煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的雙重pcr分子檢測引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病蟲害檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的雙重PCR分子檢測引物及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草是產(chǎn)量、質(zhì)量并重，尤其重視質(zhì)量的作物，而科學(xué)防治病蟲害是保障煙草正常生長發(fā)育，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的關(guān)鍵。煙草黑脛病和根黑腐病(煙草兩黑病)是世界性的病害，這兩種病時常會相伴發(fā)生，一旦發(fā)病就會造成巨大的經(jīng)濟損失，在我國云南、貴州、湖北等主要產(chǎn)煙區(qū)發(fā)生較重，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達30%以上。山東、河南、安徽、吉林、福建等產(chǎn)煙區(qū)也有發(fā)生，近年有加重危害的趨勢。但是，煙草黑脛病菌和根黑腐病菌作為時常相伴發(fā)生的兩種土傳真菌，進行單一檢測勢必造成諸多麻煩，費工費時，目前對其雙重檢測還未見報道，更未形成特異性和高靈敏性體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性和高靈敏性的煙草黑脛病菌和根黑腐病菌雙重PCR分子檢測引物，并提供了其檢測方法，建立了特異性和高靈敏性的煙草兩黑病菌雙重PCR分子檢測體系。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
設(shè)計一種煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的雙重PCR分子檢測引物，包括以下引物對: YY1-F:TCATTACCACACCTAAAAAACT,
YY1-R:ACTTTCGTCCCCACAGTATATT ；
TB1419-F:GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG，
TB1419-R:AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
[0005]設(shè)計一種煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的雙重PCR分子檢測方法，包括以下步驟: (O提取待檢測煙株、土壤或其混合材料中的總DNA ；
(2)以所述總DNA為模板用權(quán)利要求1所述引物進行PCR擴增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5u/^L rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10Mmol/L 的 YY1-F、YY1-R、TB1419-F 和TB1419-R 引物，Iμ? 的總 DNA, 1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP, 1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ?的10XPCR Buffer，余量為ddH20 ;PCR擴增程序:95°C預(yù)變性4min，35個循環(huán)的95°C變性30s、59。。退火50s和72°C延伸30s，最后在72°C延伸5min ；
(3)取所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如在208bp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草黑脛病菌，反之則不攜帶；如在I3Ibp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草根黑腐病菌，反之則不攜帶。
[0006]對于上述的雙重PCR分子檢測方法，所述總DNA濃度不小于50ng/^L。
[0007]本發(fā)明的積極有益效果: (O本發(fā)明在綜合考量DNA序列的保守區(qū)、是否形成二級結(jié)構(gòu)、G+C含量、堿基隨機分布、長度、相似序列的干擾等眾多因素的基礎(chǔ)之上，并經(jīng)過必要的修飾及大量的試驗驗證，最終設(shè)計并篩選出了特異性和高靈敏性的煙草黑脛病菌和根黑腐病菌雙重PCR分子檢測引物，并提供了其檢測方法，建立了特異性和高靈敏性的煙草兩黑病菌雙重PCR分子檢測體系，通過檢測煙株病殘體、土壤或其混合材料的全DNA序列，完成了煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的快速準(zhǔn)確超低濃度一次雙重鑒定，并進一步實現(xiàn)了對不同耕作栽培條件下病害風(fēng)險的精確預(yù)警性監(jiān)測，顯著提高了煙草雙黑病的防治水平，滿足煙葉生產(chǎn)上的迫切需求。
[0008](2 )本發(fā)明雙重PCR分子檢測可以以兩對引物對兩種目標(biāo)模板同時進行反應(yīng)，所以，對引物的設(shè)計要求較高，在兩對引物之間不能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，因此，引物的設(shè)計在保證引物擴增特異性和靈敏性的同時，還要符合雙重PCR的條件。
[0009](3)本發(fā)明所選作檢測用的目標(biāo)序列是煙草黑脛病菌的rDNA-1TS與煙草根黑腐病菌的rDNA-1TS序列，這兩種病原菌的rDNA-1TS序列相似性極高，在設(shè)計引物時難度極大，本發(fā)明檢測引物及檢測體系克服了長期以來的因序列近似度高而難以進行雙重PCR分子檢測的技術(shù)難題。
【附圖說明】
[0010]圖1本發(fā)明引物的特異性鑒定(一)瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中M為DL 2000 DNA Marker，I為煙草根黑腐病菌，2為煙草黑脛病菌，3為鐮刀菌，4為煙草赤星病菌，5為煙草灰霉菌，6為正常煙葉，7為煙草角斑病菌，8為煙草蛙眼病菌，CK為ddH20空白對照，上述各病原菌的rDNA-1TS序列均有較高的相似性。
[0011]圖2本發(fā)明引物的特異性鑒定(二)瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中M為DL 2000 DNA Marker，I?4分別為煙草根黑腐病菌和煙草黑脛病菌混合菌
1、煙草根黑腐病菌和煙草黑脛病菌混合菌2、煙草根黑腐病菌、煙草黑脛病菌，CK為ddH20空白對照。
[0012]圖3本發(fā)明實施例2檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中M為DL 2000 DNA Marker，I?8分別為煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的混合DNA、土樣 DNA1、土樣 DNA2、土樣 DNA3、土樣 DNA4、土樣 DNA 5、土樣 DNA 6、土樣 DNA7，CK 為 ddH20空白對照。
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0014]實施例1
一種煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的雙重PCR分子檢測引物，引物對如下:
YY1-F:TCATTACCACACCTAAAAAACT,
YY1-R:ACTTTCGTCCCCACAGTATATT ；
TB1419-F:GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG，
TB1419-R:AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
[0015]本發(fā)明引物的特異性鑒定試驗: (一)分別以煙草根黑腐病菌的基因組DNA 50ng/^L、黑脛病菌的基因組DNA 50ng/^L，以及同濃度的煙草赤星病菌、煙草灰霉病菌、煙草蛙眼病菌、煙葉、煙草灰斑病菌和鐮刀菌的基因組DNA為模板，用本發(fā)明所述引物進行PCR擴增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5u/^L rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10Mmol/L 的 YYI_F、YY1-R、TB1419_F 和 TB1419-R 引物，1? 的總 DNA, 1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP，1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ? 的