專利名稱：青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng)用，屬于基因工程 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絕大多數(shù)的革蘭氏陰性細(xì)菌的基因簇能在非寄主植物上引起過敏性反應(yīng)，而在 寄主植物上表現(xiàn)出致病性。/z^基因的產(chǎn)物在其表達(dá)及分泌過程中起著調(diào)控作用。如 ￡>vWw'a amylovora的HrpN， 尸化i^o附owa syringae的HrpZ以及i a/5tom》so/朋acear訓(xùn) 的PopA類似的Harpin蛋白已經(jīng)被鑒定出來，它們能夠通過三型泌出系統(tǒng)分泌到胞外引 起非寄主植物發(fā)生過敏性反應(yīng)，是一類富含甘氨酸和絲氨酸，缺少半胱氨酸并且耐熱的 一種蛋白，在氨基酸序列上沒有相似性。
青枯病菌能夠在全世界范圍引起數(shù)百種農(nóng)作物的發(fā)生萎蔫，包括番茄、馬鈴薯、煙 草、花生和香蕉等。病菌通過寄主根部傷口侵染進(jìn)入木質(zhì)部，然后快速擴(kuò)散到整個植 株。其致病機(jī)理是產(chǎn)生大量的胞外多糖以堵塞到管系統(tǒng)從而阻止植物水分的輸送。在模 式菌株GMI1000,三個胞外蛋白PopAl，PopB禾卩PopC已經(jīng)被鑒定出來。PopAl,是一 個通過三型泌出系統(tǒng)分泌到胞外的蛋白，同時缺少N-末端92個氨基酸的PopAl衍生物 PopA3也已經(jīng)從生長在營養(yǎng)貧瘠培養(yǎng)基的上清液中純化出來。PopAl禾卩PopA3均能引 起矮牽?；ǖ倪^敏性反應(yīng)。/w;^位于青枯菌/^;7基因簇上游2 kb，其表達(dá)受基 因的調(diào)控。Arlat小組從青枯菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了新蛋白PopB和P叩C， P叩B蛋白 由173個氨基酸組成，含有兩個核定位信號；PopC長1024個氨基酸，其中含有22個亮 氨酸拉鏈。p印凡po/7C，以及po;^都是同時受調(diào)控的.在剛果紅的誘導(dǎo)下，他 們發(fā)現(xiàn)PopB和P叩C是通過//rp系統(tǒng)分泌到胞外的。
本發(fā)明從青枯菌中克隆到一個新的Harpin蛋白PopW，并對其特點進(jìn)行了分析。該 蛋白類似五.fl，/ovora的HrpN ， HrpW以及青枯菌的PopA，能夠在煙草上引起過敏性 反應(yīng)，在溫室條件下，能誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的侵染。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于公開一種青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng) 用，屬于基因工程領(lǐng)域，該基因能誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的侵染，提高植物抗病能力， 從而進(jìn)行生物農(nóng)藥的研發(fā)。 技術(shù)方案
1) p印『基因的克隆
青枯菌ZJ3721在30。C條件下培養(yǎng)于MBG培養(yǎng)基，待菌株生長到對數(shù)期，按照細(xì)菌 基因組提取試劑盒操作說明提取青枯菌基因組DNA; 設(shè)計擴(kuò)增po戶『基因引物popWl:
上游引物F: CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGCAWe I 下游引物R: GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG ///"dill
或擴(kuò)增jW/ 『基因引物popW2:上游引物F: ATG TCC ATC CAG ATTGATCGC 下游引物R: GCCCGAGTAGGCCTTGTAG
或擴(kuò)增/wp『基因引物popW3:
上游引物F: TCTAGAATGTCCATCCAGATTGATCGC 乃a I 下游引物R: GGATCCGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT5a附H I 以基因組DNA為模板，使用高保真pfo聚合酶擴(kuò)增尸op『的編碼區(qū)序列，擴(kuò)增程
序為94 'C預(yù)變性4 min， 94 'C變性30 s, 60 'C復(fù)性1 min， 72 T延伸1 min， 30個循
環(huán)后，72°C10min，產(chǎn)物切膠回收； 2) PopW蛋白的表達(dá)及純化
產(chǎn)物切膠回收后加A后連接至中間載體酶切或直接酶切后連接至蛋白表達(dá)載體 pET30a(+)載體，測序鑒定，得到重組質(zhì)粒pET-/w; 『，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 中進(jìn)行蛋白表達(dá)，將篩選到的陽性克隆接種到含有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C， 180 轉(zhuǎn)/分條件下培養(yǎng)過夜，第二天按1:100的比例接種到10mLLB中，按照上述條件培養(yǎng)3 個小時，然后加入誘導(dǎo)劑異丙基-卩-D硫代半乳糖苷使其終濃度為1 mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 個小時后，在4'C下，6000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，將其懸浮于20 mM Tris-HCl 、 pH 8.0，加入終濃度為lmM的苯甲基磺酰氟，然后超聲波破碎儀上進(jìn)行菌體破碎，當(dāng)菌液 變澄清時，離心吸取上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測檢測，并用鎳柱純化PopW蛋 白，具體操作參照High-Affinity Ni-IDA Resin操作說明書進(jìn)行，獲得純化PopW蛋白。 以上獲得的純化PopW蛋白可以在植物抗病性方面得到應(yīng)用。 有益效果
