專利名稱：：一種煙草黑脛病菌接種體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種煙草黑脛病菌接種體的制備方法。
背景技術(shù)：
：煙草黑脛病(tobaccoblackshank)是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一，特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發(fā)生較重，是我國煙草的主要病害。目前，在實驗室、溫室有采用平板菌絲塊、發(fā)酵攪碎菌絲液、游動孢子液等制備煙草黑脛病菌接種體的方法。這幾類方法制備的接種體一般不適用于大田人工接種。在田間煙草黑脛病菌接種體應(yīng)用較多的是谷物培養(yǎng)接種體，主要供煙草種質(zhì)資源抗性鑒定或藥劑篩選時人工接種病原物用。這種谷物培養(yǎng)制備方法的培養(yǎng)周期較長，通常需要45~60天；且培養(yǎng)時容易污染雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。此外，培養(yǎng)成本相對較高。因此，如何更為有效的制備煙草黑脛病菌接種體，就成為煙草育種、植保工作中亟待解決的技術(shù)問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種經(jīng)濟有效的煙草黑脛病菌接種體的制備方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。除非另有說明，本發(fā)明所釆用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。一種煙草黑脛病菌接種體的制備方法，包括以下步驟1、從發(fā)病田塊中釆集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力篩選測定，獲得強致病力病菌，菌種釆用菌絲塊水浸法置于1(TC條件下恒溫保存，備用；2、將煙草黑脛病菌菌絲塊移到試管平板培養(yǎng)基上，在28'C下恒溫培養(yǎng)5-6天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較致密菌絲層的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；所述的平板培養(yǎng)基配方為燕麥片30g，瓊脂1720g，蒸餾水1000ml，pH自然；3、用解剖刀切取煙草黑脛病菌菌絲塊置于液體培養(yǎng)基中，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲24塊，150轉(zhuǎn)/分鐘、28。C恒溫培養(yǎng)78天；所述的液體培養(yǎng)基配方為燕麥片30g,蒸餾水1000ml，pH自然；培養(yǎng)得到的液體菌液要求菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產(chǎn)生游動孢子囊，并發(fā)現(xiàn)液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；所述的菌絲塊大小為2-4mmx2~4mm。所述的培養(yǎng)液占容器容積的30%~50%。4、按3%~5%的體積比將液體菌液置于盛有固體培養(yǎng)基三角瓶中，在28。C下恒溫培養(yǎng)10-12天，所述的固體培養(yǎng)基配方為粒徑1-3mm的粗米糠和粗麥麩以8:2的質(zhì)量比混勻，加入45%的清水，充分混勻；培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物要求菌絲長滿整個固體基質(zhì)，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導(dǎo)，鏡檢可產(chǎn)生游動孢子囊，液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子，每亳升孢子含量在105個以上；所述的固體培養(yǎng)基占容器容積的50%~80%。5、將合格的固體培養(yǎng)物破碎成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌絲塊，再加入三分之一質(zhì)量比的新鮮、干燥粗米糠、粗麥麩，米糠和麥麩按8:2的質(zhì)量比混勻，攪碎、混勻，平鋪，通風晾干2-3天，待水分降至35%~40%時，即為所需的煙草黑脛病菌接種體。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點1、可縮短培養(yǎng)時間10-15天；2、培養(yǎng)獲得的.接種體顆粒比通常用的谷粒小，顆粒大小為2~3毫米，接種體容易分散；3、接種體有效侵染數(shù)量大，具有擴大培養(yǎng)的潛力，污染雜菌少。具體實施例方式通過下面給出的實施例和應(yīng)用實施例，可以進一步清楚地了解本發(fā)明,但它們不是對本發(fā)明的限定。實施例l制備煙草黑脛病菌接種體，首先需要通過分離、培養(yǎng)、致病力測定獲得強致病力病菌。通?？舍娪镁z塊貼接法、游動孢子灌根法接種病菌，測定發(fā)病情況，發(fā)病嚴重的菌株致病力強一些，以保證接種的有效性、可比性。