專利名稱：：Cyp2c9、cyp2c19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及苯妥英鈉代謝相關(guān)基因CYP2C9、CYP2C19突變檢測液相芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：苯妥英鈉為抗癲癇藥、抗心律失常藥，常用于顱腦手術(shù)后癲癇的預(yù)防，以及癲癇尤其是癲癇大發(fā)作的治療。這種藥物始用于20世紀(jì)初，長期作為治療癲癇的一線藥物，其療效雖好但有較多與劑量相關(guān)的不良反應(yīng)，且個(gè)體差異很大。患者若使用劑量不足，藥物不能達(dá)到預(yù)期療效；而稍有過量，又會(huì)對患者的神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的毒副作用。苯妥英鈉的毒副作用常見為齒齦增生，兒童發(fā)生率高；對神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)常見為眩暈、頭痛，嚴(yán)重時(shí)可引起眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、語言不清和意識(shí)模糊；此外，血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)亦會(huì)受到用藥劑量不當(dāng)?shù)挠绊?。大量的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，苯妥英鈉的療效與患者體內(nèi)兩個(gè)基因的突變關(guān)系密切，即CYP2C9和CYP2C19。苯妥英鈉70。/。90y。由CYP2C9代謝；而CYP2C19是其代謝過程中最重要的次級(jí)代謝酶，CYP2C19的作用隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)。CYP2C9和CYP2C19對降低苯妥英鈉毒性和促使其排泄出體外具有關(guān)鍵作用。在中國人群中，CYP2C9常見的功能減弱等位基因突變型為CYP2C^2和CYP2C9+3,其中CYP203基因分布頻率約2.5%;CTP2C19常見的功能減弱等位基因突變型為CTP2C19+2和子3;CYP2C9求3為A1075C突變，發(fā)生在外顯子7;CYP2C1W2為G681A突變，發(fā)生在外顯子5;CYP2C19+3為G636A突變，發(fā)生在外顯子4。這些等位基因的突變使酶活性降低，對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，表現(xiàn)出正常基因純合子〉正?；蚺c突變基因雜合子>突變基因純合子或雜合子的變化趨勢，即我們通常所說的基因劑量效應(yīng)。大量研究表明，攜有一個(gè)或以上功能減弱等位基因突變的患者，在接受苯妥英鈉治療時(shí)，如果不適當(dāng)減少劑量，將面臨較大的毒副作用風(fēng)險(xiǎn)。目前已建立了若干以PCR為基礎(chǔ)的檢測CYP2C9和CYP2C19基因SNPs的技術(shù)，如直接測序法，半定量PCR技術(shù)，PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測，以上技術(shù)具有靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高等缺點(diǎn)，普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)(PCR—RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進(jìn)行一種突變的檢測，耗時(shí)費(fèi)力；傳統(tǒng)的固相芯片價(jià)格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差?；谛酒脑?，美國Luminex公司開發(fā)出了以微球?yàn)檩d體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺(tái)，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強(qiáng)度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號(hào)分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度，再通6過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時(shí)具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。我們采用x-Taq液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測多種突變，實(shí)現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供與苯妥英鈉療效密切相關(guān)的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP2C9基因的兩種常見突變等位基因CYP2CW2和CTP2C9"，以及CYP2C19基因的兩種常見突變等位基因CYP2C1W2和CYP2C19沐3。一種CYP2C9和/或CYP2C19基因突變檢測液相芯片，包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別的突變分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補(bǔ)配對；所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，一種CYP2C9和/或CYP2C19基因突變檢測液相芯片，包括有7(1).包被有特異的anti-tag序列的8種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列分別為SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列;(2).針對每種型別突變設(shè)計(jì)的4對野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5'端的tag序列和3'端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性序列組成，所述tag序列能分別相應(yīng)地與(1)中所述微球上anti-tag序列互補(bǔ)配對；所述野生型及突變型特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。更優(yōu)選地，所述4對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物的為SEQIDNO.9的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.l組成的引物、及SEQIDNO.IO的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.2組成的引物；SEQIDNO.ll的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.3組成的引物、及SEQIDNO.12的互補(bǔ)序列和SEQIDN0.4組成的引物;SEQIDNO.13的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.5組成的引物、及SEQIDNO.14的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.6組成的引物;和SEQIDNO.15的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.7組成的引物、及SEQIDNO.16的互補(bǔ)序列和SEQIDN0.8組成的引物。