專(zhuān)利名稱(chēng)：：Qsox及其突變體蛋白及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及QSOX及其突變體蛋白及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：二硫鍵形成是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它決定了蛋白質(zhì)是否能正確折疊并最終形成有活性的空間構(gòu)象。隨著人們對(duì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，巰基氧化酶(QSOX，ERV/ALR家族)等一系列與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)酶研究的深入，人們對(duì)二硫鍵有了新的認(rèn)識(shí)。目前很多的研究結(jié)果都表明蛋白質(zhì)中二硫鍵是可調(diào)控的，它的形成與還原可以改變蛋白質(zhì)和酶的生物活性，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等功能產(chǎn)生重大影響。QSOX家族是最新發(fā)現(xiàn)的巰基氧化酶家族。它利用一個(gè)硫氧化還原蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與酵母ERVlp蛋白同源的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)氧化巰基形成二硫鍵，同時(shí)氧分子被還原成過(guò)氧化氫。研究表明，.QSOX蛋白的兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域共同完成了整個(gè)催化二硫鍵形成的過(guò)程。QSOX蛋白存在于所有的全基因組已知的多細(xì)胞生物，但在酵母中卻未被發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體和細(xì)胞外均發(fā)現(xiàn)了QSOX。很多研究者都認(rèn)為在大多數(shù)的多細(xì)胞生物中，QSOX在各種蛋白質(zhì)的氧化折疊中都扮演了重要角色。QSOX的基因和蛋白進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),QSOX的結(jié)構(gòu)如下N端信號(hào)肽之后是一個(gè)硫氧還蛋白區(qū)域，其中有一個(gè)在QSOX的催化中顯得極其重要的CxxC超二級(jí)結(jié)構(gòu)，之后是一個(gè)約270氨基酸殘基的延伸，然后是一個(gè)與釀酒酵母ERVl同源的區(qū)域。最后，在QSOX的C端還有一個(gè)QHZ10區(qū)域，它可以選擇性剪接形成人QSOXl的兩種形式的mRNA。另夕卜，雖然QSOX酶不含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)，但卻可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被找到。人的Q6蛋白是QSOX家族中一個(gè)重要的成員，被發(fā)現(xiàn)能在靜止期的人成纖維細(xì)胞中高效表達(dá)，因此被賦予QuiescinQ6的名字(此系列第6個(gè)克隆)。目前關(guān)于Q6在細(xì)胞中的功能的文章還較少，但分析其在細(xì)胞的二硫鍵形成及氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌中起作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供QSOX及其突變體蛋白，以研究其功能；本發(fā)明的另一目的是提供上述QSOX蛋白的制備方法；本發(fā)明的再一目的是提供上述QSOX蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的通過(guò)RT-PCR方法獲得QSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，并進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后將野生型和突變體基因分別構(gòu)建入原核表達(dá)載體的pET系列、pGEX系列和pTYB系列載體和酵母表達(dá)的系列載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行純化和功能研究。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供QSOX及其突變體蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQEDNO:2中所示。SEQIDNO:2同時(shí)請(qǐng)見(jiàn)圖5所示。編碼上述QSOX及其突變體蛋白的基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。SEQIDNO:l同時(shí)請(qǐng)見(jiàn)圖6所示。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供制備QSOX及其突變體蛋白的方法，包括如下步驟構(gòu)建QSOX基因；利用突變引物對(duì)經(jīng)重組法對(duì)QSOX基因的不同位點(diǎn)的Cys突變?yōu)锳la;將QSOX基因插入表達(dá)載體；將帶有QSOX基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞;培養(yǎng)該表達(dá)細(xì)胞；誘導(dǎo)表達(dá)；收集并純化表達(dá)產(chǎn)物。構(gòu)建QSOX基因的方法是利用克隆引物經(jīng)RT-PCR從成纖維細(xì)胞中克隆出QSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，所述克隆引物序列為P1:5，-GTA加卿雄agaATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCG—3，P2:5，-CAGgcggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3'。