專(zhuān)利名稱(chēng):一種芳香族多烯抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域,更具體地涉及一種芳香族多烯抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù):
芳香族多烯抗生素是一類(lèi)抗生素,它主要通過(guò)與真核細(xì)胞膜的固醇相互作用,形 成通道從而引起小分子丟失而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 芳香族多烯大環(huán)內(nèi)酯抗真菌抗生素如兩性霉素在應(yīng)用中受到限制,其主要因素是 它的毒性太強(qiáng),尤其是腎毒性。 在芳香族多烯大環(huán)內(nèi)酯抗真菌抗生素如兩性霉素的藥理研究中發(fā)現(xiàn),化學(xué)合成的 C-16位為甲基側(cè)鏈的兩性霉素衍生物比兩性霉素(其C-16位為羧基側(cè)鏈)的毒性大大降低。
梁蓉芳等人在研究農(nóng)抗5192產(chǎn)生菌原生質(zhì)體融合育種的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一種新 的能夠產(chǎn)生抗生素的鏈霉菌菌株,即鏈霉菌FR-008。經(jīng)過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析表明,該鏈霉菌菌 株的次級(jí)代謝產(chǎn)物FR-008,與殺念菌素(Candicidin)的化學(xué)結(jié)構(gòu)是相同的(梁蓉芳,周 啟.農(nóng)抗5102產(chǎn)生菌原生質(zhì)體融合育種的研究。生物工程學(xué)報(bào),1987, 3, 130-136 ;申請(qǐng)?zhí)?為CN200310108746. 6的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物")。
與兩性霉素相比,代謝產(chǎn)物FR-008或殺念菌素除多了芳香環(huán)側(cè)鏈外,38元大環(huán)內(nèi) 酯及側(cè)鏈以及糖基都很相似,因此,F(xiàn)R-008或殺念菌素環(huán)外羧基脫掉以后,其衍生聚酮抗生 素的毒性亦大大降低。 上海交通大學(xué)鄧子新院士等人采用組合生物合成方法,合成了一系列抗生素 FR-008或殺念菌素基因工程衍生化合物。其中包括糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscMI中斷突變菌株 CS101、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102和細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP 基因中斷突變株CS103分別發(fā)酵培養(yǎng)得到的基因工程衍生物CS101、CS102和CS103。這些 化合物有較強(qiáng)的抗真菌活性,而且其中有些化合物毒性較FR-008或殺念菌素大大降低,具 有較高的臨床開(kāi)發(fā)前景。參見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310108746.6的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"七烯大環(huán)內(nèi)酯 聚酮抗生素FR-008復(fù)合物"、申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310108745. 1的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫糖和脫氨糖 FR-008衍生聚酮抗生素"和申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710037060. 0的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫羧FR-008衍 生聚酮抗生素及其應(yīng)用"。這些化合物可用來(lái)防止前列腺腫大和殺滅蚊子幼蟲(chóng)以及用來(lái)防 止陰道滴蟲(chóng)感染和念珠菌陰道炎(又稱(chēng)霉菌性陰道炎)。這些七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素還 可抗細(xì)菌。 然而,通過(guò)基因工程來(lái)生產(chǎn)這些芳香族多烯抗生素的產(chǎn)量很低,通常僅10mg/L發(fā)
酵液左右,因而制約了這些芳香族多烯抗生素的臨床試驗(yàn)和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。 綜上所述,本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種高效地、通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效地、通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的方法。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的方法,所述方法 包括 (1)將生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,并在pH7. 6-8. 5下進(jìn) 行發(fā)酵培養(yǎng)12-60小時(shí),從而使所述工程菌發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)氨基苯甲酸; (2)調(diào)節(jié)pH,并在p朋.4-7. 4下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)所述的工程菌,從而使所述工程菌將
對(duì)氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為芳香族多烯抗生素;禾口 (3)從發(fā)酵液中分離出所述的芳香族多烯抗生素。 在另一優(yōu)選例中,在所述步驟(1)中pH維持在7. 8-8. 2 ;和/或 在所述步驟(2)中,pH維持在6. 5-7. 2 。 在另一優(yōu)選例中,在步驟(1)中,并在pH7.6-8.5下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18-48小時(shí),更 佳地培養(yǎng)20-36小時(shí)。 在另一優(yōu)選例中,在步驟(2)中還包括向發(fā)酵體系中補(bǔ)加對(duì)氨基苯甲酸。
