調節(jié)血清低密度脂蛋白（LDL）水平的前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9 型（PCSK9 ...的制作方法
【專利說明】調節(jié)血清低密度脂蛋白（LDL)水平的前蛋白轉化酶枯草桿 菌蛋白酶/Kexin9型（PCSK9)變構結合配體 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及高膽固醇血癥的領域。具體地，本發(fā)明提供組合物和方法以通過使 用合成配體和/或合成配體衍生物改變蛋白PCSK9的構象來調節(jié)低密度脂蛋白的循環(huán)水 平，所述合成配體和/或合成配體衍生物具有在350-2, OOODa之間的3-8個氨基酸的序 列。PCSK9的構象的改變影響PCSK9和內源低密度脂蛋白受體之間的相互作用，并可導致 減少或增加水平的循環(huán)LDL-膽固醇。高LDL-膽固醇水平與增加的心臟疾病風險相關。低 LDL-膽固醇水平可在其它病狀例如肝功能障礙中是有問題的；因此，對于可升高LDL水平 的配體也存在效用。
[0002] 背景
[0003] 低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)的血漿水平升高代表冠狀動脈心臟疾病發(fā)生的最 大風險因素。LDL-C從血漿的清除主要由肝臟通過LDL受體（LDLR)的作用發(fā)生，所述LDL 受體是以高親和力結合至LDL顆粒上的載脂蛋白BlOO (apoBlOO)并介導其胞吞吸收的細胞 表面糖蛋白。Goldstein等人，Annu. Rev. Cell Biol. 1:1-39(1985)。常染色體顯性高膽固 醇血癥（ADH)與發(fā)現(xiàn)于編碼LDLR(家族性高膽固醇血癥（FH))或ap 〇B100(家族性缺陷型 apoBlOO)的基因中的突變有關，所述突變降低血漿LDL清除率。分別地Hobbs等人，Annu. Rev. Genet. 24, 133-170 (1990);和 Innerarity 等人，J. Lipid Res. 31:1337-1349 (1990) 〇
[0004] 低密度脂蛋白（LDL)受體（LDLR)介導VLDL、VLDL殘粒和LDL的有效胞吞作用。 作為胞吞過程的一部分，LDLR釋放脂蛋白到肝內體中。
[0005] 調節(jié)LDL-膽固醇水平的一種方法會是鑒定結合至PCSK9的肽并根據(jù)需要改變 PCSK9和LDLR之間的相互作用動力學以使得通過LDLR胞吞作用的脂蛋白清除速率增加或 減少。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明涉及高膽固醇血癥的領域。具體地，本發(fā)明提供組合物和方法以通過使 用合成配體和/或合成配體衍生物改變蛋白PCSK9的構象來調節(jié)低密度脂蛋白的循環(huán)水 平，所述合成配體和/或合成配體衍生物具有在350-2, OOODa之間的3-8個氨基酸的序 列。PCSK9的構象的改變影響PCSK9和內源低密度脂蛋白受體之間的相互作用，并可導致 減少或增加水平的循環(huán)LDL-膽固醇。高LDL-膽固醇水平與增加的心臟疾病風險相關。低 LDL-膽固醇水平可在其它病狀例如肝功能障礙中是有問題的；因此，對于可升高LDL水平 的配體也存在效用。
[0008] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)提供；i)PCSK9蛋白，其中所 述蛋白包含誘導變構調節(jié)的結合位點和低密度脂蛋白受體結合位點；ii)能夠結合所述結 合位點的合成配體；iii)包含低密度脂蛋白受體和低密度脂蛋白的多個肝細胞；b)使所述 合成配體結合至所述結合位點，其中所述合成配體誘導所述蛋白的構象轉變；和c)通過所 述構象轉變調節(jié)所述低密度脂蛋白受體結合位點對于所述低密度脂蛋白受體的親和力。在 一個實施方案中，結合位點包括 PCSK9 蛋白的 His417, Lys421，Pro446, Trp453, Gln454, Glu628, Gl y629, Asn652和Thr 653。在一個實施方案中，合成配體是變構抑制劑配體，其中所述調節(jié)減小 所述低密度脂蛋白受體結合位點對于所述低密度脂蛋白受體的親和力，使得所述多個肝細 胞對所述低密度脂蛋白的內化增加。在一個實施方案中，合成配體是變構增強劑配體，所 述調節(jié)增加所述低密度脂蛋白受體結合位點對于所述低密度脂蛋白受體的親和力，使得所 述多個肝細胞對所述低密度脂蛋白的內化減少。