專利名稱：一種無純化步驟的異麥芽酮糖生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以蔗糖為原料制備異麥芽酮糖的生產(chǎn)技術(shù)，以及在異麥芽 酮糖生產(chǎn)過程中無需分離清除葡萄糖和果糖等副產(chǎn)品的異麥芽酮糖生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
異麥芽酮糖的化學(xué)名稱叫ot-D-吡喃葡萄糖苷-l,6-D-呋喃果糖，最早是在蜂 蜜中發(fā)現(xiàn)的。由于其含量非常微量，因此一直未引起人們的關(guān)注。直到1957年， 在甜菜制糖過程中發(fā)現(xiàn)并結(jié)晶出這種"新"雙糖化合物——異麥芽酮糖后，異麥 芽酮糖的重要性才逐漸受到人們的重視。隨后，某些細(xì)菌能將蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥 芽酮糖的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了異麥芽酮糖的食用性和生產(chǎn)可能性的大量研究。對(duì)于那 些不宜攝入食糖而需要慎重選擇甜味劑的特殊人群來說，異麥芽酮糖的發(fā)現(xiàn)無 疑是一種令人振奮的幸福消息。
作為一種功能性天然甜味糖，異麥芽酮糖具有與蔗糖類似的甜味特性，它 對(duì)味蕾的最初刺激速度比蔗糖快，最強(qiáng)的甜味刺激與蔗糖一樣，終了時(shí)的甜味 刺激則要比蔗糖弱。異麥芽酮糖無任何異味，其甜度是蔗糖的50%,而且不隨 溫度變化而改變。將異麥芽酮糖應(yīng)用在糖果和巧克力類食品中，沒有發(fā)現(xiàn)它與 蔗糖間存在明顯的差異。異麥芽酮糖不但具有非致齲齒性，而且還能夠阻止不 溶性葡聚糖的生成，以防齲齒形成。由于人體本身無法消化異麥芽酮糖，只有 被腸道微生物緩慢分解后才能進(jìn)入血液而被人體吸收，因此，食用后在血液中 釋放單糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰島素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可 防止脂肪的過多積累。大多數(shù)細(xì)菌和酵母都不能發(fā)酵利用異麥芽酮糖，當(dāng)異麥 芽酮糖應(yīng)用于發(fā)酵食品和飲料生產(chǎn)時(shí)，其抗微生物特性使產(chǎn)品的甜味易于保持。
異麥芽酮糖是以蔗糖為原料，經(jīng)蔗糖異構(gòu)酶(a-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，EC.5.4.99.11) 催化反應(yīng)，將蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖，由蔗糖異構(gòu)酶催化的蔗糖異構(gòu)化反應(yīng) 如圖1所示。在此異構(gòu)化過程中，蔗糖分子中的ot-l，2-糖苷鍵在蔗糖異構(gòu)酶活性 中心內(nèi)首先被水解斷開并轉(zhuǎn)位，隨后葡萄糖單體再與果糖單體形成a-l,6-或 a-l,l-糖苷鍵，并從酶分子中脫落而產(chǎn)生兩種蔗糖異構(gòu)體，同時(shí)，斷開的a-1,2-糖苷鍵也可以與水分子反應(yīng)形成葡萄糖和果糖。因此，在蔗糖異構(gòu)化過程中， 除了生成a-l,6-連接的異麥芽酮糖外，也形成a-l，l-連接的胞壁糖，同時(shí)還會(huì)形成一部分非連接的葡萄糖和果糖。目前，用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶來
源于各種微生物，如沙雷氏菌屬(&廳"^;> 、克雷伯氏菌屬(K/eZmw/")、假
單胞菌屬(尸W謂cwoy)、歐文氏菌屬(五rw/"/a)、農(nóng)桿菌屬(々raZ acte"',) 和精朊桿菌屬等(Pratom/"o6acter)。美國專利4670387使用￡rw/w'a Aapow//c/、 尸ratom/m 6acfer rM6raw禾卩Serra"'ap/ym^/w'ca的固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖時(shí)， 大約可以轉(zhuǎn)化70 95%的蔗糖。美國專利5229276用固定化^graZ^"e〃力附 菌生產(chǎn)異麥芽酮糖時(shí)，異麥芽酮糖的比例僅有10%。