利用突變引物對(duì)經(jīng)重組法對(duì)QSOX基因的不同位點(diǎn)的Cys突變?yōu)锳la;將QSOX基因插入表達(dá)載體的方法中所用到的突變引物的序列為Pm70-l-5，GGAGTTCTTCGCCTCCTGGGCCGGCCACGCCATCGCCTTCGCCC-3Pm70-2-5GGGCGAAGGCGATGGCGTGGCCGGCCCAGGAGGCGAAGAACTCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的70位和/或73位的Cys突變?yōu)锳la;Pm449-l-5，GCACTACTTCTTCGGCGCCCGAGACGCCGCTAGCCACTTCG-3Pm449-2-5CGAAGTGGCTAGCGGCGTCTCGGGCGCCGAAGAAGTAGTGC-3該對(duì)突變引物將蛋白的449位和/或452位的Cys突變?yōu)锳la;Pm509-l陽(yáng)5，GGCCACCCCGTGAACTTGCTTCTGCCGCCCACAATGAACGC-3Pm509-2-5，GCGTTCATTGTGGGCGGCAGAAGCAAGTTCACGGGGTGGCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的509位和/或512位的Cys突變?yōu)锳la。將本發(fā)明中QSOX蛋白基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，不限于特定的表達(dá)載體，可釆用真核表達(dá)載體或原核表達(dá)載體。將本發(fā)明中重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，表達(dá)載體為pET28a，宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。QSOX重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白，發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，.含有目的蛋白的裂解上清夜，利用NT-his親和柱進(jìn)行純化，低濃度咪唑洗雜后，高濃度咪唑洗脫即可得到95。/。純度的QSOX及其突變體蛋白。本發(fā)明的再一技術(shù)方案是提供QSOX及其突變體蛋白在作為藥物靶標(biāo)和促進(jìn)包涵體復(fù)性以及外源蛋白可溶性、分泌性表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建中的應(yīng)用。本發(fā)明的表達(dá)載體是含有QSOX及其突變體基因的原核表達(dá)載體pET系列、pGEX系列和pTYB系列載體和含有QSOX及其突變體基因的真核表達(dá)載體pPIC系列、pYES2.1系列載體。詳細(xì)如下1.pPICZaA々66042.pPICZA-Q66043.pTYB12-Q66044.pTYB2-Q66045.pET32a-Q66046.pET28a-Q66047.pET28a-Q6604-70m8.pET28a誦Q6604畫(huà)449ml-9表達(dá)載體的QSOX基因均為Q6及其突變體的全長(zhǎng)基因，1815bp，包含604個(gè)氨基酸。10.pTYB12-Q657511.pGEX-4T-1-Q657512.pET32a-Q657513.pET28a畫(huà)Q657514.pET28a-Q670m57515.pET28a隱Q6449m57516.pET28a-Q6509m57510-16表達(dá)載體的QSOX基因均為去掉信號(hào)肽的Q6及其突變體基因，1728bp，包含575個(gè)氨基酸。17.PYES2.1-topo-Q6604arg18.pYES2.1-topo-Q6604ala19.pYES2.1-topoQ6畫(huà)57520.pYES2.1-topoQ670m2LpYES2.1-topoQ6449m22.pYES2.1-topoQ6509m本發(fā)明是將雙酶切后的QSOX基因和表達(dá)載體在T4連接酶作用下發(fā)生連接作用，得到重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后獲得表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明的特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明提出了QSOX及其不同突變體在原核真核系統(tǒng)中高效表達(dá)的方法，該方法可以獲得可溶性、有活性的QSOX蛋白。2.本發(fā)明利用簡(jiǎn)單的純化方法即可獲得高純度的QSOX蛋白。3.本發(fā)明研究了QSOX的不同突變體具有不同的活性和功能。4.本發(fā)明在釀酒酵母和畢赤酵母中能有效表達(dá)QSOX蛋白，并分泌到培養(yǎng)基中，為下游的純化分析奠定有利基礎(chǔ)。圖1是QSOX蛋白的cDNA序列克隆與重組表達(dá)載體pET28a-Q6604的構(gòu)建策略示意圖2A是PCR擴(kuò)增結(jié)果與酶切鑒定結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，引物P1和P2獲得的PCR產(chǎn)物；圖2B是PCR擴(kuò)增結(jié)果與酶切鑒定結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，重組載體pET28a-Q6604的Ndel和Notl雙酶切鑒定結(jié)果；圖3是QSOX蛋白表達(dá)的SDS-PAGE示意圖4是QSOX蛋白經(jīng)NT-his親和純化的色譜圖5是QSOX及其突變體蛋白的氨基酸序列圖6是QSOX及其突變體蛋白的核苷酸序列圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。本發(fā)明通過(guò)RT-PCR方法獲得QSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼區(qū)、cDNA序列，并進(jìn)-行定點(diǎn)突變，然后將野生型和突變體基因分別構(gòu)建入原核表達(dá)載體的pET系列、pGEX系列和pTYB系列載體和酵母表達(dá)的系列載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行純化和功能研究。