專利名稱：：棉花抗病相關(guān)基因gbnbs及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及棉花抗病相關(guān)基因GBNBS及其應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。用于通過(guò)植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其他有益生產(chǎn)性狀。
背景技術(shù)：
：真菌、細(xì)菌、病毒以及線蟲引起的植物疾病為作物生產(chǎn)帶來(lái)了毀滅性的影響。植物抗病基因(R基因)能夠識(shí)別病原菌并引起過(guò)敏性反應(yīng)(HR)，從而提高作物對(duì)病害的抗性。近年來(lái)已從不同植物中克隆出多個(gè)R基因。多數(shù)R基因具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域，根據(jù)N端信號(hào)肽的不同，NBS-LRR基因可分為TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR兩類(DanglJL,JonesJD:Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection[J].Nature2001,411:826-833.)。雖然不同NBS-LRR基因之間核苷酸序列的差異較大，但是它們的氨基酸序列存在一些保守的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)這些保守的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)獲得很多抗性基因類似物(RGA)(LeisterD,BallvoraA,SalaminiF,etal.APCRbasedapproachforisolatingpathogenresistancegenesfrompotatowithpotentialforwideapplicationinplants[J].1996,NatGenet14:421-429.MagoR,NairS,MohanMResistancegeneanaloguesinrice:cloning,sequencingandmapping[J].TheorApplGenet,1999,9950-57)。高等植物的誘導(dǎo)性防衛(wèi)反應(yīng)是由一系列基因和信號(hào)分子參與的信號(hào)傳遞過(guò)程，這個(gè)過(guò)程主要可以分為三個(gè)階段植物細(xì)胞對(duì)病原微生物的識(shí)別；胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)換和傳遞；防衛(wèi)反應(yīng)的開啟和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的產(chǎn)生(Kombrink和Somssich，1995)。而NBS-LRR基因的結(jié)構(gòu)特征可以使信號(hào)有效傳遞。NBS區(qū)是NBS-LRR基因最保守的部分，NBS結(jié)構(gòu)域存在于許多ATP/GTP結(jié)合蛋白中，該結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)核心區(qū)域，包括kinasela即P-Ioof，kinase2a和kinase3a。一般認(rèn)為，NBS中的基序如磷酸結(jié)合環(huán)(p-loop)為ATP/GTP的特異結(jié)合位點(diǎn)，ATP或GTP被NBS-LRR基因結(jié)合并水解，從而將胞外信號(hào)傳遞并且放大，并最終激活下游的效應(yīng)基因并誘發(fā)植物的抗病反應(yīng)。1-2和Mi-I是番茄的2個(gè)抗病和抗線蟲基因，屬于NBS-LRR基因家族，通過(guò)體外過(guò)濾結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，純化的1-2蛋白特異性結(jié)合ATP，而P-Ioof突變體蛋白的結(jié)合能力則大大下降。薄層層析分析證明1-2和Mi-I都具有ATPase活性(TamelingW.I.L.,ElzingaS.D.J.,DarminP.S.,etal.TheTomatoRGeneProductsI_2andMi-IAreFunctionalATPBindingProteinswithATPaseActivity.ThePlantCell,2002(14)=2929-2939)LRR區(qū)域是R基因中保守性最低的一個(gè)區(qū)域，不同的R基因在LRR重復(fù)序列的數(shù)目、長(zhǎng)度及排列上存在很大差異。LRR區(qū)域參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，尤其在分子識(shí)別過(guò)程中。LRR的這種結(jié)構(gòu)特征對(duì)于病原信號(hào)的專一識(shí)別起到了至關(guān)重要的作用。R基因在植物體內(nèi)表達(dá)量一般都比較低。一般認(rèn)為，NBS-LRR類蛋白質(zhì)的負(fù)調(diào)節(jié)子通過(guò)與LRR結(jié)構(gòu)域作用穩(wěn)定其分子結(jié)構(gòu)，使之保持非激活狀態(tài)，在這種狀態(tài)下的NBS-LRR類蛋白質(zhì)可能有極小的活性，不會(huì)對(duì)植物體造成傷害。而在植物體內(nèi)超表達(dá)NBS-LRR類蛋白質(zhì)(如Rx、RPMl和RPS2等)則會(huì)引起不依賴于病原物的超敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)對(duì)細(xì)胞造成致死反應(yīng)。如馬鈴薯Rx蛋白的LRR和NBS區(qū)域發(fā)生突變，這種突變?cè)斐蒖x蛋白的組成性表達(dá)，在沒(méi)有病原菌外殼蛋白存在的情況下，細(xì)胞組成性死亡(BendahmaneA，F(xiàn)arnhamG，MoffettP,etal.Constitutivegain-of-functionmutantsinanucleotidebindingsite—leucinerichrepeatproteinencodedattheRxlocusofpotato.ThePlantjournal,2002,32(2):195-204)。擬南芥的RPMl和RPS2基因可以特異性識(shí)別病原菌無(wú)毒蛋白并誘發(fā)超敏反應(yīng)。