggaga

gtatttgcagc-3’ 突變型探針I(yè)II(SEQ ID NO.3第10～32位堿基序列，共23個堿基) 5’-gatgagggaga

gtatttgcagc-3’ 以上述序列合成的探針按照實施例1的方法制備芯片A、B和C，按照實施例1的方法擴增CYP2C9*3野生型和突變型質(zhì)粒，分別與芯片A、B和C雜交，結(jié)果顯示見圖2、3、4。
由上圖可見，不同長度的探針均取得了較好的雜交結(jié)果，由此證明不同堿基數(shù)的探針均具有良好的靈敏度和特異性。
以上對本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和調(diào)整，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。實施例4陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針設(shè)計方案 在本發(fā)明中，對于SEQ ID NO.49-71中所示序列的探針實際使用時可以選擇連續(xù)14-25個堿基序列來合成各個位點的陰性質(zhì)控探針，選用SEQ ID NO.81作為陽性質(zhì)控探針。以下實驗旨在證明選用上述序列作為陰性質(zhì)控探針和陽性質(zhì)控探針可以確實起到控制雜交過程的作用。
針對GSTP1*B設(shè)計野生、突變以及陰性質(zhì)控探針，序列如下
將上述4個序列點制在同一芯片上，分別擴增GSTP1*B野生和突變的質(zhì)粒，將產(chǎn)物以及與陽性質(zhì)控探針互補的陽性參照和芯片進行雜交，雜交掃描圖如圖5所示。
從雜交掃描圖中我們可以看出，無論使用野生質(zhì)?；蛘咄蛔冑|(zhì)粒擴增產(chǎn)物，陰性質(zhì)控探針都沒有雜交信號，而陽性質(zhì)控探針信號穩(wěn)定而且特異的信號，說明本發(fā)明中的陰性質(zhì)控探針以及陽性質(zhì)控探針可以確實起到控制雜交過程的作用。
以上對本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和調(diào)整，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
序列表
<110>中南大學
<120>一種基于等位基因特異性擴增的雙探針基因突變檢測方法及其專用芯片和試劑盒
<160>151
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgctgtggt gcacgaggtc cagagataca30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atggggcagg ctggtgggga gaaggtcaag30
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<212>DNA
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<400>3
ctaaagtcca ggaagagatt gaacgtgtca30
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<212>DNA
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ctgcatgcag gggctccggt ttctgccaac30
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<212>DNA
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agtgggaaat ggcctcttcc agaaaactcg30
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agtgatgagt ggtgttcgca ggtgtgtgcc30
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tttgtgataa cagccaccga ggggactcca30
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atccacggag ctgatcccaa agttggtggc30
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cctcctacac tgatataaac tatatgaagg30
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tgtgtctagg ccttagttaa taatgaatga30
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tgctgacacg cctggcagag gaccctgccg30
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cctccgctgg cgggcacggt acctgggctt 30
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gagctgccca ggaatatcca ggcaagaatg 30
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agaggcctga gtaattatca gaatatggta 30
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gcgggcggcg c 11
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gctggtgggg agaaggtcaa tgtatctctg gacctcgtgc a41
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tgcacgaggt ccagagatac cttgaccttc tccccaccag c41
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ggggctccgg tttctgccaa tgacacgttc aatctcttcc t41
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aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc c41
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tggcctcttc cagaaaactc ctctccaaga tcaatcaggg c41
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gccctgattg atcttggaga cgagttttct ggaagaggcc a41
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aacttggcct tacctggatc cagggggtgc ttacaatcct g41
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caggattgta agcaccccctagatccaggt aaggccaagt t41
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gaagcatatt acccatgaac acatatatcc acatgtatga c41
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gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgctt c41
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acagccaccg aggggactcc ggcacacacc tgcgaacacc a41
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tggtgttcgc aggtgtgtgc tggagtcccc tcggtggctg t41
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aggtgcgctt cctcaggcgc ggcgtgcgga acaggtctgc a41
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tgcagacctg ttccgcacgc tgcgcctgag gaagcgcacc t41
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ccccgccaac aaatttgaca tggccatggg gtagatgcgg c41
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gccgcatcta ccccatggcc gtgtcaaatt tgttggcggg g41
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gaagaagaag ttgggcagag caactgtgaa ctgcaaccac c41
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ggtggttgca gttcacagtt tctctgccca acttcttctt c41
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cctgcaaatg ctagcagccc cgggaggtgc agggcccagt c 41
