專利名稱：一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是(產(chǎn)自云南熱帶地區(qū))暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種的 培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(P/^e/w/ws porte/7fows)是一種味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，深受 產(chǎn)地消費者喜愛的美味食用菌。目前仍不能人工栽培，市場上銷售的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實 體均采自野生自然生長。液體發(fā)酵是微生物產(chǎn)品規(guī)模擴大生產(chǎn)的基本方法，它不受環(huán)境與 氣候條件的影響、限制，短時間內(nèi)可獲得大量的生物產(chǎn)品，工藝易于放大，重復性、安全 性好。
目前由于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體不能規(guī)模人工栽培，野生牛肝菌資源不能滿足人們的 需求，菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)是解決這一問題的最好方法。發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體即是液體菌種， 液體菌種接種于固體培養(yǎng)基是固體菌種擴培的有效途徑。
產(chǎn)自于云南的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，有較好的食用及藥用價值， 是一種較好的保建食品。由于受氣候季節(jié)條件的限制產(chǎn)量有限，需通過大量發(fā)酵培養(yǎng)獲得 菌絲體以滿足其在食品行業(yè)的需求。固體菌種的培養(yǎng)也需要液體種作為二級接種體。因此， 迫切需要提供一種有效的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種快速培養(yǎng)方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種的培養(yǎng)方法按以下步驟進行 a、用菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下 述原料及方法配制而成
馬鈐薯150 200g
蔗糖15 20g
酒石酸銨卜2g
MgS041 2 g
KH2P04l 2g
瓊脂 15 20g 水 1000ml pH 6.0
方法
al)將新鮮馬鈐薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水， 煮沸20分鐘過濾取濾液，加入蔗糖、瓊脂、酒石酸銨、MgS04、 KH2P04，煮沸至瓊脂 完全溶化，pH值6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，120。C滅菌30分鐘，
待冷卻后在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿中即可使用；
a2)在超凈工作臺中無菌操作，用解剖刀分離子實體組織塊，置于有母種培養(yǎng)基的培 養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌絲體生長并擴繁；
a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體，去掉子實體表面的泥沙，先用清水沖洗凈， 涼干然用75%酒精溶液消毒子實體表面，在超凈工作臺中，將子實體一掰為二，用解剖刀 取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3mm的菌肉組織塊放于倒有菌種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于 28。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng)皿，得母種。
b、用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下
馬鈐薯 150 200g
蔗糖 15 20g
酒石酸銨 l 2g
MsS04 卜2 g
KH2P04 l 2g
水 1000ml
pH 6.0
制備方法
bl)將新鮮馬鈐薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水，
煮沸20分鐘過濾取濾液，在濾液加入蔗糖、酒石酸銨、MgS04、 KH2P04，混勻，pH值 6.0，得液體培養(yǎng)基；將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶300ml， 12(TC滅菌30 分鐘，待冷卻后備用；
b2)將在上述步驟a3中獲得的母種轉(zhuǎn)管活化后，將菌絲體連同培養(yǎng)基切成2mm 4mm 的碎菌塊接種于步驟bl中瓶裝的培養(yǎng)基中，在28'C， 125r/min回旋式搖床中振蕩培養(yǎng)，
培養(yǎng)8天得到液體菌種。
本發(fā)明提供的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種培養(yǎng)方法，與已報道的牛肝菌的液體培養(yǎng)配方 相比較有如下優(yōu)點①培養(yǎng)基營養(yǎng)成份簡單，培養(yǎng)基配方中只用了簡單的碳氮源(馬鈐薯、 庶糖、酒石酸銨)及一般的無機鹽(MsS04、 KH2P04 )，即可進行母種及液體菌種的培養(yǎng)；② 培養(yǎng)方法簡便，培養(yǎng)皿和搖床即可進行母種及液體菌種的培養(yǎng)；③菌絲、菌球生長速度快。 28。C溫度條件下，培養(yǎng)30天母種即可長滿10cm的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)8天液體種的菌絲球均勻 分布懸浮于三角瓶的液體培養(yǎng)基中，且生長均勻，大小一致，色澤金黃。用該液體菌種接 種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體菌種，接種3天后菌絲開始萌發(fā)生長吃料。
具體實施例方式
實施例1
a、 用菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下 述原料及方法配制而成-
