專利名稱：一種快速檢測微生物的測試片及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食品微生物學安全檢驗檢測領域，具體地說，涉及一種快速檢測微生物的測 試片及其制備方法和應用。
背景技術：
現(xiàn)行國家食品衛(wèi)生微生物檢測標準方法的操作步驟繁瑣，在檢測微生物前后，需要配置 培養(yǎng)基、清洗培養(yǎng)器皿、滅菌、增菌、培養(yǎng)時間長等，同時對實驗員和實驗室的要求高。在 當今日益加快的商業(yè)貿(mào)易步伐下,傳統(tǒng)檢測方法已不能滿足食品生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)、進出口商檢、 政府管理部門的檢測需要。
測試片以紙片、冷水可凝凝膠和無紡布等作為培養(yǎng)基載體來測定食品中微生物的含量， 與國標方法比較，最大優(yōu)點是省卻了繁重的準備工作；檢樣不需要增菌，直接接種測試片， 適宜溫度培養(yǎng)后計數(shù)，使用后經(jīng)滅菌便可棄置，簡單方便，縮短檢測時間。
然而，測試片的培養(yǎng)基載體對檢測效果有重要影響，目前濾紙、凝膠和無紡布是三種主 流載體。以濾紙為載體的測試片制作工藝簡單，材料便宜，但濾孔過大，容易雙面有菌落生 長而無法準確計數(shù)；對檢測有油脂食品，濾紙吸收較慢，難以擴散使樣品液分布均勻；以無 紡布為載體的測試片，具有使樣液迅速地均勻擴散優(yōu)點，但因其不透明且無紡布層較厚，載 體下層菌落不能計數(shù)導致回收率稍低。美國3M公司的petrifilm的凝膠測試片，因片上層覆 蓋一層薄膜，當細菌產(chǎn)氣、產(chǎn)粘液過多時會出現(xiàn)菌落擴散、融合的現(xiàn)象、影響計數(shù)；另因凝 膠吸水速度較慢，樣液易溢出培養(yǎng)基范圍外，影響回收率。目前市場上的測試片均不透明， 不能正反兩面數(shù)菌以免遺漏，并且難通過自動數(shù)菌器計數(shù)；此外，除3M公司的petrifilm測 試片外，各類產(chǎn)品均不能進行下一步挑菌鑒定。
因此，研發(fā)快速，準確，簡便，能進行分離鑒定的微生物測試片，對我國的快速檢測食 品微生物安全具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方便攜帶、使用簡便、測試時間短、結果準確、可雙面數(shù)菌， 用于微生物檢測的一次性測試片，并提供所述測試片的制備方法和應用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案一種快速檢測微生物的測試片，該測試片包括底板、中間鏤空的膠片和塑料膜，中間鏤 空的膠片的底面與底板粘合，膠片中間鏤空部分形成凹槽培養(yǎng)區(qū)，所述凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)置有顯 色培養(yǎng)基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝膠劑，所述塑料膜的底面與膠片的上表面 在一側邊緣粘合。
優(yōu)選的，所述底板和膠片長寬一致；優(yōu)選的，所述塑料膜與所述膠片的寬度一致，所述 塑料膜的長度大于所述膠片的長度。
為了分辨不同的檢驗樣品，明確檢驗時間，最好在所述塑料膜上粘合一張標簽，標簽上 留有樣品名和檢驗時間的填寫欄。
所述塑料膜和底板均由防水透氣、透明、無毒的聚乙烯塑料薄膜制備而成。塑料膜厚度 為0.03~0.1 mm，長度為9~13 cm，寬度為7.0~11.0 cm。底板厚度為0.03—0.25 mm，長度為 8.CM2.0cm,寬度為7.0~11.0 cm。
所述膠片由透明、防滲透、質(zhì)量輕的聚對苯二甲酸類塑料制備而成。厚度為0.3~0.5 mm， 長度為8.0 12.0 cm，寬度為7.0~11.0 cm，中間凹槽培養(yǎng)區(qū)是直徑為4 7 cm的圓形。
所述顯色培養(yǎng)基是待測菌相應的商品培養(yǎng)基，由營養(yǎng)物質(zhì)、誘導劑和顯色劑組成，用量 為1.5~4.0xl0-3g/cm2。