這兩個(gè)R蛋白有一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子RIN4，Mackey等認(rèn)為通常情況下，植物中RIN4與RPS2結(jié)合并抑制其活性，RIN4是AvrRpt2的特異靶蛋白，當(dāng)侵染發(fā)生后，RIN4被AvrRpt2降解，RPS2被激活，進(jìn)而引發(fā)防御反應(yīng)(MackeyD.，BelkhadirY.，AlonsoJ.M.，etal.ArabidopsisRIN4IsaTargetoftheTypeIIIVirulenceEffectorAvrRpt2andModulatesRPS2_MediatedResistance.2003，Cell,112:379_389.)。R基因編碼的蛋白有2個(gè)作用，首先是識(shí)別來(lái)源于病原物的信號(hào)；第二是啟動(dòng)配套的植物防衛(wèi)反應(yīng)。這就決定了R基因在細(xì)胞中位置的特殊性，但是對(duì)于R基因的亞細(xì)胞定位研究很少。原來(lái)認(rèn)為由于NBS-LRR蛋白缺乏跨膜區(qū)域或相關(guān)的信號(hào)肽，它們應(yīng)該位于細(xì)胞質(zhì)中。但是Boyesetal(1998)利用免疫細(xì)胞生化實(shí)驗(yàn)對(duì)NBS-LRR基因RPMl的研究結(jié)果卻M^^^J—^vIIMSS(BoyesD.C.，NamJ,DanglJ.L.TheArabidopsisthalianaRPMldiseaseresistancegeneproductisaperipheralplasmamembraneproteinthatisdegradedcoincidentwiththehypersensitiveresponse.ProcNatlAcadSci,1998,95(26)；15849-15854)。R基因和avr基因識(shí)別后，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)一系列抗病防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)，產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性(systemicacquiredresistance,SAR)。植物產(chǎn)生SAR后，抗病防衛(wèi)反應(yīng)中表達(dá)的基因主要是編碼病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedproteins，PRs)和植保素合成相關(guān)酶基因。I3R蛋白在植物抗病性和系統(tǒng)獲得抗性中起重要作用，有些I3R蛋白在體外就有抗菌活性。早期利用基因工程獲得的抗病植株都為轉(zhuǎn)防衛(wèi)相關(guān)基因植株，如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖氧化酶、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，但是轉(zhuǎn)化株的抗病能力提高有限，很難獲得抗病植株，并不能大規(guī)模地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐(吳家和，張獻(xiàn)龍，羅曉麗.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因棉花的獲得及其對(duì)黃萎病的抗性.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(2)；程紅梅，簡(jiǎn)桂良，倪萬(wàn)潮，楊紅華，王志興，孫文姬，張保龍，王曉峰，馬存，賈士榮.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β1，3—葡聚糖酶基因提高棉花對(duì)枯萎病和黃萎病的抗性.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(6)1160-116；MurraylF,LlewellynlD，McFaddenlH，JamesPeacock.ExpressionoftheTalaromycesflavusglucoseoxidasegeneincottonandtobaccoreducesfungalinfection,butisalsophytotoxic.MolecularBreeding5:219_232，1999；RajasekaranK，CaryJW,JaynesJM,ClevelandTE.Diseaseresistanceconferredbytheexpressionofageneencodingasyntheticpeptideintransgeniccotton(GossypiumhirsutumL.)plants.PlantBiotechnolJ.2005,3(6):545_554)。而利用R基因獲得抗病植株效果則較為明顯。Kawchuk等(2001)利用圖位克隆從番茄抗黃萎病菌大麗輪枝菌材料中克隆了抗病基因Vel，Ve2，它們屬于NBS-LRR基因家族。將這2個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入感病土豆中，轉(zhuǎn)Vel和Ve2基因土豆表現(xiàn)為抗黃萎病，因此利用R基因提高抗黃萎病是可行的(KawchukLiHachey4J.LynchD.TomatoVediseaseresistancegenesencodecellsurface-likereceptors.PNAS，2001，98(11):6511_6515)。棉花是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物。青枯病、枯萎病、黃萎病和根結(jié)線蟲等棉花病害對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，降低棉花產(chǎn)量和品質(zhì)?？寺】剐曰?qū)ρ芯棵藁ê筒≡プ?、提高棉花抗病性具有重要意義。而海島棉(Gossypiumbarbadense)對(duì)黃萎病、枯萎病的抗性較強(qiáng)，且受顯性單基因或主效基因控制(房衛(wèi)平，祝水金，季道藩。陸地棉和海島棉的黃萎病抗性遺傳研究.棉花學(xué)報(bào)，2003，15(1):327.)，因此，從海島棉中分離R基因并創(chuàng)制基因工程抗病新種質(zhì)是一個(gè)有效途徑。但是由于遺傳圖譜的不飽和，通過(guò)圖位克隆方法分離棉花R基因比較困難。RGA提供了另外一種研究抗病基因的途徑。近年來(lái)很多與NBS結(jié)構(gòu)域相關(guān)的棉花RGA已經(jīng)分離并定位(HeLjDuC,CovaledaL，etal.Cloning,characterization,andevolutionoftheNBS-LRRencodingresistancegeneanaloguefamilyinpolyploidcotton(GossypiumhirsutumL.)