在另一優(yōu)選例中,所述生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的工程菌選自下組鏈霉菌 FR-008、糖基轉(zhuǎn)移酶基因f scMI中斷突變菌株CS101 、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因f scMII中斷突變菌株 CS102、或細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103。 在另一優(yōu)選例中,所述芳香族多烯抗生素包括芳香族多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素;更佳 地所述的芳香族多烯抗生素包括七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素。 在另一優(yōu)選例中,所述的芳香族多烯抗生素選自下組抗生素FR-008、殺念菌素、
糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101培養(yǎng)得到的脫糖基化合物CS101、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基
因fscMII中斷突變菌株CS102培養(yǎng)得到的脫氨糖化合物CS102、或細(xì)胞色素P450單氧化酶
基因fscP中斷突變株CS103培養(yǎng)得到的FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103。 在另一優(yōu)選例中,在步驟(1)中,還包括測(cè)定發(fā)酵液中所述芳香族多烯抗生素的
濃度,從而判斷所述工程菌是否開(kāi)始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素。 在另一優(yōu)選例中,對(duì)氨基苯甲酸的總共添加量為0. 002-0. 2g/L發(fā)酵液,更佳地為 0.01-0. lg/L。 在另一優(yōu)選例中,步驟(1)和(2)的發(fā)酵總時(shí)間《160小時(shí),更佳地《120小時(shí)。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
圖1顯示了在不控制pH值的情況下,CS103菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。 圖2顯示了將pH值控制在6. 9時(shí),CS103菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。 圖3顯示了分階段控制pH值時(shí),CS103菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。 圖4顯示了分階段控制pH值,并在發(fā)酵初期添加合成前體抗生素情況下,CS103菌
株的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。 圖5顯示了常規(guī)的分離純化芳香族多烯抗生素的方法。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究,意外地發(fā)現(xiàn)了一種有效提高芳香族多烯抗生素或其衍生物產(chǎn)量的發(fā)酵方法,即通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程的不同階段中控制發(fā)酵液不同pH的方法, 使得工程菌的生長(zhǎng)、代謝和生產(chǎn)處于理想的狀態(tài),從而大大提高了芳香族多烯抗生素或其 衍生物的發(fā)酵產(chǎn)量。 具體而言,在工程菌的生長(zhǎng)初始階段,在pH7. 6-8. 5的培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)工程菌, 從而促進(jìn)抗生素芳香側(cè)鏈前體——對(duì)氨基苯甲酸的合成;當(dāng)工程菌開(kāi)始或即將開(kāi)始合成芳 香族多烯抗生素時(shí),迅速將PH調(diào)至6. 4-7. 4并在pH下繼續(xù)發(fā)酵,將對(duì)氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為芳 香族多烯抗生素,從而極其有效地提高了芳香族多烯抗生素的產(chǎn)量,并減少了副產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中,還包括步驟在芳香族多烯抗生素合成階段補(bǔ)加前體
物質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸。
工程菌 如本發(fā)明所用,"發(fā)酵"即指培養(yǎng)所述攜帶表達(dá)載體的重組菌株,使其生產(chǎn)芳香族 多烯抗生素及其衍生物。更特別的,"發(fā)酵"為一種較大規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程,如發(fā)酵規(guī)模為 2-10000升,更佳地發(fā)酵規(guī)模為5-5000升,如發(fā)酵規(guī)??梢允?0升、100升、1000升或更高。
可用于本發(fā)明的工程菌沒(méi)有特別限制,可以是本領(lǐng)域用于生產(chǎn)芳香族多烯抗生素 的工程菌。這些工程菌可以是篩選獲得的,也可以是經(jīng)過(guò)基因工程改造的。通常,這些工程 菌在合成芳香族多烯抗生素中需要前體物質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸或類(lèi)似物質(zhì)。
