專利名稱：具有高產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
具有高產(chǎn)P-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法，本發(fā) 明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變
方法改善環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)的產(chǎn)物特異性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)糊精是由六個以上葡萄糖連結(jié)而成的具有環(huán)狀疏水圓錐形結(jié)構(gòu)的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 (3-、 Y-環(huán)糊精，它們分別由6、 7、 8 個葡萄糖單元構(gòu)成。目前，環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，即在CGT酶 催化作用下，通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。由于環(huán)糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì)如溶解度、穩(wěn) 定性等，因此在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化 學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應(yīng)..三種轉(zhuǎn)糖基化反 應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng))和水解反應(yīng)。CGT酶通過環(huán)化反應(yīng)能利用 淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精，這是其工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。用CGT酶生產(chǎn)環(huán)糊精一個主要的不 利條件是所有己知的野生型CGT酶生產(chǎn)的是a-、 P-、 Y-環(huán)糊精的混合物。這不 僅給產(chǎn)物的分離純化帶來很大不便，而且提高了成本。
本發(fā)明主要是對來源于軟化類芽孢桿菌Peam'6ac/〃w macera似JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)的CGT酶進(jìn)行了產(chǎn)物特異性的定點(diǎn)突變改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供提高i3 macera"s JFB 05-01 CGT酶產(chǎn)P-環(huán)糊精能力的 突變方案。
本發(fā)明的再一個目的是提出具有更高P-環(huán)糊精生產(chǎn)能力的突變體酶K47R， K47H， K47T，及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案來源于軟化類芽孢桿菌(尸e朋沾ac/〃w w"cera似)JFB 05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱CGT酶，的三種突變體酶K47R， K47H 及K47T，將CGT酶基因中第47位的賴氨酸Lys分別變成了精氨酸Arg，組氨 酸His或蘇氨酸Thr，分別命名為K47R， K47H及K47T，它們相比于野生型CGT 酶具有更高的產(chǎn)P-環(huán)糊精能力。
軟化類芽孢桿菌(尸eam'6ad〃ws maceram) JFB 05-01 (CCTCC NO: M 208063)，已在中國專利CN101294149A公開，
公開日2008年10月29日。所述的三種突變體酶K47R， K47H及K47T的制備方法，根據(jù)A w"ceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設(shè)計并合成引入Arg47， His47， Thr47密碼子 的定點(diǎn)突變引物，對基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，分別鑒別出Lys47密 碼子變成Arg47密碼子，His47密碼子及Thr47密碼子的突變體，并在大腸桿菌 BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。
(1) 定點(diǎn)突變
利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體c^/pET-20b(+)為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變，
引入Arg47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變堿基)， 反向引物5'-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，(下劃線為突變堿基)，
引入His47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變堿基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3，(下劃線為突變堿基)，
弓i入Thr47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變堿基)， 反向引物5'- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG -3'(下劃線為突變堿基)， PCR反應(yīng)體系均為10x五x buffer 5 |iL， dNTPs (2.5 mM) 5 (iL，正向引
物(10 pM) lpL，反向引物(10 pM) lpL，模板DNA 1 pL，五x &《HS (5 U小L)
0.25 nL，加入雙蒸水至50pL。
PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4min;隨后進(jìn)行35個循環(huán)(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最后72。C保溫10 min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)I (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109
感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含100 pg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜
后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100嗎/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，
將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所有突變質(zhì)粒均測
序正確。
(2) 突變體的表達(dá)與純化
挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 )xg/mL氨芐青霉素)生長8 10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基 (含100 pg/mL氨芐青霉素)；大腸桿菌在30 。c搖床培養(yǎng)至OD6qq=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25t:搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時后， 將發(fā)酵液于4 。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液并純化，分別得 到突變體酶K47R， K47H和K47T制品。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建了三個有意義的突變體，均實(shí)現(xiàn)了P-環(huán)糊精 產(chǎn)物特異性的提高，比野生型CGT酶更利于P-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。
5

圖1野生型和突變型CGT酶的三種環(huán)糊精產(chǎn)量。A、野牛型CGT酶 B、突變體酶K47R; C、突變體酶K47H; D、突變體酶K47T。其中4表示a-環(huán) 糊精；國表示P-環(huán)糊精；A表示Y-環(huán)糊精。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:本實(shí)施例說明突變體酶K47R， K47H及K47T的制備。