在一個實施方案中，所述蛋白的構象轉變 選自誘導契合轉變和生物力學轉變。在一個實施方案中，合成配體是選自VYVRFW、VLELYW 和ISDLSY的合成肽。在一個實施方案中，變構抑制劑是選自SRX55, SRX56, SRX60, SRX61， SRX62, SRX63, SRX64, SRX65和SRX66的肽。在一個實施方案中，變構增強劑是選自SRX64， SRX67, SRX68, SRX69, SRX72和SRX73的肽。在一個實施方案中，合成肽包含約3-8個之 間的氨基酸。在一個實施方案中，合成肽是六個氨基酸。在一個實施方案中，合成肽小于 1300Da。在一個實施方案中，合成肽在約466-1067Da之間。在一個實施方案中，合成肽在 約 175-1，OOODa 之間。
[0009] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)提供；i)PCSK9蛋白，其中所 述蛋白包含誘導變構調節(jié)的結合位點和低密度脂蛋白受體結合位點；ii)能夠結合所述結 合位點的合成配體；iii)包含低密度脂蛋白受體群的多個肝細胞；b)使所述合成配體結合 至所述結合位點，其中所述合成配體誘導所述蛋白的構象轉變；c)通過所述構象轉變調節(jié) 所述低密度脂蛋白受體的所述群。在一個實施方案中，結合位點包括PCSK9蛋白的His 417， Lys421，Pro446, Trp453, Gln454, Glu628, Gly629, Asn652和 Thr 653。在一個實施方案中，合成配體是變 構抑制劑配體，其中所述調節(jié)增加在所述多個肝細胞的細胞表面上可測量的所述低密度脂 蛋白受體的所述群。在一個實施方案中，合成配體是變構增強劑配體，其中所述調節(jié)減少在 所述多個肝細胞的細胞表面上可測量的所述低密度脂蛋白受體的所述群。在一個實施方案 中，所述蛋白的所述構象轉變選自誘導契合轉變和生物力學轉變。在一個實施方案中，配體 是選自VYVRFW、VLELYW和ISDLSY的合成肽。在一個實施方案中，變構抑制劑肽選自SRX55， SRX56, SRX60, SRX61，SRX62, SRX63, SRX64, SRX65 和 SRX66。在一個實施方案中，變構增強 劑肽選自SRX64, SRX67, SRX68, SRX69, SRX72和SRX73。在一個實施方案中，合成肽包含約 3-8個之間的氨基酸。在一個實施方案中，合成肽是六個氨基酸。在一個實施方案中，合成 肽小于l，300Da。在一個實施方案中，合成肽在約466-1067Da之間。在一個實施方案中，合 成肽在約50-1，OOODa之間。
[0010] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物：
[0011]
[0012] 其中：i)η是氨基酸殘基的數(shù)量，其是在范圍3-8中的整數(shù)；ii)組成氨基酸是獨 立選擇的天然或非天然氨基酸的單一對映體；iii)R2和R3獨立地選自氫、低級烷基、支鏈 烷基、羥烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、芳基、雜芳基、?；?、取代或未取代的苯甲?；?、烷基或芳基磺 酰基（例如甲磺?；蚣妆交酋；┖桶被柞；ɡ鏐0C) ;iV) Rl選自-OH和-NR4-R5 ; V) R4和R5獨立地選自氫、低級烷基、芳基、環(huán)烷基、芳族雜環(huán)、吡啶、四唑、烷氧基、環(huán)烷氧 基；可選擇地，R4和R5被連接作為雜環(huán)例如哌啶；吡咯烷；嗎啉；哌嗪；經(jīng)取代的雜環(huán)例如 4-甲基哌嗪；或稠雜環(huán)例如二氫喹啉或二氫吲哚以及Sl、S2和S3是側鏈。在一個實施方 案中，該化合物還包含帶負電的極性基團。在一個實施方案中，帶負電的極性基團選自摻 入所述側鏈SI、S2或Sn中的0-磷酸鹽、0-硫酸鹽、5-0-和5-N-四唑的至少一種。在一 個實施方案中，選自Sl、S2和Sn的側鏈包含磷酸絲氨酸。在一個實施方案中，側鏈Sl包 括-CH2-NH-四唑。