1、 本發(fā)明公開了一種青枯菌i 6^『基因及其所編碼的蛋白質(zhì)。在與植物互作的過程中， PopW定位于植物的細(xì)胞壁，為研究青枯菌與寄主的互作提供了理論模式。
2、 本發(fā)明人獲得的PopW是一種耐熱的harpin蛋白，能夠引起煙草發(fā)生過敏性反應(yīng)， 是青枯菌中發(fā)現(xiàn)的第二個harpin蛋白。
3、 本發(fā)明獲得的PopW處理煙草，可以誘導(dǎo)煙草抵抗煙草花葉病毒的侵染，而且抗性 不僅限于P(^pW處理的葉片，也包括其周圍的葉片，并且該過程當(dāng)中伴隨著PR-1基 因的表達(dá)。說明PopW可以誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)獲得抗病性。這說明PopW具有開發(fā)成生 物源農(nóng)藥的價值。


圖l.PopW蛋白表達(dá)(A)與純化(B)結(jié)果。
M為蛋白marker (SM0431， MBI) ， 1、 2和3是三個不同的克隆的表達(dá)結(jié)果，B圖是
PopW經(jīng)純化后的結(jié)果。
具體實施例方式
青枯菌(i afatom'a w/awaceawm)ZJ3721 (青枯菌ZJ3721和胞外蛋白基因Po/ ^ 的DNA序列公開見登錄號EF080949; http:〃www.ncbi.nl:m.nili.gov/entrez/viewer.fcgi db =nuccore&id =117168855)在30。C條件下培養(yǎng)于MBG培養(yǎng)基(0.5。/。蛋白胨，0.1%酪 蛋白水解物,0.1%酵母提取粉,0.1%葡萄糖和1.6%瓊脂)，待菌株生L《到對數(shù)期， 提取基因組DNA (Axyprep Bacterial Genomic DNAkit，杭州)。根據(jù)模式菌青枯菌 GMI1000全基因組序列設(shè)計引物popW2:
4上游引物popW2F: ATGTCCATCCAGATTGATCGC， 下游弓I物popW2 R: GCCCGAGTAGGCCTTGTAG
以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94'C預(yù)變性4min， 94'C變 性30s, 58。C復(fù)性lmin， 72 。C延伸l min， 30個循環(huán)后，72。C10min，用1%的瓊脂糖 電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1143bp，按照Agarose Gel DNA Purification KiT(TaKaRa， Dalian) 手冊進(jìn)行回收。然后將回收到的產(chǎn)物4 |JL連接至載體pMD19-T上，在16。C反應(yīng)16小 時后，用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，挑取陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果表 明青枯菌ZJ3721胞外蛋白基因Po; 『的完整編碼區(qū)為1143bp;
根據(jù)青枯菌ZJ3721胞外蛋白基因Po; 『的DNA序列全長編碼序列，設(shè)計兩端分 別加酶切位點的引物popWl:
上游引物popWlF: CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC， (iVcfel ) 下游弓l物popWlR: GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG (^/"d III) 以實施例1中獲得的基因組DNA為模板，使用高保真pfu DNA聚合酶擴(kuò)增尸^『 的編碼區(qū)序列，擴(kuò)增程序為94。C預(yù)變性4min， 94 。C變性30 s， 60 。C復(fù)性1 min， 72 。C延伸1 min， 30個循環(huán)后，72 °C 10 min， 產(chǎn)物大小為1143bp，末端加A后將其克隆 至中間載體pMD19-T，利用引入的A^fe I和///wd III酶切位點進(jìn)一步克隆至蛋白表達(dá)載 體pET30a(+)載體，測序鑒定，得到重組質(zhì)粒pET-Po/ 『，然后轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)中 進(jìn)行蛋白表達(dá)，將培養(yǎng)好的含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)離心收集菌體，將 其懸浮于20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，加入終濃度為lmM的蛋白酶抑制劑PMSF，在超聲 波破碎儀上進(jìn)行蛋白破碎，然后提取蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用鎳柱純化 PopW蛋白，得到蛋白濃度為60lJg/ml (圖l)。