然后培養(yǎng)制備接種體，培養(yǎng)釆用平板、液體、固體3級培養(yǎng)的方式進行，再進行制備，本例采用游動孢子灌根法接種篩選獲得的強致病力菌株98Pn022實施，具體如下①平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)基配方為CA:燕麥片30g,瓊脂1720g,蒸餾水1000ml，pH自然。將4塊煙草黑脛病菌98Pn022的菌絲塊移到試管平板培養(yǎng)基上，在28。C恒溫培養(yǎng)56天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較致密菌絲層的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種。②液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為CA:燕麥片30g,蒸餾水1000ml，pH自然。用解剖刀切取薄薄的一層煙草黑脛病菌98Pn022的菌絲塊，菌絲塊大小約為4mmx4mm,移到盛有250毫升培養(yǎng)液的500毫升三角瓶中，每瓶接種菌絲68塊，150轉(zhuǎn)/分鐘、28。C恒溫培養(yǎng)78天。選擇菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產(chǎn)生游動袍子囊，并發(fā)現(xiàn)液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子，每毫升孢子含量在105個.以上，作為固體培養(yǎng)的菌種。③固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基配方為l亳米篩不能通過的粗米糠、粗麥麩以8:2的質(zhì)量比混勻，按質(zhì)量45%的比例加自來水，充分混勻。用10毫升移液槍移取1520亳升液體菌液到盛有固體培養(yǎng)基(至400毫升刻度處)的500毫升三角瓶，28。C恒溫培養(yǎng)1(K12天。選擇菌絲長滿整個固體基質(zhì)，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導(dǎo)，鏡檢可產(chǎn)生游動孢子囊，并發(fā)現(xiàn)液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子(每毫升105個以上)，即為合格的固體培養(yǎng)物。④接種體的制備將封閉長滿菌絲的固體培養(yǎng)物用25cm的鑷子扳成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌絲塊，再加入三分之一質(zhì)量比的新鮮、干燥粗米糠、粗麥麩(8:2的質(zhì)量比混勻)，攪碎、混勻，平鋪，通風晾干23天，待水分降至35%~40%，即為所需的煙草黑脛病菌接種體，分裝有孔塑料袋中，室溫保存，備用。應(yīng)用實施例l品種抗性評價1.1材料與方法l丄l材料供試接種病原為強致病力煙草疫霉98Pn022。供試品種為紅花大金元、K326、云煙97、NC89。1.1.2方法1丄2.1供試病原接種體的制備煙草黑脛病菌接種體的制備強致病力煙草疫霉98Pn022菌株固體接種體按實施例l進行。U.2.2抗性測定品種的小區(qū)布置試驗處理為4個處理，待測定的4個品種，每個品種為l個處理。每處理植煙20株，3次重復(fù)。小區(qū)隨機排列。管理與種植同優(yōu)質(zhì)烤煙模式。試驗用地約0.5畝。L1.2.3病菌人工接種移栽后的第四天在煙株根脛部周圍株施煙草黑脛病菌固體接種體(本發(fā)明制備的接種體)3g，澆水后，培土。U.2.4病情調(diào)查在煙草黑脛病菌接種前一天，進行一次病情基數(shù)調(diào)查，接種后的第80天調(diào)查一次病情。調(diào)查各處理的全部植株，調(diào)査記載釆用YC/T39-1996"煙草病害分級及調(diào)查方法"中煙草根莖病害的行業(yè)標準。1.2結(jié)果與分析品種抗性測定結(jié)果見表1,以病情指數(shù)大于30為感病、20《病情指數(shù)<30為中度感病、10<病情指數(shù)<20為中度抗病、小于10為抗病進行評價，可以看出紅花大金元中度感病，云煙97、K326、NC89抗病。表l待測抗性品種的測定結(jié)果品種病情指數(shù)抗性評價紅花大金元27.5MS云煙978.3RK3266.7RNC897.5R應(yīng)用實施例2田間小區(qū)篩選拮抗煙草黑脛病的生防菌2.1材料與方法2丄1材料供試拮抗菌為溫室盆栽篩選的6個菌株GP1、GP3、GP8、GP13、、GP16、GP20。供試接種病原為強致病力煙草疫霉98Pn022。供試品種為紅花大金元。2丄2方法2丄2.1供試菌株接種體的制備煙草黑脛病菌接種體的制備強致病力煙草疫霉98Pn022菌株固體接種體按實施例l進行。拮抗菌菌懸液的制備挑取活化23次的6個待測菌株各一環(huán)，分別接種于300mlNA液體培養(yǎng)基中，28°C、150r/m振蕩培養(yǎng)72小時，用滅菌水配成1()6々cfu/ml的菌懸液。2丄2.2生防菌劑的小區(qū)處理試驗處理為6個篩選菌株處理、甲霜靈錳鋅藥劑對照處理(CK*)、培養(yǎng)液處理(CK)，共8個處理。每處理植煙20株，3次重復(fù)。小區(qū)隨機排列。管理與種植同優(yōu)質(zhì)烤煙模式。試驗用地約0.5畝。2丄2.3生防菌劑的施用生防菌劑的施用釆用灌根的方法，于移栽后的第二天進行，每處理每株灌注0.25升。