專利名稱：人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系的組成。 本發(fā)明還涉及一種干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前，無論是hESCs所采用的主要培養(yǎng)體系都是和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng) 的方式[1]，成纖維細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子對(duì)于胚胎多能性的維持起著至關(guān)重 要的作用，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從成纖維細(xì)胞條件化培養(yǎng)基中鑒定出部分對(duì)維 持胚胎干細(xì)胞未分化具有重要作用的細(xì)胞因子，其中就包括了 Wnt信號(hào)通 路配體Wnt3a[2]，但是單獨(dú)使用Wnt3a并不能維持hES處于未分化狀態(tài)[3]， 成纖維細(xì)胞可能還分泌了其他的細(xì)胞因子，如FGF2， Nodal， ActivinA等。 隨著人類胚胎干細(xì)胞無詞養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體現(xiàn)的建立，研究者發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通 路抑制劑BIO或高劑量的FGF2可以維持人類胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)[4'5]，同 時(shí)有研究表明人類胚胎干細(xì)胞可以分化成成纖維樣細(xì)胞，這些成纖維樣細(xì) 胞可以分泌IGF2來維持人類胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，人類胚胎干細(xì)胞可 以為自身建立一個(gè)維持未分化狀態(tài)的微環(huán)境6]，這是人類胚胎干細(xì)胞為自身 未分化狀態(tài)維持的間接作用，但是人類胚胎干細(xì)胞作為培養(yǎng)體系的組成部 分，人類胚胎干細(xì)胞直接對(duì)自身未分化狀態(tài)的影響未見報(bào)道。由于人類胚胎干細(xì)胞高表達(dá)FGF2， Nodal以及IGF2基因[7'8，人類胚胎干細(xì)胞自分泌 作用在自身未分化狀態(tài)維持中具有重要影響。在2006年，國外學(xué)者Yao等 同時(shí)采用了一種新的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，其加入的FGF2濃度由以往的 40ng/ml降低到20ng/ml[9]。 該文獻(xiàn)公開的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系是 DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， O.lmMP畫ME， 1 Xglutamine,在培養(yǎng)基中加 入了胎牛血清，F(xiàn)GF2濃度為20ng/ml，同時(shí)采用的是Matrigel預(yù)鋪皿，沒有 涉及克隆密度問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞 因子培養(yǎng)體系培養(yǎng)基，并用此培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞。
本發(fā)明提供的人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系培 養(yǎng)基是由下列成分組成的DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， 0.1mM0-ME。
本發(fā)明還公開了基于該培養(yǎng)基的培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞的方法。即通過 提高克隆種植密度可以在該培養(yǎng)體系維持人類胚胎干細(xì)胞不分化，并進(jìn)行 擴(kuò)增。每個(gè)底面積為2.89cr^的孔板內(nèi)克隆數(shù)目種植數(shù)目分別為80-120個(gè)。
在本人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系下，人類胚 胎干細(xì)胞仍然保持了未分化特征，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示該體系下克隆為 Oct4, SSEA-4和TRA-1-60陽性克隆(圖1)，表達(dá)了多能性基因Oct4, Sox2， Nanog和Rexl (圖2)， AKP染色陽性(圖4)，在形態(tài)上保持了未分化外
觀克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞維持高核質(zhì)比(圖3)。
在本發(fā)明培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞體系下，只要克隆種植密度維持在高水平狀態(tài)，人類胚胎干細(xì)胞就可以維持未分化狀態(tài)擴(kuò)增，并且不存在背景分 化現(xiàn)象，可以大規(guī)模擴(kuò)增人類胚胎干細(xì)胞。由于在體系中不含有外源性的 細(xì)胞因子，所以具有培養(yǎng)成本低廉的特定，同時(shí)，為闡明人類胚胎干細(xì)胞 未分化狀態(tài)提供了技術(shù)平臺(tái)。


圖1免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示該體系下克隆為Oct4, SSEA-4和TRA-l-60 陽性克隆；
圖2本發(fā)明培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞體系表達(dá)了多能性基因Oct4， Sox2， Nanog禾卩Rexl;
圖3本發(fā)明培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞體系在形態(tài)上保持了未分化外觀克 隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞維持高核質(zhì)比；
圖4本發(fā)明培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞體系A(chǔ)KP染色陽性。
具體實(shí)施例方式