雖然己經(jīng)發(fā)現(xiàn) 或使用的微生物細(xì)菌能夠催化蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)生異麥芽酮糖，但產(chǎn)量都很不穩(wěn)定， 轉(zhuǎn)化率一般為8 86%，而且，產(chǎn)物中除了異麥芽酮糖外，還伴隨有三種副產(chǎn)品 即胞壁糖、葡萄糖和果糖的形成。不周來源的蔗糖異構(gòu)酶催化生成的異麥芽酮 糖等各種產(chǎn)物的比率不同，其中胞壁糖與異麥芽酮糖一樣，是一種非致齟齒糖， 產(chǎn)品中的胞壁糖不影響異麥芽酮糖的特殊品質(zhì)，生產(chǎn)過程中無需考慮分離剔除。 但是，這些蔗糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中還含有2 7%的葡萄糖和果糖等副產(chǎn)物， 嚴(yán)重影響異麥芽酮糖產(chǎn)品的質(zhì)量，在后提取過程中必須要分離除去。生產(chǎn)過程 中必須采用離子交換樹脂等復(fù)雜的分離純化過程除去這些雜質(zhì)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本 大幅提高，是一個(gè)值得考慮的工業(yè)化問題。我們通過蔗糖異構(gòu)酶催化反應(yīng)過程 的比較分析，發(fā)現(xiàn)蔗糖異構(gòu)酶的存在形式影響蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物的比率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用簡(jiǎn)單步驟和設(shè)備生產(chǎn)高純度異麥芽酮糖的有效 技術(shù)，同時(shí)提供一套無需分離純化過程直接生產(chǎn)異麥芽酮糖的簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。 與其他已公開的專利相比，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.8%，異麥芽酮糖含量高達(dá)88%， 葡萄糖和果糖含量低于0.1%。按照本發(fā)明，可以以較低成本實(shí)現(xiàn)異麥芽酮糖的 工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的具體操作步驟如下
第一步、蔗糖異構(gòu)酶活性細(xì)胞碎片制備將克雷伯氏菌LSI菌由保存斜面 接種到100毫升蔗糖培養(yǎng)基中，在30。C、 150轉(zhuǎn)/分條件下，于搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng) 6 8小時(shí)后，按5%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮蔗糖培養(yǎng)基中，于30°C振蕩(150轉(zhuǎn)/ 分)培養(yǎng)10 12小時(shí)，于6000轉(zhuǎn)/分、25°C條件下離心10分鐘，用蒸餾水洗 滌菌體細(xì)胞3次，重新懸浮于原體積的25 mM磷酸-檸檬酸緩沖溶液中，并分成 兩部分。 一部分作為完整細(xì)胞用于酶活力測(cè)定，另一部分超聲波破碎，制成蔗糖異構(gòu)酶活性細(xì)胞碎片。其中，蔗糖培養(yǎng)基配方中含有2%蔗糖，0.1%酵母粉，
0.1%蛋白胨，0.05%硫酸鎂，0. l%NaH2P04， 0. 1%認(rèn)0" pH6.6。
得到的細(xì)胞碎片14000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，水洗3次，并重新懸浮于原體積
的上述緩沖溶液中，可用于酶催化反應(yīng)分析。
根據(jù)蔗糖異構(gòu)酶的基因序列合成引物，以克雷伯氏菌LSI菌的基因組DNA
為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增蔗糖異構(gòu)酶基因，并在GST表達(dá)系統(tǒng)(GST Gene
Fusion System, Pharmacia)中表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶，用專用親和層析柱分離純化蔗糖
異構(gòu)酶和GST融合蔗糖異構(gòu)酶。
第二步、蔗糖轉(zhuǎn)化將活性細(xì)胞碎片與10~20%蔗糖溶液以1: IO的比例在 轉(zhuǎn)化罐中混合，在保持正壓的條件下，于30。C保溫6 15小時(shí)，將蔗糖轉(zhuǎn)化為 異麥芽酮糖，獲得蔗糖轉(zhuǎn)化液；