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gactgggccc tgcacctccc agggctgcta gcatttgcag g 41
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gctgatccca aagttggtgg gccagaatgg catctctgtg t 41
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acacagagat gccattctgg gccaccaact ttgggatcag c 41
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gtcgtggttt cctggtcatg accgggcaga gctaatagca g 41
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ctgctattag ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga c41
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gccttagtta ataatgaatg ccttcatata gtttatatca g41
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ctgatataaa ctatatgaag tcattcatta ttaactaagg c41
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gcgggcacgg tacctgggct cggcagggtc ctctgccagg c41
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cctattcctt agtagccaga gttacagtta agttccatat actataagag50
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<213>人工序列
<400>84
ctgtgatgaa agaggccaga aacattctta cctggatctc ctttctcacc50
<210>85
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
tgggaaaatt agaggagtgt catctgtgca atcactgaat tcataatctt50
<210>86
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
gaatcagaat atgaatgtac tgggaatagg gatgagggtg aagatgggaa50
<210>87
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
agagattaga caggggagga ggggcagcta aagatggctc aggcaaacaa50
<210>88
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca50
<210>89
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
gaagtgaagt gggacccagg tggaggtaag gaagagtctg gtggggagtt50
<210>90
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
tgggatgggc tgatgggttg aatgtggggt atgaaagaaa agagcaatcg50
<210>91
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
catttgatga ttgttttgtt aatggcttgc aggtcagatt ttcatctttt50
<210>92
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
aggtcaatgt atctctgg 18
<210>93
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
gagatacctt gaccttct 18
<210>94
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
ctgccaatga cacgttc 17
<210>95
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
acgtgtcgtt ggcagaa 17
<210>96
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
cagaaaactc ctctccaaga t21
<210>97
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
atcttggaga cgagttttct g21
<210>98
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
ttacctggat ccagggggtg c21
<210>99
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
caccccctag atc 13
<210>100
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
ccatgaacac ata 13
<210>101
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
tatatgcgtt catg 14
<210>102
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
gactccggca caca 14
<210>103
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
aggtgtgtgc tggagt16
<210>104
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>104
caggcgcggc gtgcgg16
<210>105
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
cgcacgctgc gcctga16
<210>106
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
atttgacatg gccatg16
<210>107
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>107
ccatggccgt gtcaaa16
<210>108
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
tgggcagagc aactg 15
<210>109
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
ttcacagttt ctctg 15
<210>110
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
gcagccccgg gag 13
<210>111
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>111
acctcccagg gct 13
<210>112
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>112
tggtgggcca gaatg15
<210>113
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>113
ttctgggcca ccaac15
<210>114
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>114
tggtcatgac cgggc15
<210>115
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>115
ctgcccgggc atgac 15
<210>116
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>116
taatgaatgc cttcat 16
<210>117
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>117
tatatgaagt cattca 16
<210>118
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>118
ctgggctcgg cagg 14
<210>119
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>119
ccctgccaag ccca 14
<210>120
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>120
aatatggtca ttcttgc17
<210>121
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>121
gcaagaatta ccatatt17
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>122
gcacgaggtc cagagattca 20
<210>123
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