1) 定點(diǎn)突變
利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cg/pET-20b(+)為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變，
引入Arg47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3'(下劃線為突變堿基)， 反向引物5'-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，(下劃線為突變堿基)，
引入His47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG -3 ，(下劃線為突變堿基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3,(下劃線為突變堿基)，
引入Thr47密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5' - CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變堿基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG誦3，(下劃線為突變堿基)， PCR反應(yīng)體系均為lOx五x 72^ buffer 5 jxL， dNTPs (2.5 mM) 5 (iL，正向引
物(10 ^M) l|iL，反向引物(10 jaM) l|iL，模板DNA 1 (iL，五jc 7bg HS (5 U/|iL)
0.25 jiL，加入雙蒸水至5(HiL。
PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4min;隨后進(jìn)行35個循環(huán)(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最后72。C保溫10 min。
三種PCR產(chǎn)物分別經(jīng)Z)/7wI (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉(zhuǎn)化大腸
桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含100 pg/mL氨芐青霉
素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 )ag/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，
后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所有
突變質(zhì)粒均測序正確。
2) 突變體的表達(dá)與純化
挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 [ig/mL氨芐青霉素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基 (含100 [ag/mL氨芐青霉素)。大腸桿菌在30 。C搖床培養(yǎng)至OD6()Q=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25。C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時后， 將發(fā)酵液于4 。C、 10000 rpm離心20min除菌體，分別收集上清液。
6上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20 min， 取沉淀物用適量含20 mM磷酸鈉、0.5 M氯化鈉和20 mM咪唑、pH 7.4的緩沖 液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成卜.樣樣品； Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入M柱，使之完全吸附后，分別 用緩沖液A、含20-480 mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A洗脫， 流速lmL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含CGT酶酶活的洗脫液；活力 組分在50 mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化突變體酶 K47R， K47H及K47T。
實(shí)施例2:本實(shí)施例說明酶活分析。
1) 酶活測定方法
甲基橙法測定a-環(huán)化活力的方法取適當(dāng)稀釋的酶液O.lmL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3M(w/v)可溶性淀粉溶液中，在 40。C下反應(yīng)10min后，加入1.0 mL l.ON的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0 mL用 50mM磷酸緩沖液配制的0.1 mM甲基橙，在16"C下保溫20min，在505nm下
測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1 pmol a-環(huán)糊精所 需的酶量。
酚酞法測定P-環(huán)化活力的方法取適當(dāng)稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL 預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3。/。(w/v)可溶性淀粉溶液的試管中， 在40。C下反應(yīng)10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mMNa2C03溶 液配制的0.02。/。(w/v)酚酞停止反應(yīng)，在室溫下保溫20min，在550nm下測定吸 光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成liamol卩-環(huán)糊精所需的酶
溴甲酚氯法測定Y-環(huán)化活力的方法取適當(dāng)稀釋的酶液O.l mL，加入裝有 0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3。/。(w/v)可溶性淀粉溶液的試 管中，在40。C下反應(yīng)10min后，加入50|nL l.ON的鹽酸停止反應(yīng)，再加入2 mL 0.2 M檸檬酸緩沖液(pH 4.2)和lOO)iL 5 mM溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫 20min，在630nm下測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成 lpmol Y-環(huán)糊精所需的酶量。
2) 酶活比較
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表l。野生型CGT酶有更高的a-環(huán)化活力，與野生型相比， 突變體酶K47R的a-環(huán)化活力降低了 13%，卩-環(huán)化活力增加至1.5倍；突變體酶 K47H的a-環(huán)化活力降低了 34%， (3-環(huán)化活力增加至2.2倍；K47T的P-環(huán)化活 力顯著升高，(3-環(huán)化活力高于a-環(huán)化活力。突變體酶K47R， K47H， K47T的總 環(huán)化活力有所下降。而且，突變體酶K47R， K47H， K47T的(3-環(huán)化活力占總環(huán) 化活力的比例高于野生型酶。表l
a-環(huán)化活力(3-環(huán)化活力Y-環(huán)化活力總活力
鵬(U/mg)(U/mg)(U/mg)(U/mg)
野生型190.432.21.1223.7
K47R165.546.62.0214.1
K47H125.871.92.4200.1
K47T88.195.52.2185.8
實(shí)施例3:本實(shí)施例說明HPLC方法分析環(huán)糊精生成量。
配制5%(濕基，含水量8%， w/v)可溶性淀粉溶液作為底物，5g淀粉溶解在 90mL磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，定容至100mL，在沸水屮煮沸30min。分別加入 一定量的野生CGT酶、突變酶K47R、 K47H、或K47T使反應(yīng)體系中酶活為0.2 U/mL，置于40 "C下反應(yīng)40h，隔時間取樣600pL, 12000 rpm離心10 min，取 上清500(iL，加5pL糖化酶(70U/mL)，在30 。C糖化lh， 10min煮沸滅活，12000 rpm離心30min，取上清經(jīng)0.45pm超濾膜過濾后取20(iL上HPLC分析。