在一個實施方案中，化合物選自Val-Tyr-Val-Arg-Phe-Trp, β -Ala-Phe (3-CH2NH2)-Val-D-Ser(ρ)-Phe-Trp，Thr-Leu-Cys(CH2-Ph)-Thr-Ser-Ser-Ser(ρ)，Thr-Le u_Asp (NHCH2Ph) -Thr-Trp-Ser-Ser-Ser (p)，Thr-Leu-Gly (CH2CH2 環(huán)己基）-Thr-Trp-Ser-S er-Ser(ρ)，Thr-Leu-Hph-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser(ρ)，Thr-Leu-Cys(CH2_Ph)-Thr-Trp(3_Me )-Ser-Ser-Ser(p)，Val-Leu-Glu-Leu-Tyr-Trp, Leu-Asp-Leu-Phe-Phe-Ser, Ile-Leu-Asp-Leu-Ser-Tyr, Ac-Trp-Ser-Ser (p)，Ac-Trp-Ala-Ser (p)，Ac-Trp (5_F) -Ala-Ser (p)-嗎啉，T hr-Leu-Thr-Trp-Ser-Ser-Ser (p)，Ac-Tyr-Trp-Gly, Phe (4_Ph) -Ala-Ser (p)-嗎啉。在一個 實施方案中，所述化合物包含約3-8個之間的氨基酸。在一個實施方案中，所述化合物是六 個氨基酸。在一個實施方案中，所述化合物小于l，300Da。在一個實施方案中，所述化合物 在約466-1067Da之間。在一個實施方案中，所述化合物在約175-1，OOODa之間。在一個實 施方案中，所述化合物包含合成肽。在一個實施方案中，所述化合物被配制為藥物組合物。 在一個實施方案中，藥物組合物還包含制藥藥物。在一個實施方案中，制藥藥物選自他汀類 藥物（statins)、心血管藥、代謝藥和抗高血壓藥。在一個實施方案中，制藥藥物選自依折麥 布、苯磺酸氨氯地平、西他列汀、二甲雙胍、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。在一個實 施方案中，藥物組合物被配制為選自下列的形式：片劑，液體，凝膠，膠囊，囊劑，微粒，脂質 體，納米顆粒，鹽，透皮貼劑，軟膏，洗劑，乳膏，凝膠，滴劑，條劑，栓劑，噴霧劑和粉劑。
[0013] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含范圍在約350-1，500Da之間的PCSK9變構 配體的組合物。在一個實施方案中，PCSK9變構配體小于l，300Da。在一個實施方案中， PCSK9變構配體包含約3-6個之間的氨基酸。在一個實施方案中，PCSK9變構配體在約 550-1，OOODa之間。在一個實施方案中，所述組合物是藥物組合物。在一個實施方案中，所 述組合物是制藥組合物。在一個實施方案中，所述施用還包括選自包括但不限于脂質體、微 粒和納米顆粒的組的遞送系統(tǒng)。在一個實施方案中，藥物組合物包含有效劑量的所述配體。 在一個實施方案中，藥物組合物包含鹽。在一個實施方案中，藥物組合物被配制用于口服施 用。
[0014] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)施用PCSK9變構抑制劑肽至 受試者，其中所述受試者具有心血管疾病的至少一種癥狀；和b)通過所述PCSK9變構抑制 劑肽施用減少心血管疾病的所述至少一種癥狀。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀的 減少介于10 % -85 %之間。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀的減少介于20 % -65 %之 間。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀的減少介于30%-55%之間。在一個實施方案 中，所述心血管疾病包括冠心病。在一個實施方案中，所述心血管疾病包括高血壓。在一個 實施方案中，所述心血管疾病包括高膽固醇血癥。在一個實施方案中，所述心血管疾病包括 動脈粥樣硬化。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括減少的循環(huán)高密度脂蛋白。在 一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括增多的循環(huán)膽固醇。在一個實施方案中，所述至少 一種癥狀包括增多的循環(huán)低密度脂蛋白。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括高血 壓。在一個實施方案中，所述施用包括有效劑量的所述PCSK9變構抑制劑肽。在一個實施 方案中，所述施用還包括選自包括但不限于脂質體、微粒和納米顆粒的組的遞送系統(tǒng)。在一 個實施方案中，所述有效劑量包含藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物包含鹽。在 一個實施方案中，藥物組合物被配制用于口服施用。在一個實施方案中，變構抑制劑肽包含 約3-8個之間的氨基酸。在一個實施方案中，變構抑制劑肽是六個氨基酸。在一個實施方 案中，變構抑制劑肽小于1，300Da。在一個實施方案中，變構抑制劑肽在約466-1067Da之 間。在一個實施方案中，變構抑制劑肽在約175-1，OOODa之間。