本專(zhuān)利涉及到QSOX蛋白的生產(chǎn)方法，純化過(guò)程及其活性檢測(cè)與促進(jìn)二硫鍵形成的功能。本發(fā)明包含以下步驟l.引物設(shè)計(jì)本發(fā)明設(shè)計(jì)的克隆引物Pl5，國(guó)GTA"caaaagaATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCG-—3，P2:5，-CAGgCggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3，'以上兩個(gè)引物用于基因的克隆，為了把目的基因構(gòu)建入不同的表達(dá)載體，根據(jù)所用表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的差異，在DNA片段的上游和下游分別引入不同的限制酶位點(diǎn)。突變引物Pm70-l-5，GGAGTTCTTCGCCTCCTGGGCCGGCCACGCCATCGCCTTCGCCC-38Pm70-2-5GGGCGAAGGCGATGGCGTGGCCGGCCCAGGAGGCGAAGAACTCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的70位和/或73位的Cys突變?yōu)锳la。Pm449-l-5，GCACTACTTCTTCGGCGCCCGAGACGCCGCTAGCCACTTCG-3Pm449-2-5CGAAGTGGCTAGCGGCGTCTCGGGCGCCGAAGAAGTAGTGC-3該對(duì)突變引物將蛋白的449位和/或452位的Cys突變?yōu)锳la。Pm509-l-5，GGCCACCCCGTGAACTTGCTTCTGCCGCCCACAATGAACGC-3Pm509-2陽(yáng)5，GCGTTCATTGTGGGCGGCAGAAGCAAGTTCACGGGGTGGCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的509位和/或512位的Cys突變?yōu)锳la。剪切信號(hào)肽引物Primer30N—5，@catatgGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTCGCCTT-3，剪切信號(hào)肽引物可以剪切掉QSOX及其突變體蛋白N-端的29個(gè)氨基酸，得到無(wú)信號(hào)肽QSOX及其突變體蛋白。2.基因克隆和定點(diǎn)突變利用克隆引物.Pl和P2經(jīng)RT-PCR從成纖維細(xì)胞中克隆出QSOX的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，利用突變引物對(duì)經(jīng)重組法對(duì)QSOX蛋白的不同位點(diǎn)的fys突變?yōu)锳la，并將QSOX突變體基因裝入pGEM—T載體,測(cè)序鑒定。,-3.原核和真核表達(dá)載體構(gòu)建測(cè)序正確的QSOX及其突變體基因經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，亞克隆進(jìn)表達(dá)載體原核和真核表達(dá)載體中如pET系列、pGEX系列、pTYB系列、pPIC系列和pYES系列載體中。構(gòu)建表達(dá)載體，并進(jìn)行測(cè)序和酶切鑒定。4.表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)，利用CaCl2法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，和42°C/%秒熱沖^^方法進(jìn)行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化，得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在LT液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為0:3iflM'的IPTG18-C誘導(dǎo)24小時(shí)進(jìn)行小量表達(dá)，并在誘導(dǎo)時(shí)加入QSOX酶結(jié)合因子FAD10nM，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，6000rmp離心棄上清取沉淀。根據(jù)《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)，利用山梨醇法制備酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)，利用電轉(zhuǎn)儀將構(gòu)建成功的并已經(jīng)Sair線(xiàn)形化酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入酵母株內(nèi)，利用不同濃度的Zeocin對(duì)酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高拷貝篩選。篩選成功的酵母轉(zhuǎn)9化子在3(TC利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)7'天。根據(jù)《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)，利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子利用半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，及分析鑒定。5.重組蛋白QSOX的純化和復(fù)性重組蛋白QSOX在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用NT-his親和柱進(jìn)行純化，低濃度咪唑洗雜后，高濃度咪唑洗脫即可得到95y。純度的QSOX及其突變體蛋白。其結(jié)果分別請(qǐng)見(jiàn)圖3及圖4所示。本
