專利名稱：：利用黑曲霉發(fā)酵花生根提取白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開了一種黑曲霉發(fā)酵花生根提取白藜聲醇的新方法，屬于利用植物提取天然產(chǎn)物的
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的說就是各種不同種類的植物，都可以利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶進(jìn)行酶解提取天然產(chǎn)物。白藜,醇(又名芪三酚)，是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚類化合物，在抑制癌細(xì)胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延緩衰老等方面有較顯著的作用，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物；同時(shí)也被美國專著《抗衰老圣典》一書列為"ioo種最熱門有效抗衰老物質(zhì)之一"。我國花生資源極其豐富，是世界花生生產(chǎn)量最高、出口量最多的國家，占世界總量的i/3,然而花生作物特別是花生根利用率極低，幾乎全部以固體廢料被遺棄或被燃燒掉，造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染，且近期的研究發(fā)現(xiàn)，花生根中含有豐富的白藜蘆醇，因此以花生根為原料提取白藜,醇，既可以提高對花生的綜合利用，增加其附加值，又可以拓寬白藜,醇原料來源，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在白藜蘆醇提取技術(shù)上，主要有有機(jī)溶劑提取技術(shù)、超臨界C02提取技術(shù)、但有機(jī)溶劑提取白藜蘆醇有以下缺點(diǎn)提取時(shí)間長，對熱不穩(wěn)定成分易被破壞，雜質(zhì)含量高不易純化，萃取溶劑消耗量大以及污染環(huán)境等。為解決上述問題，人們開始研究開發(fā)新型提取方法。超臨界提取技術(shù)具有提取時(shí)間短、得到的產(chǎn)品純度高，且對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，但這種技術(shù)在生產(chǎn)應(yīng)用上存在設(shè)備一次性投資大，維護(hù)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。酶法提取白藜蘆醇具有提取條件溫和、提取時(shí)間短、乙醇用量少等，但目前主要問題是商品酶的價(jià)格昂貴，且很難從反應(yīng)混合物中回收有活性的酶以重復(fù)使用，增加了生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種花生根白藜蘆醇提取的新方法,利用黑曲霉發(fā)酵花生根產(chǎn)生的纖維素酶來酶解花生根，破壞花生根的細(xì)胞壁，有利于白藜蘆醇提取，大大提高了白藜蘆醇的得率，且提取時(shí)間短，提取劑用量少；同時(shí)酶解所需的纖維素酶為花生根發(fā)酵所得，成本極低，解決了酶法提取中商品酶價(jià)格昂貴的問題，大大降低了生產(chǎn)成本。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種利用黑曲霉發(fā)酵提取白藜蘆醇的方法，其特征在于利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇。比較理想的是其具體生產(chǎn)過程包括如下步驟(1)將黑曲霉菌液接種于滅菌后的花生根，3(TC培養(yǎng)3天；(2)將步驟(1)發(fā)酵所得的花生根加入乙醇提取白藜蘆醇；(3)將步驟(2)的液料混合物真空抽濾，得提取液，提取液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收乙醇，將濃縮液冷凍干燥，得白藜蘆醇樣品。本發(fā)明提供了一種花生根白藜蘆醇提取的新方法，利用花生根中的纖維誘導(dǎo)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶，并利用產(chǎn)生的纖維素酶來酶解花生根，破壞花生根中的細(xì)胞壁，有利于白藜蘆醇的溶出。本方法具有酶法提取的優(yōu)點(diǎn)提取條件溫和、提取時(shí)間短、乙醇用量少，同時(shí)克服了使用商品酶價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，更符合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。圖1為乙醇濃度和提取溫度對白藜蘆醇提取影響；圖2為乙醇濃度和提取時(shí)間對白藜蘆醇提取率影響；圖3為乙醇濃度和液固比對白藜,醇提取率影響；圖4為提取溫度和提取時(shí)間對白藜蘆醇提取率影響；圖5為提取溫度和液固比對白藜蘆醇提取率影響；圖6為提取時(shí)間和液固比對白藜,醇提取率影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1在150ml的三角瓶中加入5g花生根，再加入15ml蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?.15MPa下滅菌20min，冷卻后加入2ml的菌液，攪拌均勻，于30。C培養(yǎng)3天。發(fā)酵后向三角瓶中再加入25ml蒸餾水，37。C浸提lh，過濾，濾液經(jīng)冷凍離心得粗酶液，粗酶液經(jīng)冷凍干燥即到粗酶粉。