[0015] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)施用PCSK9變構增強劑肽至 受試者，其中所述受試者具有心血管疾病的至少一種癥狀；和b)通過所述PCSK9變構抑制 劑肽施用減少心血管疾病的所述至少一種癥狀。在一個實施方案中，所述心血管疾病包括 高膽固醇血癥。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括減少的循環(huán)膽固醇。在一個實 施方案中，所述至少一種癥狀包括增多的高密度脂蛋白。在一個實施方案中，所述至少一種 癥狀包括減少的低密度脂蛋白。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括低血壓。在一 個實施方案中，所述至少一種癥狀的減少介于10% -85%之間。在一個實施方案中，所述至 少一種癥狀的減少介于20% -65%之間。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀的減少介 于30% -55 %之間。在一個實施方案中，所述施用包括有效劑量的所述PCSK9變構抑制劑 肽。在一個實施方案中，所述施用還包括選自包括但不限于脂質體、微粒和納米顆粒的組的 遞送系統(tǒng)。在一個實施方案中，所述有效劑量包含藥物組合物。在一個實施方案中，藥物 組合物包含鹽。在一個實施方案中，藥物組合物被配制用于口服施用。在一個實施方案中， 變構增強劑肽包含約3-8個之間的氨基酸。在一個實施方案中，變構增強劑肽是六個氨基 酸。在一個實施方案中，變構增強劑肽小于l，300Da。在一個實施方案中，變構增強劑肽在 約466-1067Da之間。在一個實施方案中，變構增強劑肽在約175-1，OOODa之間。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)施用PCSK9變構合成肽至受 試者，其中所述受試者具有肝臟疾病的至少一種癥狀；和b)通過所述PCSK9變構肽施用減 少肝臟疾病的所述至少一種癥狀。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括升高的低密 度脂蛋白受體密度。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀包括降低的低密度脂蛋白受體 密度。在一個實施方案中，所述至少一種癥狀的減少介于10%-85%之間。在一個實施方 案中，所述至少一種癥狀的減少介于20% -65%之間。在一個實施方案中，所述至少一種癥 狀的減少介于30% -55%之間。在一個實施方案中，所述PCSK9變構合成肽包括PCSK9變 構增強劑肽。在一個實施方案中，所述PCSK9變構合成肽包括PCSK9變構抑制劑肽。在一 個實施方案中，所述施用包括有效劑量的所述PCSK9變構肽。在一個實施方案中，所述施用 還包括選自包括但不限于脂質體、微粒和納米顆粒的組的遞送系統(tǒng)。在一個實施方案中，所 述有效劑量包含藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物包含鹽。在一個實施方案中， 藥物組合物被配制用于口服施用。在一個實施方案中，變構合成肽包含約3-8個之間的氨 基酸。在一個實施方案中，變構合成肽是六個氨基酸。在一個實施方案中，變構合成肽小于 l，300Da。在一個實施方案中，變構合成肽在約466-1067Da之間。在一個實施方案中，變構 合成肽在約175-1，OOODa之間。
[0017] 在一個實施方案中，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括：a)提供； i)PCSK9蛋白，其中所述蛋白包含變構調節(jié)位點和正構低密度脂蛋白受體（LDLR)結合位 點；和ii)能夠結合所述變構調節(jié)位點的變構合成肽；b)使所述變構合成肽結合至所述變 構調節(jié)位點，其中所述變構合成肽誘導所述正構LDLR結合位點的構象轉變。在一個實施方 案中，所述變構合成肽對所述變構調節(jié)位點的所述結合，抑制所述正構LDLR結合位點的誘 導契合構象轉變。在一個實施方案中，所述結合誘導所述PCSK9蛋白的構象轉變。在一個 實施方案中，所產(chǎn)生的PCSK9構象轉變減小所述正構LDLR結合位點相互作用對LDLR的結 合親和力，其中低密度脂蛋白清除率增加。