—類(lèi)優(yōu)選的工程菌是可發(fā)酵生產(chǎn)芳香族多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素(更佳地七烯大環(huán) 內(nèi)酯聚酮抗生素)的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)鏈霉菌FR-008(申請(qǐng)?zhí)?為CN200310108746. 6的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物")、糖基 轉(zhuǎn)移酶基因fscMI中斷突變菌株CSIOI(申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310108745. 1的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫 糖和脫氨糖FR-008衍生聚酮抗生素")、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因fscMI1中斷突變菌株CS102(申請(qǐng) 號(hào)為CN200310108745. 1的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫糖和脫氨糖FR-008衍生聚酮抗生素")、或細(xì) 胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103 (見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710037060. 0的中國(guó) 專(zhuān)利申請(qǐng)"脫羧FR-008衍生聚酮抗生素及其應(yīng)用")或其衍生菌株。 適用于本發(fā)明的工程菌通常為鏈霉菌,但也可以是其他菌株,例如大腸桿菌、放線(xiàn) 菌、真菌等。 芳香族多烯抗生素 可用本發(fā)明方法生產(chǎn)的芳香族多烯抗生素沒(méi)有特別限制,可以是任何在合成過(guò)程 中需要前體物質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸或類(lèi)似物質(zhì)作為芳香側(cè)鏈的芳香族多烯抗生素。優(yōu)選的芳 香族多烯抗生素是芳香族多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素,更佳地是七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素(參見(jiàn) CN200310108746. 6、 CN200310108745. 1和CN200710037060. 0)。
代表性的芳香族多烯抗生素包括(但并不限于)
1)抗生素FR-008或殺念菌素及其衍生物; 2)糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscM I中斷突變菌株CSIOI培養(yǎng)得到的脫糖基的化合物
CS101 ; 3)酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102培養(yǎng)得到的脫氨糖的化合物
CS102 ; 4)細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103培養(yǎng)得到的毒性降低 FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103 ;
5)抗生素FR-008或殺念菌素;禾口 6)其他的通過(guò)組合生物合成技術(shù)得到的FR-008或殺念菌素的基因工程衍生物。
培養(yǎng)基和發(fā)酵條件 適用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基、以及培養(yǎng)條件(除了 pH值和補(bǔ)加對(duì)氨基苯甲酸之 外)沒(méi)有特別限制,可以是本領(lǐng)域常規(guī)用于所述工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。當(dāng)然,根據(jù)不 同的發(fā)酵規(guī)模和需要,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或試驗(yàn)對(duì)通氣量、攪拌速度等條件進(jìn) 行調(diào)整。 與現(xiàn)有的發(fā)酵條件相比,本發(fā)明的主要區(qū)別在于分階段控制pH,從而促進(jìn)抗生索 芳香側(cè)鏈前體和抗生素本身的合成。 為了確定調(diào)控pH的時(shí)間,可以在發(fā)酵過(guò)程中,定期測(cè)定發(fā)酵液中所述芳香族多烯 抗生素的濃度,從而判斷所述工程菌是否開(kāi)始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素。 一旦工程菌開(kāi)始或 即將開(kāi)始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素,則可調(diào)節(jié)PH至6. 4-7. 4。 當(dāng)然,在發(fā)酵條件和接種量等因素確定的情況下,一旦通過(guò)測(cè)定確定了工程菌開(kāi) 始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的時(shí)間,則可以不必測(cè)定發(fā)酵液中所述芳香族多烯抗生素的濃度。 在本發(fā)明中,步驟(1)所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵初始階段通常為12-60小時(shí),較佳地為18-48 小時(shí),更佳地為20-36小時(shí)。 在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后,可從常規(guī)方法從發(fā)酵液中分離或純化所述的芳香族多烯抗生 素及其衍生物。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化芳香族多烯抗生素及其衍生物可采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的各種分離純化技術(shù),其中包括(但并不限于)溶媒萃取加沉淀法。 一種常規(guī)的 初步分離純化過(guò)程如圖5所示。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)根據(jù)芳香類(lèi)多烯聚酮抗生素結(jié)構(gòu)和合成的特點(diǎn),通過(guò)分階段控制pH調(diào)節(jié)抗生 素芳香側(cè)鏈前體和抗生素本身的合成,在合成初期提高pH來(lái)促進(jìn)抗生素芳香側(cè)鏈前體—— 對(duì)氨基苯甲酸的合成,進(jìn)而提高抗生素發(fā)酵水平。 與以前的發(fā)酵工藝相比,本發(fā)明方法可使芳香族多烯抗生素產(chǎn)量大幅提高約 200% ,單位菌體抗生素產(chǎn)量明顯提高,單位體積發(fā)酵液的產(chǎn)率提高約280% ,