反應(yīng)液中a-, P-，和Y-環(huán)糊精的濃度采用HPLC測定，采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物 分析的色譜條件是Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進(jìn)樣器，色譜柱 Lichrosorb NH2 (4.6 mmxl50 mm)， Waters2410示差檢測器；流動相(V/V)為65% 乙腈水溶液，流速lmLmin";柱溫30 °C。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖1，將上述突變體表達(dá)獲得的突變體純酶制品與野生型純酶 制品相比，可以發(fā)現(xiàn)，突變體K47R， K47H， K47T實(shí)現(xiàn)了P-環(huán)糊精生產(chǎn)能力的 提高。表2可以看出，通過40h培養(yǎng)后，與野生型相比，這三個突變體的(3-環(huán)糊 精產(chǎn)量分別增加了4%， 8%及13%，而a-環(huán)糊精產(chǎn)量降低了 11%， 21%及34%。
表2
酶淀粉轉(zhuǎn)化率(％)a產(chǎn)物(g/l)(%) P
野生型42.37.6 (41.8)9.9 (54.4)0.69 (3.8)
K47R41.56.8(38.1)10.3 (57.7)0.75 (4.2)
K47H40.56.0 (34.4)10.7 (61.4)0.72 (4.1)
K47T39.35.0 (29.6)11.2 (66.4)0.68 (4.0)
8序列表
<210> SEQIDNO:l
正向引物5，誦CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG墨3'， 反向引物5， -CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，，
<210〉 SEQIDNO:2
正向引物5， -CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3，， 反向引物5， -CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3，，
<210> SEQIDNO:3
正向引物5，誦CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3，， 反向引物5， - CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3，。
權(quán)利要求
1、來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱CGT酶，的三種突變體酶K47R，K47H及K47T，其特征是將CGT酶基因中第47位的賴氨酸Lys分別變成了精氨酸Arg，組氨酸His或蘇氨酸Thr，分別命名為K47R，K47H及K47T，它們相比于野生型CGT酶具有更高的產(chǎn)β-環(huán)糊精能力。
2、 權(quán)利要求1所述的三種突變體酶K47R， K47H及K47T的制備方法，其 特征在于根據(jù)P waceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設(shè)計并合成引入 Arg47, His47或Thr47密碼子的定點(diǎn)突變引物，對基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA 序列，分別鑒別出Lys47密碼子變成Arg47密碼子，His47密碼子及Thr47密碼 子的突變體，并進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。
3、 權(quán)利要求2所述的突變體酶K47R， K47H及K47T的制備 (1)定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cg/pET-20b(+)為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變， 引入Arg47密碼子的定點(diǎn)突變引物為下劃線為突變堿基， 下劃線為突變堿基，下劃線為突變堿基， ,下劃線為突變堿基，下劃線為突變堿基，正向引物5 ，- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3,，反向引#勿5 ，-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3'， 引入His47密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向引物5 ， - CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG陽3 ，，反向引物5 ， - CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3 ， 弓I入Thr47密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向引物5 ， - CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG隱3 ，，反向引物5，- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG -3，，下劃線為突變堿基，PCR反應(yīng)體系均為10x￡:c buffer5 |aL， 2.5 mM dNTPs 5 ^L， 10 iaM正向 引物lpiL， 10 iiM反向引物l(iL，模板DNAlnL， 5 U L五:c %《HS 0.25 (^L，加入雙蒸水至50hL;PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4 min;隨后94。C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 6 min 進(jìn)行35個循環(huán)；最后72。C保溫10min;PCR產(chǎn)物經(jīng)Z^wI消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在 含100嗎/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于含100 pg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá) 宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所有突變質(zhì)粒均測序正確； (2)突變體的表達(dá)與純化挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 pg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基生長8 10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100嗎/mL 氨卞青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在3(TC搖床培養(yǎng)至OD6(X)=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25"C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時后， 將發(fā)酵液于4。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液并純化，分別得 到突變體酶K47R， K47H及K47T制品。
全文摘要
具有高產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法提高一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶)產(chǎn)β-環(huán)糊精能力，提供了提高來源于Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NOM 208063)的CGT酶產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶的47位的Lys分別替換成Arg，His及Thr，獲得的三種突變體酶K47R，K47H，K47T，它們的β-環(huán)糊精生產(chǎn)能力較野生型CGT酶有所提高；其中，突變體酶K47T尤為顯著。這些突變體酶比野生型CGT酶更利于β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/10GK101503680SQ20091002915
公開日2009年8月12日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者敬 吳, 張佳瑜, 李兆豐, 堅 陳 申請人:江南大學(xué)