在一個實施方案中，構象轉變增強所述正構低密 度脂蛋白受體結合位點從低密度脂蛋白受體的解離。在一個實施方案中，構象轉變減少對 于結合配體的正構Cis-His富集結構域（CHRD)結合位點（例如，以促進在低pH下的囊泡運 輸；DeVay 等人，''Characterization of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9)trafficking reveals a novel lysosomal targeting mechanism via amyloid precursor-like protein 2 (APLP2)"J Biol Chem. 288 (15) :10805-10818 (2013)。在一個 實施方案中，正構低密度脂蛋白受體結合位點的構象轉變包括誘導契合抑制。在一個實施 方案中，所述變構合成肽的結合減少PCSK9的正構LDLR結合位點的誘導契合所需的構象轉 變，從而抑制所述正構LDLR相互作用的結合親和力，其中低密度脂蛋白清除率增加。在一 個實施方案中，所述正構低密度脂蛋白受體結合位點構象轉變的誘導是生物力學的。在一 個實施方案中，構象轉變導致PCSK9催化結構域和PCSK9C-末端結構域之間的連接環(huán)的生 物力學硬化。在一個實施方案中，生物力學構象轉變包括氨基酸丙氨酸 443側鏈和/或主鏈 的易位和/或旋轉運動。在一個實施方案中，生物力學構象轉變包括氨基酸纈氨酸441側鏈 和/或主鏈的易位和/或旋轉運動。在一個實施方案中，生物力學構象轉變包括氨基酸天 冬氨酸 422側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動。在一個實施方案中，生物力學構象轉變 包括氨基酸蘇氨酸162側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動。在一個實施方案中，生物力 學構象轉變包括氨基酸脯氨酸445側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動。在一個實施方案 中，生物力學構象轉變包括氨基酸脯氨酸 446側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動。在一 個實施方案中，生物力學構象轉變包括組氨酸449的重新定向和易位。在一個實施方案中，生 物力學機制包括氨基酸丙氨酸 443側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動的抑制。在一個實 施方案中，生物力學機制包括氨基酸纈氨酸441側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動的抑 制。在一個實施方案中，生物力學機制包括氨基酸天冬氨酸 422側鏈和/或主鏈的易位和/ 或旋轉運動的抑制。在一個實施方案中，生物力學機制包括氨基酸蘇氨酸162側鏈和/或主 鏈的易位和/或旋轉運動的抑制。在一個實施方案中，生物力學機制包括氨基酸脯氨酸 445 側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動的抑制。在一個實施方案中，生物力學機制包括氨 基酸脯氨酸446側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動的抑制。在一個實施方案中，生物力 學移位包括組氨酸 449側鏈和/或主鏈的易位和/或旋轉運動的抑制。在一個實施方案中， 變構合成肽是VYVRFW。在一個實施方案中，變構合成肽是VLELYW。在一個實施方案中，變 構合成肽是ISDLSY。在一個實施方案中，變構合成肽包含約3-8個之間的氨基酸。在一個 實施方案中，變構合成肽是六個氨基酸。在一個實施方案中，變構合成肽小于l，300Da。在 一個實施方案中，變構合成肽在約466-1067Da之間。在一個實施方案中，變構合成肽在約 175-1，OOODa 之間。
[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物：
[0020] 其中：i)η是氨基酸殘基的數(shù)量，其是在范圍3-8中的整數(shù)；ii)組成氨基酸是獨 立選擇的天然或非天然氨基酸的單一對映體；iii)R2和R3獨立地選自氫、低級烷基、支鏈 烷基、羥烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、芳基、雜芳基、酰基、取代或未取代的苯甲?；⑼榛蚍蓟?