優(yōu)選地，(3)中所述引物為針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、針對CYP2C19Exon5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19Exon4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24.以上所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環(huán)境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n》3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5—30個(gè)T。本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP2C9和/或CYP2C19基因突變進(jìn)行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測的方法，主要包括以下步驟(一)PCR擴(kuò)增待測DNA樣品，得需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT酶進(jìn)行酶切處理；(三)酶切處理后的產(chǎn)物用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的檢測方法、液相芯片與測序法的吻合率高達(dá)100%。所制備的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點(diǎn)。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，四種突變檢測可通過一步多重PCR即可完成四個(gè)具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。具體實(shí)施例方式實(shí)施例lCYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片試劑盒，主要包括有一、ASPE引物針對CYP2C9和CYP2C19基因的各兩種常見突變等位基因分別設(shè)計(jì)特異性的引物序列。ASPE引物由1"38+特異性序列組成，特異性序列設(shè)計(jì)的原則是特異性序列的3'末端為突變位點(diǎn)；用于檢測一個(gè)基因突變位點(diǎn)野生型與突變型的特異性引物應(yīng)當(dāng)來自DNA的同一條鏈；特異性引物的退火溫度應(yīng)當(dāng)在51'C-56。C之間；引物長度一般在18-22bp之間。ASPE引物序列如下表所示表lASPE引物序列特異性序列基因夕卜顯子類型ASPE引物(tag-特異性序列)(SEQNO.)10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>每條ASPE引物包括兩個(gè)部分，5'端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列(如表2所示)，3'端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表l所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計(jì)的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇的八種tag序列及其微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示表2ASPE特異性引物右端的Tag序列及微球上對應(yīng)的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>突變'發(fā)生在外顯子5;CYP2C1W3為G636A突變，發(fā)生在外顯子4。設(shè)計(jì)四對引物(見表3)，分別擴(kuò)增出四條具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列。表3擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物SEQNO.基因外顯子類型擴(kuò)增引物17CYP2C9Exon3C430T-Forward5，GGATGGMAACAGAGACTTAC3，18C430T-Reverse5'AAGGTCAGTGATATGGAGTAG3'19Exon7A1075C-Fo擺rd5'CCATCCTCTCTTTAAGTTTGC3'20A1075C-Reverse5'ACTATGMTTTGGGGACTTCG3'21CYP2C19Exon5G681A-Forward5'CAGAGCTTGGCATATTGTATC3'22G681A-Reverse5，AGTAAACACAMACTAGTCAATG3，23Exon4G636A-Forward5'GGAATTCATAGGTAAGATATTAC3'24G636A-Reverse5'AAAATGTACTTCAGGGCTTGG3，實(shí)施例2運(yùn)用CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml的用量MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM-29330.05M2.44g5MNaOHFisherSS256-500---5滴2XTm雜交緩沖液14試劑來源終濃度每250ml的用量lMTris-HCl'pH8.0Sig腿T30380.2M50ml5MNaClSigmaS51500.4M20mlTritonX-100SigmaT87870.16%0.4ml過濾后貯存于4'C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。一、樣本的DNA提取.-參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下1.取抗凝靜脈血或胸腔積液約2.5ml，3000rpm離心15分鐘，取30(^1上清加到一個(gè)1.5ml干凈無菌的離心管中；2.向離心管中加入50(Hi1AP1緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；3.加入10(V1AP2緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；4.室溫下12，OOOrpm離心lO分鐘；5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPr印中，蓋上蓋子，以6，OOOrpm離心l分鐘；6.倒掉廢液收集管中的廢液，用80(V1緩沖液W1洗滌1次，以6，OOOrpm離心l分鐘；7.倒掉廢液收集管中的廢液，加入800(il緩沖液W2'以12，OOOrpra離心l分鐘；倒掉廢液收集管中的廢液，加入500iil緩沖液W2，以12，OOOrpm離心l分鐘，棄掉廢液；158.將吸附柱AxyPr印放回空收集管中，12，OOOrpm離心l分鐘；9.將吸附柱AxyPr印置于一干凈無菌的1.5ml離心管中，加入40plTE緩沖液，室溫下放置l分鐘，12，OOOrpm離心l分鐘洗脫DNA，電泳檢測，-2(TC保存。二、待測樣品的PCR擴(kuò)增利用Primer5.0設(shè)計(jì)的四對引物，多重PCR—步擴(kuò)增出CYP2C9的外顯子3和外顯子7，以及CYP2C19的外顯子5和外顯子4共四條具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列，產(chǎn)物大小分別為306bp、399bp、322bp、374bp。引物序列(SEQNO.17-24)見上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.17-24的引物貯存液100ul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下IOX緩沖液(含Mg勺5uldNTP(各2.5,1/L)4ulTaq酶(5L)/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL)8ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH2031.5ul共50ulPCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C3min;94。