[J].Mol.PlantMicrobeInteract.2004，17:1234-41)。然而，棉花NBS-LRR基因全序列的分離及功能研究目前還未見報(bào)道。本發(fā)明的發(fā)明人先前通過(guò)根據(jù)NBS-LRR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從海島棉中獲得了棉花的NBS-LRR基因序列，并進(jìn)而獲得了該基因的全長(zhǎng)序列，將其命名為GBNBS，其編碼蛋白具有體外ATPase活性，亞細(xì)胞將其定位于細(xì)胞膜周。該基因在轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)量表達(dá)會(huì)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)相關(guān)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量增加。GBNBS基因的研究分析深化了對(duì)棉花R基因的認(rèn)知，并最終為獲得抗病基因工程植株奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一個(gè)棉花抗病相關(guān)基因GBNBS，該基因編碼一個(gè)CC-NBS-LRR蛋白，并且具有ATPase活性。該基因在細(xì)胞膜周表達(dá)。同時(shí)，該基因過(guò)量表達(dá)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)相關(guān)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量增加。可以利用本發(fā)明基因構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高作物抗病、抗蟲性狀。技術(shù)方案本發(fā)明提供了一個(gè)棉花抗病相關(guān)基因GBNBS，該基因來(lái)源于海島棉(Gossypiumbarbadense)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.lXSSPE(15mMNaCl,ImMNaH2PO4,0.ImMEDTA)、0.lXSSC(15mMNaCl，1.5mM檸檬酸鈉)、0.SDS(十二烷基磺酸鈉)的溶液中，65°C條件下洗膜。序列表中的SEQIDNO.1由2842個(gè)堿基組成，自5，端第28位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，記為+1；第2611位堿基為轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。完整編碼框長(zhǎng)度為2584個(gè)堿基，編碼蛋白為861個(gè)氨基酸，分子量為93KD。GBNBS具有保守的P-L00F結(jié)構(gòu)域，屬于CC-NBS-LRR類蛋白。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和宿主菌以及擴(kuò)增該基因任一片段的引物。本發(fā)明涉及棉花抗病相關(guān)基因GBNBS，該基因編碼一個(gè)CC-NBS-LRR蛋白，通過(guò)原核表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白產(chǎn)物在體外具有ATPase活性。用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因在細(xì)胞外表達(dá)。將GBNBS與35S啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥植株，結(jié)果該基因過(guò)量表達(dá)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)相關(guān)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量增加?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高作物抗病、抗蟲性狀。GBNBS的功能研究可為揭示其表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及具體功能打下基礎(chǔ)，還可應(yīng)用于棉花抗病、抗蟲基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。有益效果1.本發(fā)明獲得了一個(gè)全新的棉花抗病相關(guān)基因GBNBS。棉花是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花的真菌病害、細(xì)菌病害以及線蟲都會(huì)造成產(chǎn)量減少以及品質(zhì)下降。棉花抗病基因的克隆可以使我們更好地了解寄主與病原菌的互作并為基因工程改良奠定基礎(chǔ)。目前為止獲得的R基因中大部分都屬于NBS-LRR類基因，但是棉花NBS-LRR基因全序列的分離及功能研究目前還未見報(bào)道。本發(fā)明獲得的GBNBS基因是一個(gè)全新NBS-LRR類基因，在GENBANK中沒(méi)有與其高度同源的相似基因。并且通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥分析，發(fā)現(xiàn)此基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)相關(guān)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量增加，說(shuō)明該基因可以調(diào)控防衛(wèi)基因的表達(dá)，是一個(gè)抗病相關(guān)基因。2.本發(fā)明證明了GBNBS具有ATPase活性。雖然從結(jié)構(gòu)上分析，NBS-LRR基因中NBS的基序如磷酸結(jié)合環(huán)(p-loop)為ATP/GTP的特異結(jié)合位點(diǎn)，ATP或GTP可以被NBS-LRR基因結(jié)合并水解，從而將胞外信號(hào)傳遞并且放大，并最終激活下游的效應(yīng)基因并誘發(fā)植物的抗病反應(yīng)。但是相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證明卻進(jìn)行的很少，本發(fā)明利用原核表達(dá)并純化GBNBS蛋白，證明了該基因翻印的蛋白具有體外水解ATP的能力。3.本發(fā)明獲得并證明了一個(gè)在細(xì)胞膜周表達(dá)的R基因。