第三步、濃縮結(jié)晶在65。C條件下，將上述步驟獲得的蔗糖轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真 空濃縮，待糖濃度達(dá)到60 75%時(shí)，加入O. 1 1%異麥芽酮糖晶種，攪拌條件 下緩慢降溫，使異麥芽酮糖結(jié)晶析出，得到小顆粒結(jié)晶異麥芽酮糖；
第四步、干燥將結(jié)晶的異麥芽酮糖淋洗脫色后，干燥到含水量7 8%時(shí)， 獲得異麥芽酮糖結(jié)晶產(chǎn)品。
蔗糖異構(gòu)酶存在狀態(tài)的空間效應(yīng)影響酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類和比例。將第一步 中得到的完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片懸浮液、純化的蔗糖異構(gòu)酶和GST融合蔗糖異構(gòu) 酶分別與濃度為10 20%的蔗糖溶液以1: IO的比例混合，根據(jù)第二步的條件， 使蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.8%以上，得到異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化液。
如圖2所示，與細(xì)胞壁酶的產(chǎn)物相比較，在純酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，葡萄糖/果 糖比例明顯增加，已接近其它同類酶的比例(12.5 13%)，而胞壁糖則微有增 加。當(dāng)在蔗糖異構(gòu)酶的N—末端聯(lián)接上一個(gè)GST融合蛋白時(shí)，可能是由于GST 蛋白的空間障礙作用，蔗糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的葡萄糖/果糖比例有所降低(7%)。由 此可以看出，蔗糖異構(gòu)酶以細(xì)胞壁酶狀態(tài)催化蔗糖轉(zhuǎn)化時(shí)，產(chǎn)物純度最高。 固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖
向滅過菌的2.5%海藻酸鈉溶液中加入15%的克雷伯氏菌LSI細(xì)胞懸浮液， 混合均勻后，在無菌條件下滴加到0.65X滅菌的CaCl2溶液中，進(jìn)行固定成型， 并在此溶液中放置4小時(shí)，以強(qiáng)化海藻酸鈣固定化細(xì)胞。將固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)入含 0.1XCaCl2的蔗糖培養(yǎng)基(2%蔗糖，0.1%酵母粉，0.1%蛋白胨，0.05%硫酸鎂，0.1%NaH2PO4， 0.1%KNO3， pH6.6)中，30。C振蕩(150轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)16小時(shí)， 使固定化細(xì)胞活化。然后將活化后的固定化細(xì)胞裝填于柱式反應(yīng)器中，按0.5 5毫升/分的流速連續(xù)流加10 20 %的蔗糖溶液，在30°C條件下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 通過控制流速以調(diào)整蔗糖溶液在反應(yīng)器中的停留時(shí)間，使蔗糖完全轉(zhuǎn)化，收集 流出液，測(cè)定異麥芽酮糖的濃度。
本發(fā)明中蔗糖異構(gòu)酶活力檢測(cè)方法如下
將第一步中得到的活性細(xì)胞碎片懸浮液(O.l毫升)與0.4毫升溶解于25 mM 磷酸一檸檬酸緩沖溶液(pH6.6)的2% (Wv)蔗糖溶液混合均勻，于30。C水 浴中反應(yīng)10分鐘后，立即加入1.5毫升3,5-二硝基水楊酸試劑終止酶反應(yīng)，并 于沸水浴中加熱5分鐘以顯色，在520納米波長處檢測(cè)吸光度，通過異麥芽酮 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定還原糖含量。 一個(gè)蔗糖異構(gòu)酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條 件下，每分鐘催化蔗糖異構(gòu)化形成1 pmol異麥芽酮糖所需要的酶量。
本發(fā)明中異麥芽酮糖的檢測(cè)可以采用薄層層析(TLC)或高效液相色譜 (HPLC)方法。
薄層層析(TLC)法檢測(cè)異麥芽酮糖及糖組分測(cè)定方法如下 將蔗糖轉(zhuǎn)化上清液在硅膠薄層層析板上點(diǎn)樣后，于展開槽中展開后顯色， 溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酉旨-乙酸-水的體積比4:3:0.8，顯色劑為本胺(4%) -二本胺