C20s，56°C30s，72°C30s，30個(gè)循環(huán)；72°ClOmin;4'C保存?zhèn)溆谩Ｈ?、PCR產(chǎn)物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下1.取7.5ulPCR反應(yīng)后的產(chǎn)物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37'C孵育15min。80'C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點(diǎn)特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用上述設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP,從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取C430Ti、C430T-m、/U075Ci、A1075C-m、G681A-w、G681Ai、G636Ai、G636A-m相應(yīng)的ASPE引物C存液10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補(bǔ)至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下IOX緩沖液2ulMgCl2(50,1/L)0.5ulBiotin-dCTP(400uraol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)1ulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)1ul酶切處理的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ulddH2010.ul共20ulPCR程序?yàn)?96。C2min;94°C30s'58°Clmin，72°C2min，30個(gè)循環(huán)；4"C保存?zhèn)溆?五、雜交反應(yīng)1.根據(jù)設(shè)計(jì)的ASPE引物，選擇相應(yīng)的最優(yōu)的八種FlexMAP微球(微球濃度均為2.5X105個(gè)/ral)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同時(shí)每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應(yīng)的ASPE引物3'端的tag序列特異結(jié)合；本實(shí)施例每組樣品檢測中都分別選擇LUA45,LUA16,LUA17,LUA40,LM55，LUA32,LUA23，LUA31共八種微球；2.分別取lul每種編號(hào)的微球于l.5ml的微量離心管中；3.微球于》10000g離心l-2min;4.棄去上清，微球重懸于100ul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH20補(bǔ)足至50ul;7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95°C60s，37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于》3000g離心2—5min;9.去上清，將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中；10.微球于》3000g離心2—5min;11將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE);12.37。C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢18測儀作為檢測平臺(tái)，對核酸分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于L咖inex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結(jié)果如表4和表5所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求1.每個(gè)位點(diǎn)需至少有一個(gè)等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI;2.NETMFI=樣品MFI—PCR陰性對照MFI(NETMFI小于O的以O(shè)表示)；3.滿足以上兩個(gè)條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計(jì)算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)對每個(gè)檢測位點(diǎn)的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的CYP2C9和CYP2C19基因突變，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計(jì)算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為突變型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計(jì)算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的CYP2C9和CYP2C19基因突變型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達(dá)到100M?？梢姳景l(fā)明所提供的CYP2C9和CYP2C19基因突變檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出CYP2C9和CYP2C19基因突變類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表4樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5樣本CYP2C9和CYP2C19突變類型分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>1710151野生型純合子*3突變型和野生型雜合子野生型純合子*3突變型和野生型雜合子180010野生型純合子野生型純合子野生型純合子野生型純合子1902960野生型純合子*2突變型突變型純合子野生型純合子*2突變型突變型純合子200110野生型純合子野生型純合子野生型純合子野生型純合子22序列表〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司〈120〉CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法〈160>24<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>19<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉1aagaggagcattgaggacc19〈210〉2〈211〉19〈212〉■<213>人工序列〈400〉2aagaggagcattgaggact1923〈210〉3〈211〉19〈212〉廳〈213〉人工序列〈400〉3tggtggggagaaggtcaat19〈210〉4〈211〉19〈212〉讓<213>人工序列〈400〉4tggtgggg兆3Eiggtcaag〈210〉5〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5agtaatttgttatgggttccc21<210〉6〈211〉21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>〈400〉9ttgagtaattgasttgtgas3tg324<210〉10〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉10tgatgatttgaatgaagattgatt24<210