caggctggtg gggagaaggt ctag24
<210>124
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>124
ccaggaagag attgaacgtg cca 23
<210>125
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
caggggctcc ggtttctgcc tac 23
<210>126
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
agccctgatt gatcttggac ag 22
<210>127
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
atggcctctt ccagaaaaca cg 22
<210>128
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>128
caggattgta agcaccccat g 21
<210>129
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
acttggcctt acctggacct 20
<210>130
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>130
tgggtcatac atgtggatat aagt24
<210>131
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>131
acgaagcata ttacccatga tcg 23
<210>132
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>132
tggtgttcgc aggtgtgtac c 21
<210>133
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>133
ataacagcca ccgaggggac ttca24
<210>134
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>134
atttgcagac ctgttccgca cacc24
<210>135
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
tgaaggtgcg cttcctcagg ctca24
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>136
tgggccgcat ctaccccatg gaca24
<210>137
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>137
tgcccccgcc aacaaatttg atac 24
<210>138
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>138
tggaggtggt tgcagttcac agatg25
<210>139
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>139
agaagaagaa gttgggcagt ga 22
<210>140
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>140
agactgggcc ctgcacctct cg 22
<210>141
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>141
taggcctgca aatgctagca gcact25
<210>142
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>142
ttgacacaga gatgccattc tcgc 24
<210>143
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>143
acggagctga tcccaaagtt ggttgc 26
<210>144
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>144
tctactgcta ttagctctgc ccagt 25
<210>145
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>145
ttgagtcgtg gtttcctggt cacgc 25
<210>146
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>146
actgatataa actatatgat gg 22
<210>147
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>147
taggccttag ttaataatga ttga24
<210>148
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>148
acgcctggca gaggaccctg acg 23
<210>149
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>149
tggcgggcac ggtacctggg ttt 23
<210>150
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>150
tgcccaggaa tatccaggca agactg26
<210>151
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>151
tgagtaatta tcagaatatg tta 2權(quán)利要求
1.一種用于檢測惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變的基因芯片，包括固相支持物、有序固定在固相支持物上的基因探針和用于擴增樣本中突變基因片段的PCR引物，基因探針包括檢測不同基因位點突變的野生型檢測探針、突變型檢測探針、陰性質(zhì)控探針及陽性質(zhì)控探針，其特征在于其中所述基因探針和PCR引物均是針對下列任意兩個或多個基因突變位點設(shè)計GSTP1*B、MTHFR677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變的基因芯片，其特征在于所述基因探針和PCR引物均是針對下列突變位點或位點組合設(shè)計的GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)和EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)的組合；EGFR L858R和EGFR L861Q的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變的基因芯片，其特征在于所述基因探針和PCR引物均是針對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q這11個突變位點的組合設(shè)計。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片，其特征在于所述檢測不同突變位點的寡核苷酸探針序列，包括正向野生型探針、正向突變型探針、反向野生型探針、反向突變型探針，由序列SEQ ID NO.1-48中的任意連續(xù)14～25個堿基組成，序列中包含基因突變位點時，選擇的連續(xù)14～25個堿基中必須包含該突變位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片，其特征在于所述檢測不同突變位點的陰性參照探針序列，包括正向陰性參照探針和反向陰性參照探針，由序列SEQ ID NO.49-70中的任意連續(xù)14～25個堿基組成，序列中包含基因突變位點時，選擇的連續(xù)14～25個堿基中必須包含該突變位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片，其特征在于，所述固定于固相支持物上的陽性質(zhì)控探針序列為SEQID NO.71。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片，其特征在于，所述用于擴增樣本中突變基因片段的PCR引物序列由序列SEQ ID NO.72-89中的任意連續(xù)17～25個堿基組成。
8.權(quán)利要求1至7之一所述的用于惡性腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測的基因芯片，可應(yīng)用于檢測GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFRL861Q這11個基因突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因分析檢測產(chǎn)品，具體地說是涉及一種基因檢測芯片及其配套的試劑，更具體地說是用于檢測與惡性腫瘤治療藥物反應(yīng)性密切相關(guān)的一系列基因突變的基因檢測芯片和配套的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明通過選擇合適的突變位點以及設(shè)計合適的引物和探針，全面、系統(tǒng)、高通量地檢測已知的與抗腫瘤藥物反應(yīng)個體差異密切相關(guān)的基因突變，并可針對不同藥物制定出相應(yīng)的調(diào)整方案。
文檔編號C12Q1/68GK101619350SQ200910042599
公開日2010年1月6日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者周宏灝 申請人:周宏灝