(2)減少了副產(chǎn)物,利于下游的分離純化工作。
(3)發(fā)酵過(guò)程易于控制,便于大規(guī)模生產(chǎn),因而具有極好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
(4)發(fā)酵周期明顯縮短,生產(chǎn)成本大幅降低。 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本
發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照
常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York : Co Id Spring Harbor
Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。 除非另有定義或說(shuō)明,本文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人
員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明
方法中。 實(shí)施例1 為了確定調(diào)控pH的時(shí)間,可以在發(fā)酵過(guò)程中,定期(如每5分鐘或每10分鐘)或?qū)崟r(shí)測(cè)定發(fā)酵液中所述芳香族多烯抗生素的濃度,從而判斷所述工程菌是否開(kāi)始生產(chǎn) 芳香族多烯抗生素。 一旦工程菌開(kāi)始或即將開(kāi)始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素,則可調(diào)節(jié)PH至 6. 4-7. 4。 以FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103為例,發(fā)酵初期通過(guò)以下方法檢測(cè)高效液 相色譜儀(Agenlent 1100),色譜柱為SB-C8 (4. 6mm*250mm),流動(dòng)相為20mM、 pH4. 6醋酸銨 緩沖液_乙腈(60 : 40),流速為lmL/min,柱溫為25°C ,檢測(cè)波長(zhǎng)380nm,上述色譜條件下 得到回歸方程:y = 5. 5015x+87. 599 (R2 = 0. 9987)。當(dāng)CS103發(fā)酵水平達(dá)到10-30mg/L,最 佳20mg/L的時(shí)候,即發(fā)酵24小時(shí),可調(diào)節(jié)pH至6. 4-7. 4。 [ooee] 實(shí)施例l(對(duì)比例) FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵 將300 ill細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103(申請(qǐng)?zhí)枮?CN200710037060.0的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫羧FR-008衍生聚酮抗生素及其應(yīng)用")孢子懸液接 種至含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,接種后置于28。C下,200rpm/min搖床上培養(yǎng) 30h左右,按接種量10%接到3. 7L發(fā)酵罐;450rpm、200L/h通氣量,28。C培養(yǎng)。(發(fā)酵方法 同申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710037060. 0的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫羧FR-008衍生聚酮抗生素及其應(yīng)用")
整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不控制pH值,培養(yǎng)基初始p朋.9,在0-12h,pH逐漸升高到7. 5。結(jié)果 如圖1所示,菌體為了適應(yīng)發(fā)酵初期抗生素合成前體PABA的合成而自身調(diào)節(jié)pH升高;12h 以后pH逐漸下降,此時(shí)抗生素開(kāi)始合成,直到96h略微有些回升,菌體開(kāi)始自溶,菌體最高 量達(dá)到6. 5g/L ;此時(shí),放瓶檢測(cè)FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵水平達(dá)到最高值 46 ii g/mL左右,不再繼續(xù)合成。
實(shí)施例2 FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵 同實(shí)施例l,不同點(diǎn)在于接種后用鹽酸和氫氧化鈉維持p朋.9,培養(yǎng)120至發(fā)酵結(jié)束。 結(jié)果如圖2所示。當(dāng)發(fā)酵過(guò)程維持p朋.9時(shí),由于發(fā)酵過(guò)程pH比較穩(wěn)定,菌體生 長(zhǎng)能力也得到提高,最終細(xì)胞干重達(dá)到9. 4g/L?;|(zhì)消耗速率加快,葡萄糖在48-72h耗到 10g/L,120h幾乎耗盡,而實(shí)施例1中不控制pH的分批發(fā)酵,直到120h才耗到10g/L左右。 氨基氮的消耗也明顯加快??梢?jiàn)菌體代謝速率加快,這從溶氧和RQ值也可以明顯反應(yīng)出 來(lái)。溶氧最低值由原來(lái)的50X降至30X左右,RQ最大值由原來(lái)的0. 12提高到0. 18。放瓶 檢測(cè)FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵水平在120h達(dá)到最高值,為88. 2 y g/mL左 右,較實(shí)施例1提高了90%。