發(fā)明內(nèi)容通過(guò)以下的實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步闡述，具體如下實(shí)施例1pPICZaA-Q6604載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)從成纖維細(xì)胞中用Trizol試劑抽提總RNA。用提取的總RNA作模板，利用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，.利用引物Pl:f5'-GTActeg喂aaaagaATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCG—-3!:和P2:5，-CAGgcggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3，，經(jīng)'PCR擴(kuò)增，獲得QSOX基因編碼序列，將此QSOX基因片段裝入pGEM—T載體。然后經(jīng)XholI和NotI雙酶切，亞克隆到pPICZaA中，得到pPlCZaA-Q6604。測(cè)序結(jié)果與分析如圖2A及圖2B所示。正確構(gòu)建的pPICZaA-Q6604用SalI線(xiàn)性化后，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法電轉(zhuǎn)化酵母。得到的重組子酵母利用Zeocin抗性進(jìn)行拷貝數(shù)篩選，利用PCR進(jìn)行鑒定正確后以甲醇作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后離心分別收集菌體和培養(yǎng)上清。培養(yǎng)上清直接進(jìn)行活性測(cè)定和利用離子交換層析色譜進(jìn)行純化，收集的酵母菌體利用玻璃珠超聲法進(jìn)行裂解，裂解士清液進(jìn)行活性測(cè)定和離子交換色譜純化，鑒定QSOX蛋白的表達(dá)和分泌狀況。利用該方法能獲得有活性QSOX蛋白的有效分泌性表達(dá)，純化后蛋白的純度達(dá)98%。實(shí)施例2pET28a-Q6604-70m載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)請(qǐng)參見(jiàn)圖1所示，以裝載入pGEM—T載體上的QSOX基因?yàn)槟０謇靡颬m70-l隱5，GGAGTTCTTCGCCTCCTGGGCCGGCCACGCCATCGCCTTCGCCC-3和Pm70-2-5GGGCGAAGGCGATGGCGTGGCCGGCCCAGGAGGCGAAGAACTCC-3對(duì)QSOX蛋白的70和73位Cys突變?yōu)锳la，獲得的突變基因利用Ndel和NotI進(jìn)行雙酶切，然后定向克隆進(jìn)pET28a中。得到的重組載體鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌株在LB液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為0.3mM的IPTG18'C誘導(dǎo)24小時(shí)進(jìn)行小量表達(dá)，并在誘導(dǎo)時(shí)加入QSOX酶結(jié)合因子FAD10pM，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，6000rmp離心棄上清取沉淀。重組蛋白QSOX在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用NT-his親和柱進(jìn)行純化，低濃度咪唑洗雜后，高濃度咪唑洗脫即可得到95%純度的QSOX及其突變體蛋白。實(shí)施例3pTYB12-Q6575載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)以裝載入pGEM—T載體上的QSOX基因?yàn)槟０謇靡颬30N5，tatcatatgGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTCGCCTT-3，和P2:5，-CAGgcggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3'進(jìn)行.PCR擴(kuò)增*獲得擴(kuò)增產(chǎn)物即為去除.信號(hào)肽的QSQX基因編碼序列，稱(chēng)之為Q6575，將此QSOX基因片段用Ndel和NotI進(jìn)行雙酶切，然后定向克隆進(jìn)pTYB12中。得到的重組載體鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌株在LB液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為0.3mM的iIPTG18t:誘導(dǎo)24小時(shí)進(jìn)行小量表達(dá)，并在誘導(dǎo)時(shí)加入QSOX酶結(jié)合因子FAD10(jM，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，6000rmp離心棄上清取沉淀。重組蛋白QSOX在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用chitin親和柱進(jìn)行純化，掛在chitin親和柱上的目的蛋白用DTT進(jìn)行裂解，去除目的蛋白N-末端的CBD蛋白結(jié)構(gòu)域，然后洗脫下目的蛋白質(zhì)。此方法可得到98。/o純度的'QSOX及其突變體蛋白-。實(shí)施例4pGEX-4T-l-Q6575載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)以裝載入pGEM—T載體上的QSOX基因?yàn)槟０謇靡颬30B5，tatggatccGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTCGCCTT-3和P25，-CAGgcggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，li獲得擴(kuò)增產(chǎn)物即為去除信號(hào)肽的QSOX基因編碼序列，稱(chēng)之為Q6575，將此QSOX基因片段用BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，然后定向克隆進(jìn)PGEX-4T-1中。