根據(jù)青枯菌ZJ3721胞外蛋白基因Pop『的DNA序列，見SEQIDNO. 1的全長編 碼序列，設(shè)計兩端分別加酶切位點的引物p叩W3:
上游引物popW3F: TCTAGAATGTCCATCCAGATTGATCGC朋fl I) 下游引物popW3R: GGATCCGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT ( fia挑H I) 以獲得的基因組DNA為模板，使用高保真pfu聚合酶擴(kuò)增不含有終止密碼子的 尸c^『的編碼區(qū)序列，擴(kuò)增程序為94 'C預(yù)變性4min， 94 T變性30 s， 60"C復(fù)性1 min， 72 。C延伸1 min， 30個循環(huán)后，72 。C 10min， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1140bp。利用引入 的Jfta I和BflmH I酶切位點進(jìn)一步克隆至攜帶綠色熒光蛋白基因的植物表達(dá)載體 pBI121-GFP (Andreeva A. V.， Kutuzov M. A. 2001. Nuclear localization of plant protein Ser/Thr phosphatase PP7. Afo/. Ce〃說'o/. Cowww". 4, 345—352 )， 構(gòu)建成
pBI121-PopW: GFP融合載體；然后通過農(nóng)桿菌LBAMO4 (購買)轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞， 當(dāng)在28。C培養(yǎng)24h后，我們用熒光顯微鏡觀察基因的表達(dá)情況。整個細(xì)胞被綠色熒光 所包圍，為了排除該綠色熒光不是定位在細(xì)胞膜上，我們用1M的蔗糖溶液處理洋蔥表 皮已使它發(fā)生質(zhì)壁分離，在質(zhì)壁分離的細(xì)胞中，GFP信號仍和正常細(xì)胞當(dāng)中一樣緊緊包 圍在細(xì)胞壁。然而在空載體對照當(dāng)中，熒光信號存滿整個細(xì)胞質(zhì)，說明該基因定位于細(xì) 胞壁。
以上述獲得的PopW蛋白，濃度2 25 pg/ml，用無頭的注射器向煙葉草背面細(xì)胞間隙注射，24小時之內(nèi)觀察到了煙草的過敏性反應(yīng)，壞死斑直徑大小約lcm。同時PopW引 起過敏性反應(yīng)的功能具有耐熱性U00。C, 10min)。.
以上述獲得的PopW蛋白，濃度為20pg/ml，噴于煙草的葉片，用不含P叩W的 滅菌水作為對照處理。兩天以后，采用摩擦接種的方法分別對噴過P叩W的葉片及其上 面和下面的兩片葉片接種煙草花葉病毒，每個處理3個重復(fù)。在本實驗之前，我們確定 煙草花葉病毒的用量是能在每片沒接種PopW葉子上引起200個左右的病斑。4天以后 我們觀察病斑的數(shù)目及直徑，通過病斑的減少量來計算抑制率。發(fā)現(xiàn)，在PopW處理 的葉片及其上面的兩個葉片上，抑制率可達(dá)94.74-97.40% ，而在處理葉片的下面兩個 葉片抑制率達(dá)到93%，除了病斑數(shù)的減少，和沒有處理的空白對照相比，PopW處理過 的病斑直徑明顯變小，說明PopW能夠引起煙草的系統(tǒng)抗性，從而有效地抑制煙草花葉 病毒的侵染。
以上實施例表明本發(fā)明中克隆的一種青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW，它具有 Harpin的特征，包括氨基酸的組成，熱穩(wěn)定性，蛋白酶敏感以及在SDS-PAGE上遷移 較慢等特性，PopW全長和其N末端harpin區(qū)都能引起HR反應(yīng)。本發(fā)明人提供的 PopW是一種耐熱的harpin蛋白，能夠引起煙草發(fā)生過敏性反應(yīng)，是青枯菌中發(fā)現(xiàn)的第 二個harpin蛋白。他在與寄主的過程當(dāng)中是定位在植物的細(xì)胞壁上的。本發(fā)明的PopW 處理煙草，可以誘導(dǎo)煙草抵抗煙草花葉病毒的侵染，而且抗性不僅限于PopW處理的葉 片，也包括其周圍的葉片，并且該過程當(dāng)中伴隨著PR-1基因的表達(dá)。說明PopW可以 誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)獲得抗病性，說明PopW可以開發(fā)成生物源農(nóng)藥。SEQUENCE LISTING
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng)用 <130>說明書
<160> 6
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221>擴(kuò)增popW基因引物popWl上游
<222> (1)..(26) <223>
<400> 1
cgcatatgtc catccagatt gatcgc 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> 擴(kuò)增p叩W基因引物popWl下游
<222> (1)..(27) <223>
<400> 2
gcaagcttgc ccgagtaggc cttgtag 27
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工合成
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<221> popW基因引物p叩W2上游
<222> (1)..(21) <223>
<400> 3