移栽后的第四天在煙株根脛部周圍株施本發(fā)明接種體3g,澆水后，培土。2丄2.4病情調(diào)查在煙草黑脛病菌接種前一天，進行一次病情基數(shù)調(diào)查，接種后的第20天、第40天、第60天、第80天各調(diào)查一次病情。每次調(diào)查各處理的全部植株，調(diào)查記載釆用YC/T39-1996"煙草病害分級及調(diào)查方法"中煙草根莖病害的行業(yè)標準。2.2結(jié)果與分析拮抗菌的田間小區(qū)防治試驗結(jié)果(表2)表明，溫室篩選的6個菌株在大田中對黑脛病均具有一定的防治效果，其中GP13防治效果較顯著，與對照的化學藥劑甲霜靈錳鋅效果接近，防效穩(wěn)定在77.53%-93.33%。表2拮抗菌防治黑脛病的田間小區(qū)試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注CK+為甲霜靈錳鋅藥劑對照，表中的數(shù)字為三個重復(fù)處理的平均值。權(quán)利要求1、一種煙草黑脛病菌接種體的制備方法，包括以下步驟:(1)從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力篩選測定，獲得強致病力病菌，菌種采用菌絲塊水浸法置于10℃條件下恒溫保存，備用；(2)將煙草黑脛病菌菌絲塊移到試管平板培養(yǎng)基上，在28℃下恒溫培養(yǎng)5～6天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較致密菌絲層的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；所述的平板培養(yǎng)基配方為:燕麥片30g，瓊脂17～20g，蒸餾水1000ml，pH自然；(3)用解剖刀切取煙草黑脛病菌菌絲塊置于液體培養(yǎng)基中，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2～4塊，150轉(zhuǎn)/分鐘、28℃恒溫培養(yǎng)7～8天；所述的液體培養(yǎng)基配方為:燕麥片30g，蒸餾水1000ml，pH自然；培養(yǎng)得到的液體菌液要求:菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產(chǎn)生游動孢子囊，并發(fā)現(xiàn)液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；(4)按3％～5％的體積比將液體菌液置于盛有固體培養(yǎng)基三角瓶中，在28℃下恒溫培養(yǎng)10～12天，所述的固體培養(yǎng)基配方為:粒徑1～3mm的粗米糠和粗麥麩以8:2的質(zhì)量比混勻，加入45％的清水，充分混勻；培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物要求:菌絲長滿整個固體基質(zhì)，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導(dǎo)，鏡檢可產(chǎn)生游動孢子囊，液體中有大量帶有鞭毛的游動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；(5)將合格的固體培養(yǎng)物破碎成0.5～1cm×0.5～1cm大小的菌絲塊，再加入三分之一質(zhì)量比的新鮮、干燥粗米糠、粗麥麩；米糠和麥麩按8:2的質(zhì)量比混勻，攪碎、混勻，平鋪，通風晾干2～3天，待水分降至35％～40％時，即為所需的煙草黑脛病菌接種體。2、根據(jù)權(quán)力要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的菌絲塊大小為2~4mmx2—4mm。3、根據(jù)權(quán)力要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的培養(yǎng)液占容器容積的30%~50%。4、根據(jù)權(quán)力要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的所述的固體培養(yǎng)基占容器容積的50%~80%。全文摘要本發(fā)明公開了一種煙草黑脛病菌接種體的制備方法。煙草黑脛病菌菌絲塊在28℃下恒溫培養(yǎng)5～6天，培養(yǎng)物置于液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分鐘、28℃恒溫培養(yǎng)7～8天，按3％～5％的體積比將液體菌液置于固體培養(yǎng)基中，在28℃下恒溫培養(yǎng)10～12天，合格的固體培養(yǎng)物破碎成菌絲塊，再與粗米糠、粗麥麩混勻，平鋪，通風晾干，待水分降至35％～40％時，即為所需的煙草黑脛病菌接種體。運用該技術(shù)可縮短培養(yǎng)時間10～15天，培養(yǎng)獲得的接種體容易分散，且有效侵染數(shù)量大，具有擴大培養(yǎng)的潛力，污染雜菌少。本發(fā)明操作簡便，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號C12R1/645GK101381685SQ200810233499公開日2009年3月11日申請日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者盧秀萍,宋春滿,方敦煌,李永平申請人:云南省煙草科學研究所