所述冷水可凝的凝膠劑為多糖類，用量為1.0~4.0xl0—3g/cm2。
本發(fā)明測試片底板和膠片、膠片和塑料膜、顯色培養(yǎng)基和冷水可凝的凝膠劑都采用聚丙 烯酸樹脂壓敏膠進行粘合。
一種制備快速檢測微生物的測試片的方法，包括以下步驟
1) 按要求剪裁底板、中間鏤空的膠片和塑料膜；
2) 粘合底板和膠片的底面得到凹槽培養(yǎng)區(qū)，將顯色培養(yǎng)基粘合在凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)；
3) 將冷水可凝的凝膠劑粘合在塑料膜的底面；
4) 將膠片的上表面與塑料膜的底面在一側邊緣粘合；
5) 輻照滅菌，封裝。
所述輻照采用Co-60Y射線，輻射劑量3K 5KGy。
本發(fā)明所述測試片在檢測食源性致病微生物中的應用，包括測定菌落總數(shù)、檢測大腸桿 菌、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌等。 本發(fā)明所述的測試片的使用步驟為
1) 翻開上層塑料膜；
2) 滴加lml樣品液于中間圓形鏤空凹槽培養(yǎng)區(qū)；
43) 蓋上塑料膜；如樣品液未能均勻分散，可用手把樣品液推平；
4) 經(jīng)過合適溫度培養(yǎng)，根據(jù)菌落顯示顏色，選取跟菌落顏色對比較大的計數(shù)板組件作 為背景，置于測試片的任一面計數(shù)，或直接置于自動菌落計數(shù)器中計數(shù)。
其中計數(shù)板組件為銅版紙材料，有黃、白、黑三種顏色。網(wǎng)格大小為lxlcm,厚度為 0.03~0.25 mm，長度為9~13 cm，寬度為7.0~11.0 cm。
本發(fā)明所述的快速檢測微生物的測試片，具有以下有益效果
操作簡單，適用缺少專業(yè)檢驗人員的單位攜帶方便，不受環(huán)境條件限制；培養(yǎng)時占空 間?。蝗该?，可雙面數(shù)菌避免菌落遺漏；可用于自動數(shù)菌器計數(shù)，省時高效。


圖1是本發(fā)明快速檢測微生物的測試片的示意圖； 圖2是圖l測試片的側視圖3是本發(fā)明快速檢測微生物的測試片配套計數(shù)板的示意圖； 圖4是圖3計數(shù)板的側視附圖標記1:標簽；2:塑料膜；3膠片；4:底板。
具體實施例方式
以下通過具體實施例來說明本發(fā)明。 實施例l:本發(fā)明快速測定微生物菌落總數(shù)測試片的制備 包括以下步驟
1) 剪裁各部件，塑料膜長寬為10.5x7.5 cm;底板和膠片長寬均為9.5x7.5 cm;中間鏤空 的膠片底面與底板粘合形成直徑為6cm的圓形凹槽培養(yǎng)區(qū)；
2) 把微生物生長需要的營養(yǎng)瓊脂粉末6g和0.2gTTC混合，將0.06g混合粉末通過壓敏膠 粘合在凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)；
3) 把聚丙烯酸樹脂壓敏膠加熱成液體，均勻噴在塑料膜的底面，將0.3g冷水可凝的凝膠 劑粉末粘合在塑料膜的底面；
4) 將塑料膜的底面與膠片的上表面在一側邊緣通過壓敏膠粘合，粘合面積為7.5xl.0cm;
5) Co-60y射線，輻照劑量為5KGy滅菌；
6) 包裝備用。
5實施例2:利用實施例l測試片測定菌落總數(shù)，并和國際平板傾注法比較
1) 制備混合菌液挑取大腸桿菌(&c/2er/cWa co// 8099)、鼠傷寒沙門氏菌(SWwo"e/Zfl 0^"' CMCC 50115)、金黃色葡萄球菌(Sto/ / ;;/ococcM awe肌ATCC 6538)、金黃色葡萄球菌 (S啤ty/ococcw az/re船CMCC 26003)、銅綠假單胞菌(i^eMffo附owos aerag/wora ATCC 9027) 菌苔分別接種到5ml營養(yǎng)肉湯中，37'C培養(yǎng)18-24h后，各取lml于一支無菌試管中得到 混合菌液，調(diào)整濃度約為10Scell/ml并用生理鹽水進行10倍梯度稀釋到104、 103、 102、 101、 10°和10"cell/ml，每個濃度梯度設置三個重復，備用。