〉11<211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400>11tgatsaagtg3t3aaggstt3a_3g24〈210〉12〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉12taatgttgtgaataatgtagaaag2<<210〉13<211〉24<212>靈〈213〉人工序列〈400〉13gttagttattgagaagtgtatata〈210〉14〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉14gtagattagtttgaagtgaataat<210>15〈211〉24<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉15aaagttgagatttgaatgattgaa24242427〈210〉16〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉16gatta犯gttgattgasasgtg3324〈210〉17〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉17ggatggaaaacagagacttac<210〉18〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>18a鄉(xiāng)tcagtgatatggagtag2121〈210>19〈211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉19ccatcctctctttaagtttgc21<210〉20〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉20actatgaatttggggacttcg21〈210〉21〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉21cagagcttggcatattgtatc21<210〉22<211〉23〈212〉腿<213〉人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>權(quán)利要求1.一種CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9～SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別的突變分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補(bǔ)配對；所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8；(3).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).包被有特異的anti-tag序列的8種微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列分別為SEQIDNO.9SEQIDNO.16中的序列；(2).針對每種型別突變設(shè)計(jì)的4對野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5'端的tag序列和3，端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性序列組成，所述tag序列能分別相應(yīng)地與(l)中所述微球上anti-tag序列互補(bǔ)配對；所述野生型及突變型特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO,6、和SEQIDNO.7及SEQIDNO.8;(3).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述4對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物為SEQIDNO.9的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.l組成的引物、及SEQIDNO.IO的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.2組成的引物;SEQIDNO.ll的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.3組成的引物、及SEQIDNO.12的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.4組成的引物；SEQIDNO.13的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.5組成的引物、及SEQIDNO.14的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.6組成的引物；和SEQIDNO.15的互補(bǔ)序列和SEQIDNO.7組成的引物、及SEQIDNO.16的互補(bǔ)序列和SEQIDN0.8組成的引物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是'(3)中所述引物包括有針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、針對CYP2C19E麗5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19Exon4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。5.根據(jù)權(quán)利要求1一4項(xiàng)所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5—30個(gè)T。6.—種CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測的方法，其特征是，使用權(quán)利要求l所述的液相芯片進(jìn)行檢測，主要包括以下步驟(一)PCR擴(kuò)增待測DNA樣品，得需要檢測的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT酶進(jìn)行酶切處理；(三)酶切處理后的產(chǎn)物用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測的方法，其特征是，所述引物包括有針對CYP2C9Exon3突變的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、針對CYP2C9Exon7突變的SEQIDNO.19及SEQ丄DNO.20、針對CYP2C19Exon5突變的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和/或針對CYP2C19E扁4突變的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP2C9、CYP2C19基因突變液相芯片及其檢測方法'其特征是步驟(五)中雜交的溫度為35—38'C。全文摘要本發(fā)明公開了CYP2C9、CYP2C19基因突變檢測液相芯片及其檢測方法，該液相芯片包括有分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.9～SEQIDNO.16中的序列；野生型和突變型ASPE引物，所述野生型及突變型特異性序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、和/或SEQIDNO.7及SEQIDNO.8；引物。所述液相芯片檢測的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101487052SQ200910037358公開日2009年7月22日申請日期2009年2月24日優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日發(fā)明者何嘉英,許嘉森,郭元杰申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司