實(shí)施例3 FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵 同實(shí)施例l,不同點(diǎn)在于接種后用鹽酸和氫氧化鈉維持pH8. 0。 24h后,迅速將pH 調(diào)至6.9,并維持至發(fā)酵結(jié)束。 結(jié)果如圖3所示。采取分階段控制pH策略以后,培養(yǎng)120h,放瓶檢測(cè)FR-008脫羧 衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵水平進(jìn)一步提高到111 P g/mL,較實(shí)施例1中不控制pH分批 發(fā)酵提高141%,較實(shí)施例2中控制p朋.9分批發(fā)酵也提高了 26%。 此外,最高菌體干重DCWMax為9. 5g/L,與控制p朋.9分批發(fā)酵沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明抗生素產(chǎn)量的提高不是因?yàn)榧?xì)胞量增加影響的。
實(shí)施例4 FR-008脫羧衍生聚酮抗生素CS103的發(fā)酵 同實(shí)施例1中,不同點(diǎn)在于(a)接種后用鹽酸和氫氧化鈉維持pH8.0。 24h后,迅 速將pH調(diào)至6.9,并維持至發(fā)酵結(jié)束;(b)將O. 02g/L的對(duì)氨基苯甲酸分別在0h,12h,24h 和48h四次添加到發(fā)酵罐。 結(jié)果如圖4所示。添加前體以后,CS103產(chǎn)量進(jìn)一步提高到近140ii g/mL,較實(shí)施 例3提高26%。 此外,最高菌體干重DCWM^為9.4g/L,與前面幾批分批發(fā)酵沒(méi)有明顯差異。這說(shuō) 明,實(shí)施例3中"分階段控制pH策略"雖然通過(guò)提高對(duì)氨基苯甲酸合成酶的活性,促進(jìn)了分 枝酸轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯甲酸,使前體量增加,但并沒(méi)有達(dá)到最佳前體量;而由于菌體生長(zhǎng)環(huán)境 的限制,無(wú)法進(jìn)一步提高發(fā)酵初期的pH ;因此在此基礎(chǔ)上通過(guò)一次或多次(優(yōu)選分批多次) 添加對(duì)氨基苯甲酸來(lái)可進(jìn)一步促進(jìn)CS103的積累,達(dá)到了較好的效果。而且添加外源前體 后,CS103的生物合成開(kāi)始的時(shí)間提前到6h。由于,合成時(shí)間提前,菌體代謝更加旺盛,溶氧 進(jìn)一步降低,而RQ最高值達(dá)到0. 56。此時(shí),葡萄糖和氨基氮的消耗加快,特別是葡萄糖在 96h耗盡。 表l.四組實(shí)施例對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)DCW (g/L)P最大 (u g/mL)Yp/x ("g/g)葡萄糖 消耗量(g)培育 時(shí)間(h)(u g/mL/ h)
實(shí)施例l6.4945.877.079.72960.38
實(shí)施例29.4388.249.3619.941200.74
實(shí)施例39.52110.7411.6319.991200.92
實(shí)施例49.4139.9814.8919.97961.46 實(shí)施例5 FR-008脫糖衍生聚酮抗生素CS101的發(fā)酵 將300 iil糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscM I中斷突變菌株CS101 (申請(qǐng)?zhí)枮?CN200310108745. 1的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫糖和脫氨糖FR-008衍生聚酮抗生素")孢子懸液接 種至含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,接種后置于28。C下,200rpm/min搖床上培養(yǎng) 30h左右,按接種量10%接到3. 7L發(fā)酵罐;450rpm、200L/h通氣量,28。C培養(yǎng)。(發(fā)酵方法 同申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710037060. 0的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"脫羧FR-008衍生聚酮抗生素及其應(yīng)用")
整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不控制pH值,培養(yǎng)基初始p朋.7,培養(yǎng)至96h放瓶檢測(cè)FR-008脫糖 衍生聚酮抗生素CS101的發(fā)酵水平達(dá)到最高值79. 3 ii g/mL左右,不再繼續(xù)合成。
實(shí)施例6
8
FR-008脫糖衍生聚酮抗生素CS101的發(fā)酵 同實(shí)施例5中,不同點(diǎn)在于(a)接種后用鹽酸和氫氧化鈉維持pH7. 7。 24h后,迅 速將pH調(diào)至6.6,并維持至發(fā)酵結(jié)束;(b)將O. 02g/L的對(duì)氨基苯甲酸分別在0h,12h,24h 和48h四次添加到發(fā)酵罐。培養(yǎng)至96h, CS101產(chǎn)量進(jìn)一步提高到近236. 8 y g/mL。
實(shí)施例7
抗生素FR-008的發(fā)酵 將300 ii 1鏈霉菌FR-008 (申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310108746. 6的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)"七烯大 環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物")孢子懸液接種至含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶 中,接種后置于28°CT, 200rpm/min搖床上培養(yǎng)30h左右,按接種量10%接到3. 7L發(fā)酵罐; 450rpm、200L/h通氣量,28。C培養(yǎng)。(發(fā)酵方法同申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710037060. 0的中國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)"脫羧FR-008衍生聚酮抗生素及其應(yīng)用") 整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不控制pH值,培養(yǎng)基初始p朋.9,培養(yǎng)至96h放瓶檢測(cè)抗生素