NBS-LRR基因要識(shí)別病原物或外界相關(guān)信號(hào)，并將該信號(hào)傳遞，所以其在細(xì)胞中的存在位置就顯得極其重要。很多病原菌的Avr和相匹配的R蛋白都存在空間上的相互依賴性。由于NBS-LRR蛋白缺乏跨膜區(qū)域或相關(guān)的信號(hào)肽，一般認(rèn)為它們應(yīng)該位于細(xì)胞質(zhì)中。但是Boyesetal(1998)利用免疫細(xì)胞生化實(shí)驗(yàn)對(duì)NBS-LRR基因RPMl的研究結(jié)果卻顯示其為一個(gè)膜周蛋白，并且是位于細(xì)胞質(zhì)的這一面。本發(fā)明利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)GBNBS基因位于膜周，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因特別是在胞間連絲處大量聚集，這在以前的研究中沒(méi)有報(bào)道過(guò)。因此，該基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果豐富了人們對(duì)于NBS-LRR基因的認(rèn)知，并為更全面解釋該類基因的抗病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.更好地了解抗病基因的作用機(jī)制及用于抗病育種。雖然目前有一些抗病基因被克隆出來(lái)，但是對(duì)抗性機(jī)制以及相關(guān)的信號(hào)通路的了解還不是很深入。對(duì)GBNBS基因的進(jìn)一步研究分析深化了對(duì)R基因的認(rèn)知，曾經(jīng)對(duì)含有該基因的BAC克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)含有數(shù)個(gè)同源基因，是一個(gè)基因家族。GBNBS的系統(tǒng)研究為最終獲得抗病基因工程植株奠定基石出。四圖IGBNBS,RPP8(EEF33923.1)，RPMl(AAT09451.1)和NRCl(ABC26878.1)的氨基酸序列比較。圖2GBNBS基因原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。20KD為空載體PET32C的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，60KD為含有去除LRR區(qū)部分基因序列載體NB⑶的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，90KD為含有基因全長(zhǎng)載體PET3161的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果.1,2,3為空載體PET32C分別誘導(dǎo)0h，4h和6h的表達(dá)結(jié)果；4，5，6為含有全長(zhǎng)基因的融合表達(dá)載體P3161分別誘導(dǎo)0h，4h和6h的表達(dá)結(jié)果；7，8，9為去除LRR域部分基因的融合表達(dá)載體分別誘導(dǎo)0h，4h和6h的表達(dá)結(jié)果。圖3原核表達(dá)產(chǎn)物的WesternBlot結(jié)果。圖4GBNBS基因以及部分序列表達(dá)蛋白的功能分析。PET32(C)為沒(méi)有插入片段的空白載體；P3161為含有GBNBS全長(zhǎng)基因的融合表達(dá)載體；NBCD為含有去除LRR區(qū)域的部分基因序列的融合表達(dá)載體。圖5GBNBS基因的亞細(xì)胞定位分析。圖6GBNBS過(guò)量表達(dá)株的RT-PCR分析。NBS3，NBS4，NBS5，NBS6為GBNBS過(guò)量表達(dá)植株，CK為為轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。Chitinase為幾丁質(zhì)酶基因，β-Tubulin為內(nèi)參。五具體實(shí)施例方式下述實(shí)施方式中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。本實(shí)驗(yàn)所用的海島棉(Gossypiumbarbadense)品種均為海7124(高玉龍，郭旺珍，王磊，張?zhí)煺?海島棉抗病基因類似物與防衛(wèi)基因類似物的分離及特征分析.中國(guó)科學(xué)C輯，2006，36(2):97108)，擬南芥品種為哥倫比亞型(LinX,KaulS,RounsleyS,SheaTP,BenitoMI,TownCD,FujiiCY,MasonΤ,BowmanCL,BarnsteadΜ,FeldblyumTV,BuellCR,KetchumKA,LeeJ,RonningCM,KooHL,MoffatKS,CroninLA,ShenM,PaiG,VanAkenS,UmayamL,TallonLJ,GillJE,AdamsMD,CarreraAJ,CreasyTH,GoodmanHM,SomervilleCR,CopenhaverGP,PreussD,NiermanWC,White0,EisenJA,SalzbergSL,FraserCM,VenterJC.Sequenceandanalysisofchromosome2oftheplantArabidopsisthaliana.Nature1999;16;402(6763):761-8.)。棉花與擬南芥都在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。光照強(qiáng)度為130ymolphotonsHT2s-1,濕度為65%。(一)棉花GBNBS基因克隆以及序列分析根據(jù)水稻和煙草NBS結(jié)構(gòu)域的P-Ioop和GLPL氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物序列為5‘-GGNGGNAT(T/C/A)GGIAA(A/G)ACIAC-3‘，5‘-NA(G/A)NGCIA(G/A)IGGIA(G/A)ICC。PCR擴(kuò)增獲得一500bp的雙引物擴(kuò)增條帶，回收并送多個(gè)克隆測(cè)序。結(jié)果獲得了多個(gè)含有NBS結(jié)構(gòu)域的EST序列，且這些序列之間具有極高的同源性。選擇其中一個(gè)EST用TailPCR和Race技術(shù)擴(kuò)增全序列。N端特異性引物是5'-CCCATAGTTGAGTTTCTTCTACACCG-3'，5'-CTTCTCACCCAACTTCACATCGTC-3‘，5'-TATCAGTTCCGAAAGGATGGCT-3‘。