原料馬鈐薯200g，蔗糖20g，酒石酸銨2g， MgS04lg， KH2P04 lg，瓊脂15g，水 1000ml
制備方法-
al)將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水， 煮沸20分鐘過濾取濾液，加入蔗糖、瓊脂、酒石酸銨、MgS04、 KH2P04，煮沸至瓊脂 完全溶化，pH值6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，12(TC滅菌30分鐘， 待冷卻后在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿中即可使用；
a2)在超凈工作臺中無菌操作，用解剖刀分離子實體組織塊，置于有母種培養(yǎng)基的培 養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌絲體生長并擴繁；
a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體，去掉子實體表面的泥沙，先用清水沖洗凈， 涼干然用75%酒精溶液消毒子實體表面，在超凈工作臺中，將子實體一掰為二，用解剖刀 取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3mra的菌肉組織塊放于倒有菌種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于 28。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng)皿，得母種。
b、 用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下馬鈐薯200g，蔗 糖20g，酒石酸銨2g， MsS04 lg， KH2P04lg，水1000ml;
制備方法
bl)將新鮮馬鈐薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水，
煮沸20分鐘過濾取濾液，在濾液加入蔗糖、酒石酸銨、MgS04、 KH2P04，混勻，pH值 6.0，得液體培養(yǎng)基；將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶300ml， 12(TC滅菌30 分鐘，待冷卻后備用；
b2)將在上述歩驟a3中獲得的母種轉(zhuǎn)管活化后，將菌絲體連同培養(yǎng)基切成2mm 4mm 的碎菌塊接種于歩驟bl中瓶裝的培養(yǎng)基中，在2『C， 125r/min回旋式搖床中振蕩培養(yǎng)， 培養(yǎng)8天得到液體菌種。
將液體菌種接種于適宜的固體培養(yǎng)基中可以培養(yǎng)得到固體菌種。
實施例2:
a、 用菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下 述原料及方法配制而成
原料馬鈐薯150g，蔗糖15g，酒石酸銨lg， MgS042 g， KH2P042g，瓊脂20g， 水1000ml;
以下步驟與實施例l相同。
b、 用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下馬鈐薯150g，蔗 糖15 g，酒石酸銨lg， MgS04 2 g， KH2P04 2g，水1000ml;
以下步驟與實施例l相同。
權(quán)利要求
1. 一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種培養(yǎng)方法，其特征在于按以下步驟進行a、用菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下述原料及方法配制而成馬鈐薯 150～200g蔗糖 15～20g酒石酸銨 1～2gMgSO41～2gKH2PO4 1～2g瓊脂 15～20g水 1000mlpH 6.0方法a1)將新鮮馬鈐薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水，煮沸20分鐘過濾取濾液，加入蔗糖、瓊脂、酒石酸銨、MgSO4、KH2PO4，煮沸至瓊脂完全溶化，pH值6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，120℃滅菌30分鐘，待冷卻后在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿中即可使用；a2)在超凈工作臺中無菌操作，用解剖刀分離子實體組織塊，置于有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌絲體生長并擴繁；a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體，去掉子實體表面的泥沙，先用清水沖洗凈，涼干然用75％酒精溶液消毒子實體表面，在超凈工作臺中，將子實體一掰為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3mm的菌肉組織塊放于倒有菌種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng)皿，得母種。
全文摘要
本發(fā)明是一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體菌種的培養(yǎng)方法。其特征是使用馬鈐薯、蔗糖、瓊脂、酒石酸銨、MgSO₄、KH₂PO₄水等原料按照一定比例配制菌種培養(yǎng)基和液體菌種培養(yǎng)基，培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體離體部分制備菌種，使用液體培養(yǎng)基按照液體培養(yǎng)方法進行菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明中，所提供的培養(yǎng)基特別適合菌種制備及菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。利用該培養(yǎng)方法，可快速進行暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。
文檔編號C12N1/14GK101381684SQ200810233469
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月22日
發(fā)明者何明霞, 靜 劉, 劉昌芬, 張春霞, 旸 曹, 王文兵, 紀開萍 申請人:云南省熱帶作物科學研究所