2) 翻開測試片上層塑料膜，滴加各濃度梯度混合菌液lml于凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)，蓋上塑料膜， 觀察樣液是否已經(jīng)均勻分散于測試片中央，靜置卜2min，待凝膠固化后，37t:培養(yǎng)24h， 同時使用國標平板傾注法作對比；
3) 觀察紅色點為菌落，選取跟菌落色差較大的計數(shù)板組件(黃、白、黑)作為背景，置于測試 片的任一面計數(shù)，或直接置于自動菌落計數(shù)器中計數(shù)。對測試片和傾注法的菌落總數(shù)進 行統(tǒng)計和均值t檢驗，結果表明，兩者生長菌落數(shù)量無顯著差異(^0.0397,p-0.8516X).05)。
表1兩種方法測定混合菌液的菌落總數(shù)(^ ±S， n=3)
菌液濃度(cell/ml)空白10410310210110。10"
測試片-菌落總數(shù)0不能計數(shù)不能計數(shù)315±842±25±10
傾注法-菌落總數(shù)0不能計數(shù)不能計數(shù)338±1644±64±0.60
實施例3:利用實施例l測試片目測不同菌種菌落數(shù)，并和自動菌落計數(shù)器測定結果比較
1) 制備菌液取各菌苔大腸桿菌(&cten'c/n'a co/z' 8099)、鼠傷寒沙門氏菌(&// 0恥//" CMCC 50115)、金黃色葡萄球菌(Sto/7/ y/ococcMS awews ATCC 6538)、金黃色葡萄球菌 OSto/ /^/ococcus CMCC 26003)、銅綠假單胞菌(i^etw/omo"(xy aerag/"ora ATCC 9027) 接種到5ml營養(yǎng)肉湯中，37。C培養(yǎng)18-24h后，各取lml于無菌試管中，用生理鹽水10 倍梯度稀釋至各菌液濃度為10'Cell/ml，每株菌液設置兩個重復，備用。
2) 取五個測試片，分別測定步驟l)五種菌液。翻開測試片上層塑料膜，滴加濃度1(/cell/ml 的菌液lml于下層鏤空凹槽位置，蓋上塑料膜，觀察樣液是否已經(jīng)均勻分散于測試片中 央，靜置l-2min，待凝膠固化后，37。C培養(yǎng)24h;
3) 觀察紅色點為菌落，選取跟菌落色差較大的計數(shù)板組件(黃、白、黑)作為背景，置于測試 片的任一面目測計數(shù)，之后直接置于自動菌落計數(shù)器中計數(shù)。對測試片目測和自動菌落 計數(shù)器的菌落數(shù)進行統(tǒng)計和均值t檢驗，結果表明，兩者無顯著差異(1=0.0739，表2各菌株測試片目測和自動菌落計數(shù)器的菌落數(shù)(5±S， n=2)
視!l試菌株大腸桿菌 8099鼠傷寒沙門氏菌 CMCC 50115金葡菌 ATCC6538金葡菌 CMCC26003銅綠假單胞菌 ATCC卯27
目測菌落數(shù)715575955
自動數(shù)菌器菌落數(shù)716566058
實施例4:利用本發(fā)明的測試片與傾注法對金黃色葡萄球菌菌株的回收率測定比較
1) 按實施例1的測試片制備方法制備金黃色葡萄球菌測試片，所不同的是凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)粘 合的是購買的0.06g金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基；
2) 制備菌液挑取金黃色葡萄球菌(StapAj&cocc附ATCC 6538)、金黃色葡萄球菌 (&aMy/ocwc附CMCC 26003)菌苔分別接種到5ml營養(yǎng)肉湯中，37'C培養(yǎng)18-24h 后，各取lml用生理鹽水IO倍梯度稀釋至金黃色葡萄球菌菌液濃度為102Cell/ml，每株 菌設置三個重復，備用。
3) 翻開測試片t層塑料膜，滴加步驟2)菌液lml于下層鏤空凹槽培養(yǎng)區(qū)位置，蓋上塑料膜， 觀察樣液是否已經(jīng)均勻分散于測試片中央，靜置l-2min,待凝膠固化后，37'C培養(yǎng)24h， 計數(shù)；以lml菌液傾注金黃色葡萄球菌顯色平板，37'C培養(yǎng)24h，作為對照，按照國標傾 注法規(guī)范步驟進行操作計數(shù)。