C端特異性引物是5'-GGAAGCAGACTGTTATTAACTACTCGC-3‘，5'-TCAAAGAATGTGGCTTCACTGGC-3‘，5'-TTGATGATGAAGCAAGGTGGG-3‘,5'-GATTGACATTACAATGCAAACATTTCTC-3‘,5‘-CGAGACTCAAAGTGTTGGATTTAGGA-3‘,5‘-GTCCTTATTTAAGCAGTCTACCTCG-3‘.參照Paterson等的方法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractioncotton(Gossypiumspp.)GenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep1993,11:122-127.)提取棉花葉片的核基因組DNA。TAILPCR的方法參照(LiuY.G.，MitsukawaN.OosumiT.,WhittierR.F.PlantJ,1995,8:457_463·)進(jìn)行。3'-RACE方法參照Clontech公司的SmartRacecDNAAmplificationKit進(jìn)行。利用TAILPCR在5’端獲得了一730bp的片段，序列分析發(fā)現(xiàn)其具有啟始密碼子ATG和部分5'UTR序列。利用TAILPCR在3'端獲得了一570bp的片段，但是序列分析表明并沒(méi)有達(dá)到基因的3'末端，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)3'RACE引物并進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了一850bp的片段，BLAST分析發(fā)現(xiàn)其含有PolyA序列，說(shuō)明已經(jīng)到達(dá)基因的3'末端。根據(jù)拼接得到的序列設(shè)計(jì)特異引物5，gagtcgacgactaaaaagttaggga3，與UPM(CL0NTECH)配對(duì)用于擴(kuò)增海島棉cDNA，將擴(kuò)增獲得的片段測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該片段長(zhǎng)為2842bp(SEQIDNO.1)，含有完整的開放閱讀框，閱讀框長(zhǎng)為2584bp，5'UTR為27bp，編碼蛋白含有861個(gè)氨基酸。將該基因命名為GBNBS。用DNAMAN進(jìn)行序列比較分析，通過(guò)氨基酸序列比較，可以將GBNBS歸為CC-NBS-LRR類型蛋白。GBNBS除NBS區(qū)域外，與已登錄的R基因相似度都不高，相似度最高的蓖麻的RPPR8(登錄號(hào):EEF33923.1)，NRCl(登錄號(hào):ABC26878.1)相似度也只有27%。與RPMl(登錄號(hào)AAT09451.1)的相似度為26%(圖1)。(二)GBNBS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)產(chǎn)物的Western雜交分析GBNBS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)產(chǎn)物的功能分析方法參照Tamelingetal的方法進(jìn)行(TamelingW.I.L.,ElzingaS.D.J.,DarminP.S.,etal.TheTomatoRGeneProductsI_2andMi-IAreFunctionalATPBindingProteinswithATPaseActivity.ThePlantCell,2002(14)=2929-2939)為了構(gòu)建原核表達(dá)載體，以海島棉cDNA為模板，分別構(gòu)建GBNBS全長(zhǎng)片段(約2600bp)以及去除LRR區(qū)域后的剩余片段(約2000bp)的融合表達(dá)載體。用基因特異引物SNsall582:GAGTCGACGACTAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAG；Ansal4221CAGTCGACAGATGCCTTCAATAAAGAAGCCACTC擴(kuò)增GBNBS基因全長(zhǎng)。用引物SNsal1582:GAGTCGACGACTAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAG；Antixhol368:CACTCGAGGCTTTTGACCTCATTGTGTCTTCTAT，擴(kuò)增去除LRR區(qū)域片段的GBNBS基因部分序列。引物末端都含有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶同時(shí)酶切擴(kuò)增產(chǎn)物以及大腸桿菌表達(dá)載體PET32(C)(MERCK)，將酶切產(chǎn)物分別割膠回收，并將相對(duì)應(yīng)的目的片段用T4LigaSe進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化原核表達(dá)專用菌株大腸桿菌BL21(大連寶生物公司)。PCR，酶切以及測(cè)序鑒定插入的目的片段。將含有GBNBS基因全長(zhǎng)序列以及去除LRR區(qū)域片段的這兩個(gè)融合表達(dá)載體分別命名為P3161和NBCD。取Iml含有GBNBS-His融合的表達(dá)載體的菌株轉(zhuǎn)入IOOmL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)約2h后，加入ImMIPTG誘導(dǎo)4h，6h。取l_2ml菌液SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)空白載體可以誘導(dǎo)出20KD的蛋白，而P3161和NBCD分別表達(dá)出90KD和60KD的蛋白，并且表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加(圖2)。這與預(yù)期大小都是一致的。Westernblot參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(羅氏)，封閉液用3%的BSA，一抗(His-TagMonoclonalAntibody,MERCK)稀釋2000倍，將膜至于一抗稀釋液中室溫下孵育3_4h后，用用TBST在室溫下脫色搖床上洗3-4次，每次lOmin，加入到適當(dāng)體積的二抗(羊抗鼠IgG-HRP，天根生物)溶液中，室溫室溫下孵育3-4h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次lOmin。用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生物)進(jìn)行顯色。結(jié)果表明，出現(xiàn)了60KD和90KD兩條明顯的雜交信號(hào)，進(jìn)一步說(shuō)明表達(dá)出的條帶就是目標(biāo)蛋白(圖3)。