得到的重組載體鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌株在LB液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為03niM的IPTG18"C誘導(dǎo)24小時(shí)進(jìn)行小量表達(dá)，并在誘導(dǎo)時(shí)加入QSOX酶結(jié)合因子FAD10pM，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，6000rmp離心棄上清取沉淀。重組蛋白QSOX在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用GST親和柱進(jìn)行純化，即可得到95%純度的QSOX蛋白。實(shí)施例5pTYB2-Q6604載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)以裝載入pGEM—T載體上的QSOX基因?yàn)槟０謇靡颬IE:5,-CGCCATATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCG—3，和P2xmal:5，-GTTGTTCCCGGGAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物QSOX基因編碼序列，將此QSOX基因片段用Ndel'和Xmal進(jìn)行雙酶切，然后定向克隆進(jìn)pTYB2中。得到的重組載體鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌株在LB液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為0.3mM的IPTG18。C誘導(dǎo)24小時(shí)進(jìn)行小量表達(dá)，并在誘導(dǎo)時(shí)加入QSOX酶結(jié)合因子FAD10pM，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，6000rmp離心棄上清取沉淀。重組蛋白QSOX在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用chitin親和柱進(jìn)行純化，掛在chitin親和柱上的目的蛋白用.DTT進(jìn)行裂解，去除目的蛋白C-末端的CBD蛋白結(jié)構(gòu)域，然后洗脫下目的蛋白質(zhì)。此方法可得到98%純度的QSOX及其突變體蛋白。實(shí)施例6pYES2.1-TOPO-Q6載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá)以裝載入pGEM—T載體上的QSOX基因?yàn)槟０謇靡飌ly-arg:5——getATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCGG-—3和p2y:5，-AATAAGCTCAGGTCCCTCAGCCGGc—3，；ply陽(yáng)ala:5—-getATGGCGGAGGTGCAACAGCGGCTCCGG——3和p2y:5，-AATAAGCTCAGGTCCCTCAGCCGGc—國(guó)3，；p30y:5-—getATGGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTCGCCTT—墨3和p2y:5'-AATAAGCTCAGGTCCCTCAGCCGGc—3，；進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因，直接連入pYES2.1-topo載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得重組載體。獲得的重組載體再轉(zhuǎn)化入BY4741釀酒酵母中，獲得酵母重組菌株，然后對(duì)重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。常規(guī)的PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、電泳、質(zhì)粒抽提、抗性選擇、細(xì)菌培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)操作都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所列舉的，在本發(fā)明中不作詳細(xì)描述。應(yīng)該理解，在實(shí)施例或?qū)嶒?yàn)材料方法中所顯示的成分用量、反應(yīng)條件等數(shù)字或是本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所使用的數(shù)字均為大約數(shù)值。因此，除非文中特別注明，本說(shuō)明書(shū)的上述數(shù)字參數(shù)均為近似值，可根據(jù)所需要獲得的本發(fā)明結(jié)果而加以變化。并且，這些參數(shù)并非用來(lái)限定與本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍均等的原理，而是應(yīng)用正常的操作技術(shù)下所得到的較佳數(shù)據(jù)。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的意義相同。此外，'任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料及可以應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)驗(yàn)方法與材料僅作為示范之用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用為參考。此外應(yīng)該理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣屬于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)。