4) 以紫色和粉紅色的菌落為陽性菌落，計算回收率。對比在測試片和傾注法中的回收率， 金黃色葡萄球菌ATCC6538， CMCC26003回收率均為100%。
回收率=(測試片菌落數(shù)/傾注法菌落數(shù))><100% ，若數(shù)值大于100%計為100%。 表3各菌株用測試片和傾注法測定的回收率 金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌 平均
測試菌株
ATCC6538 CMCC26003 回收率(％)
傾注法
198 206
菌落數(shù)
測試片 198 220
96.5
菌落數(shù) (100) (100)
7注表中數(shù)據(jù)為各測試菌株用測試片和傾注法測定的菌落數(shù)平均值(cfW片或cfu/皿)，括號中 為回收率(％)。
實施例5:利用本發(fā)明的測試片與傾注法對沙門氏菌菌株的回收率測定比較
1) 按實施例1的測試片制備方法制備沙門氏菌測試片，所不同的是凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)粘合的是 購買的0.06g沙門氏菌顯色培養(yǎng)基；
2) 制備菌液挑取鼠傷寒沙門氏菌(5Wm朋e〃a CMCC 50115)菌苔接種到5ml營養(yǎng)肉湯 中，37X:培養(yǎng)18-24h后，取lml用生理鹽水10倍梯度稀釋至沙門氏菌菌液濃度為 102Cell/ml，設置三個重復，備用。
3) 翻開測試片上層塑料膜，滴加步驟2)菌液lml于下層鏤空凹槽培養(yǎng)區(qū)位置，蓋上塑料膜， 觀察樣液是否已經(jīng)均勻分散于測試片中央，靜置l-2min，待凝膠固化后，37'C培養(yǎng)24h， 計數(shù)；以lml菌液傾注沙門氏菌顯色平板，37'C培養(yǎng)24h,作為對照，按照國標傾注法規(guī) 范步驟進行操作計數(shù)。
4) 以紫色和粉紅色的菌落為陽性菌落，計算回收率。對比在測試片和傾注法中的回收率， 傷寒沙門氏菌CMCC50115回收率為88.5%。
回收率=(測試片菌落數(shù)/傾注法菌落數(shù))><100% ，若數(shù)值大于100%計為100%。 表4沙門氏菌用測試片和傾注法測定的回收率
測試菌株鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115
傾注法菌落數(shù)226
測試片菌落數(shù)200(88.5)
注表中數(shù)據(jù)為各測試菌株用測試片和傾注法測定的菌落數(shù)平均值(cfu/片或cfo/皿)，括號中
為回收率(％)。
實施例6:利用本發(fā)明的測試片與傾注法對大腸桿菌菌株的回收率測定比較
1) 按實施例1的測試片制備方法制備大腸菌群測試片，所不同的是凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)粘合的是
購買的0.06g大腸菌群顯色培養(yǎng)基；
2) 制備菌液挑取大腸桿菌(五"/^/cM7 co// 8099)、大腸桿菌C&c/^r/c/2,'" co//J7UC 25922) 菌苔分別接種到5ml營養(yǎng)肉湯中，37。C培養(yǎng)18-24h后，各取lml用生理鹽水10倍梯度 稀釋至大腸桿菌菌液濃度為102Cell/ml,每株菌設置三個重復，備用。
3) 翻開測試片上層塑料膜，滴加步驟2)菌液lml于下層鏤空凹槽培養(yǎng)區(qū)位置，蓋上塑料膜，
8觀察樣液是否已經(jīng)均勻分散于測試片中央，靜置l-2min，待凝膠固化后，37'C培養(yǎng)24h, 計數(shù)；以lml菌液傾注大腸菌群顯色平板，37'C培養(yǎng)24h,作為對照，按照國標傾注法規(guī) 范步驟進行操作計數(shù)。
4)以藍色和綠色的菌落為陽性菌落，計算回收率。對比在測試片和傾注法中的回收率，大 腸桿菌8099回收率為93.8%，大腸桿菌ATCC 25922回收率為98.1%，相對傾注法菌落 數(shù)平均回收率為96%。
回收率=(測試片菌落數(shù)/傾注法菌落數(shù))><100% ，若數(shù)值大于100%計為100%。 表5大腸桿菌用測試片和傾注法測定的回收率 大腸桿菌 大腸桿菌 平均