8(三)GBNBS基因原核表達(dá)產(chǎn)物的功能分析將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體P3161和NB⑶的菌液離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白位于包含體中。必須將包含體裂解并將目的蛋白復(fù)性才能獲得有活性的目的蛋白。將IOOmL菌液離心，收集菌體并用一系列buffer洗滌包含體，具體步驟參照Tamelingetal(2002)的方法進(jìn)行。用含有8M尿素的buffer溶解包含體。用特異性吸附His標(biāo)簽的鎳柱將目的蛋白純化，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(Ni-NTAHis·BindResins，Merck，德國(guó))。將用鎳柱純化后的目的蛋白用透析袋(上海生工)進(jìn)行復(fù)性處理。將目的蛋白置于透析袋中，分別用含有6M，4M，2M,IM和OM尿素的緩沖液進(jìn)行復(fù)性，每種濃度復(fù)性時(shí)間超過(guò)8h。將復(fù)性得到的蛋白做功能分析，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(超微量ATP酶試劑盒，南京建成生物工程研究所購(gòu)買)。樣品分別為空載體PET32(C)(MERCK)，含有部分片段的NBCD和全長(zhǎng)片段的P3161，反應(yīng)時(shí)間分別為15min，30min，60min，并設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為Omin的對(duì)照。結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間為15minP3161的ATP酶活力為1.58U/mgprot,而NBCD活力僅為0.lU/mgprot；反應(yīng)時(shí)間為30minP3161的ATP酶活力為1.63U/mgprot,而NBCD活力僅為0.66U/mgprot；反應(yīng)時(shí)間為60minP3161的ATP酶活力為2.42U/mgprot,而NBCD活力僅為0.40U/mgprot(圖4)。因此，GBNBS完整基因具有ATP酶活力，去除LRR區(qū)域的基因片段喪失了大部分酶活。(四)GNBS-YFP在洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)構(gòu)建35SGNBS-YFP表達(dá)載體對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)來(lái)檢測(cè)GBNBS基因的亞細(xì)胞定位。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)參照Varagonaetal.(1992)進(jìn)行。用引物xBFN56:5，GGTCTAGAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAGC3，，RxbnM:5’GATCTAGAAAATGTATTTGGACTTCACATCG3’擴(kuò)增海島棉的cDNA。將PCR產(chǎn)物(SEQIDNO.1)和載體P35S-YFP(CL0NTECH)分別用XbaI進(jìn)行酶切，回收相應(yīng)的目的片段并用T4DNAIigase連接。DNA的金粉包埋按照BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem的方法(XUSP,WEIZM.Introductiontomethodofmicroprojectilebombardmentanditsapplication.PlantPhysiologyCommunications,1998,34(1)41-43).具體操作為將洋蔥表皮細(xì)胞剝離并放置在濕濾紙上，將約Iyg/μL的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒5μL與50μL金粉(Bio-RAD，美國(guó))懸浮液在懸浮狀態(tài)下包被，同時(shí)依次加50μL2.5ΜCaC12,20yL0.IM亞精胺，離心，無(wú)水乙醇洗滌沉淀，重新懸浮沉淀于50μL無(wú)水乙醇中。利用基因槍(PDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem,Bio-Rad，加拿大)將包被質(zhì)粒的金粉打進(jìn)洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，可裂膜壓力為1.3kPa，28°C暗培養(yǎng)824h，先在萊卡激光共聚焦顯微鏡下壓片尋找能激發(fā)熒光區(qū)域，然后在壓片中用30%蔗糖溶液置換水，約35min后再放置在激光共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。結(jié)果表明，在細(xì)胞膜周圍有一圈明顯的熒光信號(hào)，因此確定GBNBS基因是一個(gè)膜周蛋白。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，熒光信號(hào)在胞間連絲處最強(qiáng)(圖5)。胞間連絲(plasmodesma)是穿越細(xì)胞壁，連接相鄰細(xì)胞原生質(zhì)(體)的管狀通道。胞間連絲運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)不僅包括一些諸如礦質(zhì)離子、糖、氨基酸和有機(jī)酸等小分子物質(zhì)，而且含有諸如蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)。另外，胞間連絲還是病毒侵染的必要通道。植物病毒需要從一個(gè)感染細(xì)胞移到鄰近的細(xì)胞中，然后從一個(gè)感染器官轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器官。由于細(xì)胞壁是阻止病毒胞間移動(dòng)的障礙，所以它必須借助胞間連絲從一個(gè)細(xì)胞移到另一個(gè)細(xì)胞，并利用韌皮部運(yùn)輸從一個(gè)器官到另一個(gè)器官。(五)構(gòu)建GBNBS基因過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥用HindIII-EcorI雙酶切PWMlOl(南京助研生物)，獲得的含有CaMV35S啟動(dòng)子片段與對(duì)應(yīng)酶切過(guò)的PCAMBIA2301(CAMBIA)連接，構(gòu)建成新的植物表達(dá)載體QVB。