atgtccatcc agattgatcg c 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
7<213> 人工合成 <220>
<221>擴(kuò)增p叩W基因引物popW2下游
<222> (1)..(19) <223>
<400> 4
gcccgagtag gccttgtag 19
<210> 5
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<212> DNA
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<221 >擴(kuò)增popW基因引物popW3上游
<222> (1)..(27) <223>
<400> 5
tctagaatgt ccatccagat tgatcgc 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221>擴(kuò)增popW基因引物popW3下游
<222> (1).,(27) <223>
<400> 6
ggatccgccc gagtaggcct tgtagct 2權(quán)利要求
1、青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng)用，包括1)popW基因的克隆青枯菌ZJ3721在30℃條件下培養(yǎng)于MBG培養(yǎng)基，待菌株生長到對數(shù)期，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明提取青枯菌基因組DNA；設(shè)計擴(kuò)增popW基因引物popW1上游引物FCG<u>CATATG</u>TCCATCCAGATTGATCGC Nde I下游引物RGC<u>AAGCTT</u>GCCCGAGTAGGCCTTGTAG Hind III或擴(kuò)增popW基因引物popW2上游引物FATG TCC ATC CAGATTGATCGC下游引物RGCCCGAGTAGGCCTTGTAG或擴(kuò)增popW基因引物popW3上游引物FTC<u>TAGAAT</u>GTCCATCCAGATTGATCGC Xba I下游引物R<u>GGATCC</u>GCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT BamH I以基因組DNA為模板，使用高保真pfu聚合酶擴(kuò)增PopW的編碼區(qū)序列，擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃10min，產(chǎn)物切膠回收；2)PopW蛋白的表達(dá)及純化產(chǎn)物切膠回收后加A后連接至中間載體酶切或直接酶切后連接至蛋白表達(dá)載體pET30a(+)載體，測序鑒定，得到重組質(zhì)粒pET-popW，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，將篩選到的陽性克隆接種到含有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，180轉(zhuǎn)/分條件下培養(yǎng)過夜，第二天按1∶100的比例接種到10mL LB中，按照上述條件培養(yǎng)3個小時，然后加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷使其終濃度為1mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)2個小時后，在4℃下，6000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，將其懸浮于20mMTris-HCl、pH8.0，加入終濃度為1mM的苯甲基磺酰氟，然后超聲波破碎儀上進(jìn)行菌體破碎，當(dāng)菌液變澄清時，離心吸取上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測檢測，并用鎳柱純化PopW蛋白，具體操作參照High-Affinity Ni-IDA Resin操作說明書進(jìn)行，獲得純化PopW蛋白。
2、根據(jù)權(quán)利要求1青枯菌ZJ3721新胞外蛋白P叩W的基因工程應(yīng)用，其特征在 于，獲得的純化PopW蛋白在植物抗病性方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。設(shè)計引物，以基因組DNA為模板，使用高保真pfu聚合酶擴(kuò)增PopW的編碼區(qū)序列，產(chǎn)物連接至蛋白表達(dá)載體pET30a(+)載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，用鎳柱純化PopW蛋白。亞細(xì)胞定位研究表明，該蛋白定位在植物的細(xì)胞壁上。在溫室條件下，PopW還能誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的侵染。說明PopW可誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)獲得抗性，為以后作為生物農(nóng)藥防治病害提供了很大的可能，具有重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N15/31GK101457228SQ200910029118
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者劉紅霞, 李建剛, 郭堅華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)