測試菌株
ATCC 259228099 回收率(％)
傾注法
105 160
菌落數(shù)
測試片 103 150
96
菌落數(shù) (98.1) (93.8)
注表中數(shù)據(jù)為各測試菌株用測試片和傾注法測定的菌落數(shù)平均值(cfu/片或cftl/皿)，括號中 為回收率(％)。
權利要求
1. 一種快速檢測微生物的測試片，其特征在于該測試片包括底板、中間鏤空的膠片和塑料膜，中間鏤空的膠片的底面與底板粘合，膠片中間鏤空部分形成凹槽培養(yǎng)區(qū)，所述凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)置有顯色培養(yǎng)基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝膠劑，所述塑料膜的底面與膠片的上表面在一側邊緣粘合。
2. 根據(jù)權利要求1所述的測試片，其特征在于所述底板和膠片長寬一致。
3. 根據(jù)權利要求2所述的測試片，其特征在于所述塑料膜與所述膠片的寬度一致，所述 塑料膜的長度大于所述膠片的長度。
4. 根據(jù)權利要求l-3任一項所述的測試片，其特征在于所述塑料膜的上表面設有標簽層。
5. 根據(jù)權利要求1所述的測試片，其特征在于所述底板、塑料膜由聚乙烯塑料薄膜制備而成，所述膠片由聚對苯二甲酸類塑料制備而成，所述膠片厚度為0.3 0.5 mm。
6. 根據(jù)權利要求1所述的測試片，其特征在于所述膠片中間鏤空部分為直徑4 7cm的圓 形。
7. 根據(jù)權利要求1所述的測試片，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基由待測菌相應的營養(yǎng)物質(zhì)、 誘導劑和顯色劑組成，用量為1.5~4.0xl(T3g/cni2;所述冷水可凝的凝膠劑為多糖，用量為 1.0~4.0xl0-3g/cm2。
8. —種制備如權利要求1所述的快速檢測微生物的測試片的方法，其特征在于包括以下 步驟1) 按要求剪裁底板、中間鏤空的膠片和塑料膜；2) 粘合底板和膠片的底面得到凹槽培養(yǎng)區(qū)，將顯色培養(yǎng)基粘合在凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)；3) 將冷水可凝的凝膠劑粘合在塑料膜的底面；4) 將膠片的上表面與塑料膜的底面在一側邊緣粘合；5) 輻照滅菌，封裝。
9. 根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述輻照采用Co-60y射線，輻射劑量 3K 5KGy。
10. 權利要求1所述的測試片在檢測食源性致病微生物中的應用。
11. 根據(jù)權利要求IO所述的應用，其特征在于所述食源性致病微生物為大腸桿菌、大腸菌 群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測定微生物的測試片及其制備方法和應用，該測試片包括底板、中間鏤空的膠片和塑料膜，中間鏤空的膠片的底面與底板粘合，膠片中間鏤空部分形成凹槽培養(yǎng)區(qū)，所述凹槽培養(yǎng)區(qū)內(nèi)置有顯色培養(yǎng)基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝膠劑，所述塑料膜的底面與膠片的上表面在一側邊緣粘合。本發(fā)明測試片上下層粘合后輻照滅菌包裝備用。本發(fā)明所述測試片能應用于菌落總數(shù)、大腸桿菌、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌等食源性致病微生物檢測，操作簡單，攜帶方便，測試時間短、結果準確、可雙面數(shù)菌。
文檔編號C12R1/42GK101497914SQ20091000791
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權日2008年12月30日
發(fā)明者吳清平, 吳許文, 張菊梅, 蔡芷荷, 郭偉鵬, 黃汝添 申請人:廣東省微生物研究所