用含有SalI和XbaI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物xBFN565'-GGTCTAGAAAAAGTTAGGGAGGATGGAAGC-3‘禾口Ansal42215'-CAGTCGACAGATGCCTTCAATAAAGAAGCCACTC-3‘?dāng)U增海島棉的cDNA。獲得的GBNBS基因序列與載體QVB分別用SalI和XbaI酶切，回收相應(yīng)的目的片段并用T41igaSe連接。將以上獲得的含有CaMV35S啟動(dòng)子和GBNBS基因片段連接獲得重組載體，命名為QVB-35S-GBNBS，用凍融法將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。用花浸染方法(CloughSJ，BentAF.Floraldip:ASimplifiedMethodforAgrobacterium-MediatedTransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ1998；16735-743)轉(zhuǎn)化擬南芥，分單株收獲擬南芥種子。將所有種子在含有40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選綠色植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)。用PCR方法進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。收獲轉(zhuǎn)基因工程植株種子。將轉(zhuǎn)基因工程植株種子播種于含有40mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基。挑選綠色植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)并用于基因功能以及特征研究。六擬南芥轉(zhuǎn)化株中相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)變化R基因和avr基因識(shí)別后，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)一系列抗病防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)，產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性(systemicacquiredresistance，SAR)。植物產(chǎn)生SAR后，抗病防衛(wèi)反應(yīng)中表達(dá)的基因主要是編碼病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedproteins,PRs)和植保素合成相關(guān)酶基因。所以R基因的過(guò)量表達(dá)往往會(huì)造成相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。根據(jù)GenBank中擬南芥的幾個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)引物PR1F5‘GGAGCTACGCAGAACAACTAAGA3‘，PRlR5‘CCCACGAGGATCATAGTTGCAACTGA3‘檢測(cè)PRl基因(登錄號(hào)At2gl4610)的表達(dá)情況；ChiF5‘CTACCACTACCATCATGGC3',ChiR5'GTGCTGTAGCCCATCCACCTG3'檢測(cè)幾丁質(zhì)酶(登錄號(hào)At3gl2500)的表達(dá)情況。根據(jù)β-Tubulin設(shè)計(jì)內(nèi)參引物TubF:5'GAGGGAGCCATTGACAACATCTT3'，TubR5'GCGAACAGTTCACAGCTATGTTCA3'。用Trizol(invitrogen)提取擬南芥葉片總RNA，總RNA提取后用RQlDNAase(Promega，America)消化污染的DNA。用OligodT將各個(gè)器官的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板備用。電泳結(jié)果表明，PRl表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中并沒(méi)有明顯上升，而幾丁質(zhì)酶表達(dá)量則明顯增加(圖6)。說(shuō)明幾丁質(zhì)酶為GBNBS基因的下游防衛(wèi)基因，GBNBS的過(guò)量表達(dá)可以有效地誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)基因的表達(dá)。序列表<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>棉花抗病相關(guān)基因GBNBS及其應(yīng)用<130>說(shuō)明書<140>00<141)2009-09-20<160>12<170>PatentInversion3.110tatttgaagttgaataatcctaatttgagcagtcttcctcgcatcttgttcagtctccctI8600097]aatttaatgacacttgatattaaaaacacttgtgttatacttccatgcttgcctagtggg19200098]atttggaaaatgcagaacttaaggcatcttttgttacctccacataccacgttgcctaaa19800099]tgtcctgatcatcaaactcgtttatggcatctacaaactctttcaacaataactcctaat20400100]gaggacactgcagcactcatctttggttctaagtttccgagcttgattaagttgacttta21000101]aatagtcaaaacatggagcagacaaagagatgtttggaatggctctacaagttggattgt21600102]taaagattatcaatccaactaagtttccaacagcaaggacatcattccca22200103]gcaagtcttgttaaggtaagcttggtgaaaaccgacctagttgctgatgatgtaatgaaa22800104]atgctggagtgtttggatcaccttcaggtcttgaaactgctaaaaaagtccattagggga23400105]cccaagctggaaatgacacccaactcatttcctcaactcagattccttttcatggaagaa24000106]atacttgttaaaacatggaggatgggtgatgaagccatgggcagccttgaagacttgacc24600107]attactcgttgccatgaactagaatcacttccaaagcagctttggcaactccataacata25200108]cgccaggtaaaggtgaattctccctctcaatgcttgagacgagagcttgagcaaccaagt25800109]gtgcagcgatgtgaagtccaaatacatttttgatgacaagaagagtggcttctttattga26400110]aggcatctaatcagtcaaattaatcatttttctaattttcttttttattttgtatgttat27000111]atcctgatatatattatcgaagagtggtttggattgtctacttaatttatctttgtttcg27600112]attatcaattaatcgaatagattttatacagcgatgaaaa28200113]&￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡laa28420114]<210>20115]<211>340116]<212>DNA0117]〈213〉人工0118]〈220〉0119]<221>SNsall5820120]〈222〉⑴(34)0121]〈223〉0122]<400>20123]gagtcgacgactaaaaagttagggaggatggaag340124]<210>30125]<211>340126]<212>DNA0127]〈213〉人工0128]〈220〉0129]<221>Ansal42210130]〈222〉⑴(34)0131]〈223〉0132]<400>30133]cagtcgacagatgccttcaataaagaagccactc340134]<210>4<211>34<212>DNA<213>人工<220><221>Antixhol368<222>(1)..(34)<223><400>4cactcgaggcttttgacctcattgtgtcttctat34<210>5<211>30<212>DNA<213>人工<220><221>xBFN56<222>(1)..(30)<223><400>5ggtctagaaaaagttagggaggatggaagc30<210>6<211>31<212>DNA<213>人工<220><22l>RxbnN4<222>(1)..(31)<223><400>6gatctagaaaatgtatttggacttcacatcg31<210>7<211>23<212>DNA<213>人工<220><221>PR1F<222>(1)..(23)<223><400>7ggagctacgcagaacaactaaga23<210>8<211>26<212>DNA<213>人工<220><221>PR1R<222>(1)..(26)<223><400>8cccacgaggatcatagttgcaactga26<210>9<211>19<212>DNA<213>人工<220><221>ChiF<222>(1)..(19)<223><400>9ctaccactaccatcatggc19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工<220><221>ChiR<222>(1)..(21)<223><400>10gtgctgtagcccatccacctg21<210>11<211>23<212>DNA<213>人工<220><221>TubF<222>(1)..(23)<223><400>11gagggagccattgacaacatctt23<210>12<211>24<212>DNA<213>人工<220><221>TubR<222>(1)..(24)<223><400>12gcgaacagttcacagctatgttca241權(quán)利要求棉花抗病相關(guān)基因GBNBS，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；2)可與序列表中SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，與序列表中SEQIDN0.1限定的DNA序列雜交的條件為0.IXSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因編碼一個(gè)CC-NBS-LRR蛋白，該蛋白具有ATPase活性。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因在細(xì)胞膜周圍表達(dá)，特別是在胞間連絲處表達(dá)最強(qiáng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因過(guò)量表達(dá)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)相關(guān)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量增加。6.含有權(quán)利要求15之一所述基因的表達(dá)載體。7.含有權(quán)利要求15之一所述基因的宿主菌。8.權(quán)利要求15之一所述基因在植物抗性改良中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明涉及棉花抗病相關(guān)基因GBNBS及其應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。GBNBS基因是從抗枯黃萎病材料海島棉中獲得的一個(gè)CC-NBS-LRR基因，其編碼蛋白含有861個(gè)氨基酸。分別構(gòu)建了GBNBS基因全長(zhǎng)以及去除LRR區(qū)域基因片段的原核表達(dá)載體，能夠分別誘導(dǎo)表達(dá)出90KD和60KD的目的蛋白，功能分析發(fā)現(xiàn)90KD蛋白具有ATP酶活力，但是60KD蛋白卻喪失了大部分酶活。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，GBNBS是一個(gè)膜周蛋白，特別是在胞間連絲處大量聚集。GBNBS的過(guò)量表達(dá)造成轉(zhuǎn)化株中防衛(wèi)基因幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量明顯增加，為獲得抗病基因工程植株奠定基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/55GK101870982SQ200910036109公開日2010年10月27日申請(qǐng)日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日發(fā)明者倪萬(wàn)潮,姚姝,張保龍,徐英俊,楊郁文,沈新蓮,高媛媛申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院