(4%)-磷酸(85%)的體積比5:5:1，顯色溫度為80。C，顯色時(shí)間為5分鐘， 異麥芽酮糖形成典型的黃綠色斑點(diǎn)。
為了定量分析轉(zhuǎn)化液中各種糖組分的比例，在TLC層析后，分別切下硅膠 板中含有異麥芽酮糖、胞壁糖和葡萄糖/果糖的組分，并用蒸餾水溶解，采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定糖濃度，計(jì)算異麥芽酮糖、胞壁糖和葡萄糖的比率。 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)異麥芽酮糖及產(chǎn)物比例方法如下 采用Waters 2690系統(tǒng)HPLC分離異麥芽酮糖產(chǎn)物，層析柱為Waters糖分析專 用柱(4.6x250毫米)，檢測(cè)器為Waters2410折光指數(shù)檢測(cè)器，樣品用70。％的乙 氰水溶液洗脫，洗脫液流速為l毫升/分，由含有蔗糖異構(gòu)酶活性的細(xì)胞碎片催化 蔗糖轉(zhuǎn)化形成產(chǎn)物的HPLC層析譜如圖3所示，根據(jù)峰面積可以計(jì)算糖含量及產(chǎn) 物比例。


圖l、蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖異構(gòu)化反應(yīng)的示意圖。圖2、不同存在形式蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物的薄層層析圖譜。
圖3、蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、轉(zhuǎn)化罐分批轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異麥芽酮糖
將克雷伯氏菌LSI菌從保留斜面上，接種至裝有蔗糖培養(yǎng)基(2%蔗糖，0.1 %酵母粉，0.1%蛋白胨，0.05%硫酸鎂，0.1%NaH2PO4， 0.r%KNO3， pH6.6) 的三角瓶中活化培養(yǎng)8小時(shí)(30°C、 150轉(zhuǎn)/分)，按5%接種量轉(zhuǎn)入裝有新鮮蔗 糖培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，通風(fēng)培養(yǎng)12小時(shí)后，在發(fā)酵罐中于無菌條件下超聲波破 碎細(xì)胞，制成活性細(xì)胞碎片懸浮液。在10噸轉(zhuǎn)化罐中，分別配制5%、 10%、 15% 和20%蔗糖溶液，95°C滅菌20分鐘后，冷卻至30°C。按1:10比例將上述活 性細(xì)胞碎片懸浮液轉(zhuǎn)入10噸轉(zhuǎn)化罐中，30。C保溫，通無菌風(fēng)以維持轉(zhuǎn)化罐中的 正壓狀態(tài)。當(dāng)蔗糖濃度為5%和10%時(shí)，蔗糖100%轉(zhuǎn)化時(shí)間不超過6小時(shí)，15 %和20%蔗糖濃度時(shí)，達(dá)到蔗糖全部轉(zhuǎn)化時(shí)所需時(shí)間不超過9小時(shí)。
實(shí)施例2、固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖
每5毫升克雷伯氏菌LSI細(xì)菌培養(yǎng)液與100毫升2%海藻酸鈉溶液充分混合 后，用注射器滴加到0.65% (w/v) CaCl2溶液中，并在溶液中于4°C條件下放 置4小時(shí)，以強(qiáng)化固定化顆粒。然后將固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)入含0.1XCaCl2的蔗糖培 養(yǎng)基(2%蔗糖，0.1%酵母粉，0.1%蛋白胨，0.05%硫酸鎂，0.1%NaH2PO4， 0.1 %KN03， pH6.6)中，30。C振蕩(150轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)過夜，以活化固定化細(xì)胞。 將固定化細(xì)胞裝入500毫升填充式反應(yīng)器中，在3(TC條件下，按不同流速流加 20%的蔗糖溶液，并檢測(cè)流出液中異麥芽酮糖的濃度。當(dāng)蔗糖流加速度為4毫 升/分時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率為99.9%，流出液中異麥芽酮糖與胞壁糖和葡萄糖/果糖的 濃度分別為88.0%、 11.9%、 0.1%。繼續(xù)提高蔗糖流加速度時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率逐 漸降低，但產(chǎn)物屮各種糖組分的比率沒有明顯改變。當(dāng)流加速度為8毫升/分時(shí)， 蔗糖轉(zhuǎn)化率已降低到75.3%。