方法和步驟
1、人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系培養(yǎng)基配方(NB 培養(yǎng)基)；
利用DMEM/F12 (11330057， DMEM NUTRIENT MIX F12， Gibco) N2 SUPPLEMENT ( 17502048， 100 X ， Gibco) ， B27 SUPPLEMENT (17504044， 50X， Gibco)， P-ME (p-mercaptoethanol， Gibco)配置本 發(fā)明提供的培養(yǎng)基DMEM/F12， 1XN2， 1XB27， O.lmMP-ME。
5每50ML組份如下DMEM/F12 48.5ml
N2 0.5ml B27 lml P -ME91 u 1
2、 培養(yǎng)皿預(yù)處理
1) 將進(jìn)口胎牛血清4t解凍，然后分裝成2ml/EP管，置-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 2) 室溫解凍EP管內(nèi)的血清；
3) 將進(jìn)口 FBS包被處理1孔板(0.5ml)或6孔板(1.5ml)， 4。C過夜 或者室溫至少處理4小時(shí)；
4) 使用前將FBS吸除，并用D-PBS洗滌三次，每次使用2ml D-PBS洗；
5) 加入NB體系hESCs培養(yǎng)基lml/1孔板，同時(shí)在1孔板的周邊加入 3mlPBS，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)形成高滲液，然后入37'C培養(yǎng)箱內(nèi)，備 用；
3、 人類胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1) 采用FBS預(yù)處理后l孔板加入lmlNB培養(yǎng)基，入培養(yǎng)箱備用；
2) 將在hESCs克隆用刀片切割成大小一致的小塊(0.2mmX0.2mm大 小)，再用20(^1的Tip將克隆塊鏟起；
3) 收集被鏟起的克隆塊；
4) 每個(gè)1孔板內(nèi)(底面積為2.89cm2)克隆數(shù)目種植數(shù)目分別為100個(gè)， 均勻散布皿底，使得每個(gè)1孔板內(nèi)的克隆密度為34克隆/cm2;5) 每天換液1次，每次lml;
6) 培養(yǎng)6天后，以機(jī)械切割的方式傳代培養(yǎng)，克隆密度為34克隆/cm2;
4、人類胚胎干細(xì)胞鑒定
4.1 hESCsAKP染色
1) 將培養(yǎng)的hESCs盡量去除殘余培養(yǎng)基；
2) 加入一20。C預(yù)冷的70^乙醇固定hESCs克隆，置-20度固定120分 鐘；
3) 取出固定細(xì)胞，采用雙蒸水洗滌3次；
4) 按照試劑盒說明，按照試劑說明配方(l藥片+5ml反應(yīng)液)新鮮配 置的染液染色，加入染液染色；
5) 室溫下一般染色10分鐘；
6) 當(dāng)染色滿意時(shí)，用蒸餾水洗滌3次；
7) 顯微鏡下觀察并攝像，如圖4所示；
4.2 hESCs分子標(biāo)記免疫細(xì)胞化學(xué)染色
1) 吸除6孔板或1孔板內(nèi)hESCs培養(yǎng)基，用DPBS洗滌2次，每次使 用3ml DPBS;
2) 加入4%多聚甲醛，室溫固定20分鐘；
3) DPBS洗滌3次。每次10分鐘；
4) 細(xì)胞內(nèi)抗原Oct4需要用透膜劑增加細(xì)胞膜的通透性，采用1% Triton-X-100室溫處理30分鐘；
5) 采用4%三羊血清(goat serum in DPBS)室溫封閉30分鐘，消除非特異性染色；
6) 用4%三羊血清稀釋一抗(SSEA-4 1:100, TRA-1-60 1:100, Oct4 1:50)， 4"C過夜處理；
7) DPBS洗滌3次，每次10分鐘；
8) 加入稀釋的二抗FITC(1:400)，室溫孵育1小時(shí)；
9) DPBS洗滌3次，每次10分鐘；
10) DAPI (1:1000)染色10秒； U)鏡下觀察并攝像，如圖l所示；
4.3多能性基因半定量PCR檢測(cè)
1) 依照不同基因引物對(duì)擴(kuò)增的條件分別擴(kuò)增多能性相關(guān)基因Oct4， Sox2和Nanog的表達(dá)水平；
2) 1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)基因表達(dá)量，如圖2所示；
以beta-actin為參照，分析各不同樣本之間各基因表達(dá)的相對(duì)水平。
權(quán)利要求
1、人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系培養(yǎng)基，其特征在于它是由下列成分組成的DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mMβ-ME。
2、 基于權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的人類胚胎干細(xì)胞體系無飼養(yǎng)細(xì)胞 的培養(yǎng)方法，其特征在于每個(gè)底面積為2.89cn^的孔板內(nèi)克隆數(shù)目種 植數(shù)目為80-120個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞無外源細(xì)胞因子培養(yǎng)體系培養(yǎng)基，由下列成分組成DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM β-ME；本發(fā)明還提供了一種基于上述培養(yǎng)基的人類胚胎干細(xì)胞體系無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。在本發(fā)明培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞體系下，只要克隆種植密度維持在高水平狀態(tài)，人類胚胎干細(xì)胞就可以維持未分化狀態(tài)擴(kuò)增，并且不存在背景分化現(xiàn)象，可以大規(guī)模擴(kuò)增人類胚胎干細(xì)胞，還具有培養(yǎng)成本低廉的特點(diǎn)，也為闡明人類胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)提供了技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N15/08GK101475934SQ20091004253
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者盧光琇, 戈 林, 羅樹偉 申請(qǐng)人:湖南惠霖生命科技有限公司