FR-008的發(fā)酵水平達(dá)到最高值150. 9 g/mL左右,不再繼續(xù)合成。 實(shí)施例8 抗生素FR-008的發(fā)酵 同實(shí)施例7中,不同點(diǎn)在于(a)接種后用鹽酸和氫氧化鈉維持pH8.4。 24h后,迅 速將pH調(diào)至7. 2,并維持至發(fā)酵結(jié)束;(b)將0. 02g/L的對(duì)氨基苯甲酸分別在Oh, 12h, 24h 和48h四次添加到發(fā)酵罐。培養(yǎng)至96h,抗生素FR-008產(chǎn)量進(jìn)一步提高到近421. 3 y g/mL。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
9
權(quán)利要求
一種發(fā)酵生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的方法,其特征在于,所述方法包括(1)將生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,并在pH7.6-8.5下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)12-60小時(shí),從而使所述工程菌發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)氨基苯甲酸;和(2)調(diào)節(jié)pH,并在pH6.4-7.4下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)所述的工程菌,從而使所述工程菌將對(duì)氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為芳香族多烯抗生素;(3)從發(fā)酵液中分離出所述的芳香族多烯抗生素。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步驟(1)中pH維持在7. 8-8. 2 ;和/或在所述步驟(2)中,pH維持在6. 5-7. 2。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,并在pH7.6-8.5下進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)18-48小時(shí),更佳地培養(yǎng)20-36小時(shí)。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中還包括向發(fā)酵體系中補(bǔ)加對(duì)氨 基苯甲酸。
5. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述生產(chǎn)芳香族多烯抗生素的工程菌 選自下組鏈霉菌FR-008、糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscM I中斷突變菌株CS101、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因 fscMII中斷突變菌株CS102、或細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103。
6. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述芳香族多烯抗生素包括芳香族多烯 大環(huán)內(nèi)酯抗生素;更佳地所述的芳香族多烯抗生素包括七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素。
7. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述的芳香族多烯抗生素選自下組抗 生素FR-008、殺念菌素、糖基轉(zhuǎn)移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101培養(yǎng)得到的脫糖基化合 物CS101、酮糖轉(zhuǎn)氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102培養(yǎng)得到的脫氨糖化合物CS102、或 細(xì)胞色素P450單氧化酶基因fscP中斷突變株CS103培養(yǎng)得到的FR-008脫羧衍生聚酮抗 生素CS103。
8. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,還包括測(cè)定發(fā)酵液中所 述芳香族多烯抗生素的濃度,從而判斷所述工程菌是否開(kāi)始生產(chǎn)芳香族多烯抗生素。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,對(duì)氨基苯甲酸的總共添加量為0. 002-0. 2g/ L發(fā)酵液,更佳地為0. 01-0. lg/L。
10. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于,步驟(1)和(2)的發(fā)酵總時(shí)間《160 小時(shí),更佳地《120小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種芳香族多烯抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。所述的方法包括在工程菌的生長(zhǎng)初始階段,在中性至弱堿性條件下,培養(yǎng)工程菌,從而促進(jìn)抗生素芳香側(cè)鏈前體一對(duì)氨基苯甲酸的合成;然后在弱酸性至中性條件下繼續(xù)發(fā)酵,將對(duì)氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為芳香族多烯抗生素。本發(fā)明方法可有效地提高了芳香族多烯抗生素的產(chǎn)量,并減少了副產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101748178SQ20081020428
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者毛相朝, 沈亞領(lǐng), 鄧子新, 陳實(shí), 魏東芝 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);上海交通大學(xué)