13序列表SEQUENCELISTING〈110〉華東理工大學(xué)〈120〉QSOX及其突變體蛋白及制備方法和應(yīng)用〈130〉/〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1815〈212>DNA〈213>Homosapiens〈400>1atgaggaggtgc犯cagcggctccgggccgccgccgtcgctgctgctgctgctgctgtgg60ctgctcgcggttcccggcgctaacgcggcc.ccgcggtcggcgctctattcgccttccgac120ccgctgacgctgctgcaggcggac^cggtgcgcggcgcggtgctgggctcccgcagcgcc180tgggccgtggagttcttcgcctcctggtgcggccactgcatcgccttcgccccgacgtgg240aaggcgctggccgaagacgtcaaagcctggaggccggccctgtatctcgccgccctggac300tgtgctgaggagaccaacagtgcagtctgcagagacttcaacatccctggcttcccgactgtgaggttcttcaaggcctttaccaagaacggctcaggagcagtatttccagtggctggt420gctgacgtgcagacgctgcgggageiggctcattgacgccctggagtcccatcatgetcacg480tggcccccagcctgtcccccactggagcctgccaagctggaggagattgatggattcttt540gcgagaaataacgaagagtacctggctctgatctttgaaaagggaggctcctacctggct600agagaggtggctctggacctgtcccagcacaaaggcgtggcggtgcgcagggtgctgaac660acagaggccaatgtggtgagaaagtttggtgtcaccgacttcccctcttgctacctgctg720ttccggaatggctctgtctcccgagtccccgtgctcatggaatccaggtccttctatacc780gcttacctgcagagactctctgggctcaccagggaggctgcccagaccacagttgcacca84014accactgctaacaagatagctcccactgtttggaaattggcagatcgctccaagatctac900atggctgacctggaatctgcactgcactacatcctgcggatagaagtgggcaggttcccg恥0gtcctggaagggcagcgcctggtggccctgaaaaagtttgtggcagtgctggccaagtat1020ttccctggccggcccttagtccagaacttcctgcactccgtgaatgaatggctcaagagg1080cagaagagaaataaaattccctacagtttctttaaaactgccctggacgacaggaaagag1140ggtgccgttcttgccaagaaggtgaactggattggctgccaggggagtgagccgcatttc1200cggggctttccctgctccctgtgggttcttttccacttcttgactgtgcaggcagctcgg1260caaaatgtagaccactcacaggaagcagccaaggccaaggaggtcctcccagccatccga1320ggctacgtgcactacttcttcggctgccgagactgcgctagccacttcgagcagatggct1380gctgcctccatgcaccgggtggggagtcccaacgccgctgtcctctggctctggtctagc1440cacaacagggtcaatgctcgccttgcaggtgcccccagcgaggacccccagttccccaag1500gtgcagtggccaccecgtgaactttgttctgcctgccacaatgaacgcctggatgtgccc1560gtgtgggacgtggaagccaccctcaacttcctcaaggcccacttctccccaagcaacatc1620atcctggacttccctgcagctgggtcagctgcccggagggatgtgcagaatgtggcagcc1680、gccccagagctggcgatgggagccctggagctggaaagccggaattcaactctggaccct1740gggaagcctgagatgatgaagtcccccacaaacaccaccccacatgtgccggctgaggga1800cctgagc，tt3tttga1815〈210〉2<211〉604〈212〉PRT<213〉Homosapiens〈400〉2MetArgArgCysAsnSerGlySerGlyProProProSerLeuLeuLeuLeuLeuLeuTrpLeuLeuAlaValProGlyAlaAsnAlaAlaProArgSerAlaLeuTyrSerProSerAspProLeuThrLeuLeuGinAlaAsp354045ThrValArgGlyAlaValLeuGlySerArgSerAlaTrpAlaValGlu505560PhePheAlaSerTrpCysGlyHisCyslieAlaPheAlaProThrTrp65707580LysAlaLeuAlaGluAspValLysAlaTrpArgProAlaLeuTyrLeu859095AlaAlaLeuAspCysAlaGluGluThrAsnSerAlaValCysArgAsp100105110PheAsnlieProGlyPheProThrValArgPhePheLysAlaPheThr115120125LysAsnGlySerGlyAlaValPheProValAlaGlyAlaAspValGin130135140ThrLeuArgGluArgLeulieAspAlaLeuGluSerHisHisAspThr145150155160TrpProProAlaCysProProLeuGluProAlaLysLeuGluGlulie165170175AspGlyPhePheAlaArgAsnAsnGluGluTyrLeuAlaLeuliePhe180185190GluLysGlyGlySerTyrLeuAlaArgGluValAlaLeuAspLeuSer195200205GinHisLysGlyValAlaValArgArgValLeuAsnThrGluAlaAsn210215220<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>GinAlaAlaArgGinAsnValAspHisSerGinGluAlaAlal>ysAla420425430LysGluValLeuProAlalieArgGlyTyrValHisTyrPhePheGly435440445CysArgAspCysAlaSerHisPheGluGinMetAlaAlaAlaSerMet450455460HisArgValGlySerProAsnAlaAlaValLeuTrpLeuTrpSerSer465470475480HisAsnArgValAsnAlaArgLeuAlaGlyAlaProSerGluAspPro485490495GinPheProLysValGln'.TrpProProArgGlu丄euCysSer'Ala.Cys'500505510HisAsnGluArgLeuAspValProValTrpAspValGluAlaThrLeu515520525AsnPheLeuLysAlaHisPheSerProSerAsnlielieLeuAspPhe530535540ProAlaAlaGlySerAlaAlaArgArgAspValGinAsnValAlaAla545550555560AlaProGluLeuAlaMetGlyAlaLeuGluLeuGluSerArgAsnSer565570575ThrLeuAspProGlyLysProGluMetMetLysSerProThrAsnThr580585590ThrProHisValProAlaGluGlyProGluLeulie59560018權(quán)利要求1、一種QSOX及其突變體蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO2中所示。2、編碼權(quán)利要求1所述的QSOX及其突變體蛋白的基丙，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。3、制備權(quán)利要求l所述的QSOX及其突變體蛋白的方法，包括如下步驟構(gòu)建QSOX基因；利用突變引物對(duì)經(jīng)重組法對(duì)QS0X基因的不同位點(diǎn)的Cys突變?yōu)锳la;將QSOX基因插入表達(dá)載體；將帶有QSOX基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞；培養(yǎng)該表達(dá)細(xì)胞；誘導(dǎo)表達(dá)；收集并純化表達(dá)產(chǎn)物。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，構(gòu)建QSOX基因的方法是利用克隆引物經(jīng)RT-PCR從成纖維細(xì)胞中克隆出QSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，所述克隆引物序列為P1:5,-GTAcfcgagaaaagaATGAGGAGGTGCAACAGCGGCTCCG—3'P2:5，畫(huà)CAGgcggccgcTCAAATAAGCTCAGGTCCCTCAG—3'。5、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，利用突變引物對(duì)經(jīng)重組法對(duì)QSOX基因的不同位點(diǎn)的Cys突變?yōu)锳la;將QSOX基因插入表達(dá)載體的方法中所用到的突變引物的序列為Pm70-1-5，GGAGTTCTTCGCCTCCTGGGCCGGCCACGCCATCGCCTTCGCCC-3Pm70-2-5GGGCGAAGGCGATGGCGTGGCCGGCCCAGGAGGCGAAGAACTCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的70位和/或73位的Cys突變?yōu)锳la;Pm449-l-5，GCACTACTTCTTCGGCGCCCGAGACGCCGCTAGCCACTTCG-3Pm449-2-5CGAAGTGGCTAGCGGCGTCTCGGGCGCCGAAGAAGTAGTGC-3該對(duì)突變引物將蛋白的449位和/或452位的Cys突變?yōu)锳la;Pm509-l-5，GGCCACCCCGTGAACTTGCTTCTGCCGCCCACAATGAACGC-3Pm509-2-5'GCGTTCATTGTGGGCGGCAGAAGCAAGTTCACGGGGTGGCC-3該對(duì)突變引物將蛋白的509位和/或512位的Cys突變?yōu)锳la。6、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，表達(dá)載體為pET28a，宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，QSOX重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性蛋白，發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，含有目的蛋白的裂解上清夜，利用NT-his親和柱進(jìn)行純化，低濃度咪唑洗雜后，高濃度咪唑洗脫即可得到95%純度的QSOX及其突變體蛋白。8、如權(quán)利要求1所述的QSOX及其突變體蛋白在作為藥物靶標(biāo)和促進(jìn)包涵體復(fù)性以及外源蛋白可溶性、分泌性表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明通過(guò)RT-PCR方法獲得QSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，并進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后將野生型和突變體基因分別構(gòu)建入原核表達(dá)載體的pET系列、pGEX系列和pTYB系列載體和酵母表達(dá)的系列載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行純化和功能研究。文檔編號(hào)C12N15/70GK101503679SQ20081020208公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日發(fā)明者琴尹,磊徐,弋楊,鄭文云申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)