權(quán)利要求
1、一種無純化步驟的異麥芽酮糖生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟第一步、蔗糖異構(gòu)酶活性細(xì)胞碎片制備將克雷伯氏菌LSI菌由保留斜面接種到100毫升蔗糖培養(yǎng)基中，在30℃、150轉(zhuǎn)/分條件下，于搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)6～8小時(shí)，按5％接種量轉(zhuǎn)接于新鮮蔗糖培養(yǎng)基中，于30℃、150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)10～12小時(shí)，超聲波破碎，制成蔗糖異構(gòu)酶活性細(xì)胞碎片懸浮液；其中，蔗糖培養(yǎng)基配方中含有2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸鎂，0.1％NaH2PO4，0.1％KNO3，pH6.6；第二步、蔗糖轉(zhuǎn)化將活性細(xì)胞碎片與10～20％蔗糖溶液按110的比例在轉(zhuǎn)化罐中混合，在保持正壓的條件下，于30℃保溫6～15小時(shí)，將蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，獲得蔗糖轉(zhuǎn)化液；第三步、濃縮結(jié)晶在65℃條件下，將上述步驟獲得的蔗糖轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真空濃縮，待糖濃度達(dá)到60～75％時(shí)，加入0.1～1％異麥芽酮糖晶種，攪拌條件下緩慢降溫，使異麥芽酮糖結(jié)晶析出，得到小顆粒結(jié)晶異麥芽酮糖；第四步、干燥將結(jié)晶的異麥芽酮糖淋洗脫色后，干燥到含水量7～8％時(shí)，獲得異麥芽酮糖結(jié)晶產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無純化步驟的異麥芽酮糖生產(chǎn)方 法，其特征在于第一步所述的蔗糖異構(gòu)酶是含有蔗糖異構(gòu)酶活性的細(xì) 胞碎片。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無純化步驟的異麥芽酮糖生產(chǎn)方 法，其特征在于第二步所述的蔗糖轉(zhuǎn)化液中不含有葡萄糖和果糖等副 產(chǎn)物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無純化步驟的異麥芽酮糖生產(chǎn)方 法，其特征在于第三步所述濃縮結(jié)晶工序中不含有異麥芽酮糖分離純 化步驟。
全文摘要
本發(fā)明是一種無需分離純化步驟直接濃縮結(jié)晶制備異麥芽酮糖的方法，其特點(diǎn)是在異麥芽酮糖制備過程中，省去了工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)利用離子交換樹脂分離純化異麥芽酮糖等繁瑣工藝，直接將蔗糖轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真空濃縮和結(jié)晶，獲得純品異麥芽酮糖。本發(fā)明首先制備含有蔗糖異構(gòu)酶活性的細(xì)胞碎片作為生物催化劑，然后催化蔗糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，形成不含有葡萄糖和果糖等副產(chǎn)品的異麥芽酮糖產(chǎn)物，再將該蔗糖轉(zhuǎn)化液直接進(jìn)行真空濃縮、結(jié)晶、干燥，即制成異麥芽酮糖結(jié)晶產(chǎn)品。本發(fā)明的方法，既能夠能夠大幅降低生產(chǎn)成本，又能節(jié)省大量生產(chǎn)用水，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
文檔編號(hào)C12P19/12GK101575629SQ20091001200
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者李憲臻 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)