采用CMCase法測定其酶活大小，A錫，值為M2U/ml，說明黑曲霉發(fā)酵花生根可以產(chǎn)生纖維素酶。實(shí)施例2向6個(gè)150ml的三角瓶中分別加入5g花生根，再分別加入15ml蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?.15MPa下滅菌20min,冷卻后分別加入2ml的菌液，攪拌均勻，于3(TC培養(yǎng)3天。以3個(gè)發(fā)酵后的花生根為一組，分成兩組。第一組分別加入加入33.3ml的pH4.5醋酸緩沖液,45。C反應(yīng)60min,過濾，濾渣加入60%的乙醇50ml,5(TC提取40min,過濾,定溶到100ml,稀釋20倍測A305nm,得平均值為0.669;向另一組中分別加入60%的乙醇50ml,50。C提取40min,過濾,定溶到100ml，稀釋20倍測A3。5nm,得平均值為0.611。說明發(fā)酵后的花生根經(jīng)過酶解反應(yīng)和不經(jīng)過酶解反應(yīng)直接提取白藜蘆醇，白藜蘆醇的提取率差距不大，因此確定發(fā)酵后直接乙醇提取的方法。實(shí)施例3在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對黑曲霉發(fā)酵后的花生根進(jìn)行白藜蘆醇提取工藝的優(yōu)化。以發(fā)酵后的花生根提取液稀釋20倍的吸光值A(chǔ)3()5nmx20作為響應(yīng)值Y。試驗(yàn)釆用四因素五水平二次回歸中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取乙醇濃度(X,)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)和液固比(X4)對提取率(Y)的影響，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1與表2,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析釆用Design-expert軟件。表l因素水平編碼<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對自變量編碼XpX2、X3和X4進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)回歸方程為)Y:0.76+0.043X+0.016X2+0.019X3+0.018X4-0.019XX2隱0.033X,X3-0.025XjX4-4.625xio.3X2X3-0.028X2X4-0.011X3X4-0.030X!2-8.917xio.3X22-0.017X32-8.917x10—3X42通過Design-Expert軟件進(jìn)行方差分析來驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，結(jié)果如下表3模型的ANOVE分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>由方差分析可以看出，模型Prob〉F值小于0.01,表明該模型方程高度顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型失擬項(xiàng)的Prob〉F值為0.059>0.05，模型失擬項(xiàng)項(xiàng)不顯著，模型選擇合適。且模型相關(guān)系數(shù)112為94.89%，大于90%,說明模型擬合程度良好,試驗(yàn)誤差小，該模型是合適的。變異系數(shù)反映模型的置信度，變異系數(shù)越低模型的置信度越好;本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)為3.24%，說明模型方程能很好的反應(yīng)真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下花生根中白藜蘆醇的提取率的變化。由表3的P值可以知道，方程中X,，X2，X3，X4,X,X2，X,X3，X,X4,X2X4，X/對Y值的影響高度顯著，表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著影響。實(shí)施例4根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出乙醇濃度和提取溫度對白藜蘆醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖1。圖1可以看出，乙醇濃度和提取溫度交互作用對白藜聲醇提取影響顯著。在提取溫度較低時(shí)，隨著乙醇濃度的增加白藜蘆醇的提取率逐漸增加；當(dāng)溫度增高后，乙醇濃度增大到61-63%時(shí)，總提取率達(dá)到最大，再增大乙醇濃度，提取率反而下降，分析原因可能是在高溫高濃度乙醇條件下，花生根中一些醇溶性雜質(zhì)溶解量增大，這些物質(zhì)與白藜蘆醇竟?fàn)幫掖?水分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致白藜F醇提取率降低。實(shí)施例5根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出乙醇濃度和提取時(shí)間對白藜聲醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用對白藜蘆醇提取影響顯著。在乙醇濃度較低時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的延長而增加；但當(dāng)乙醇達(dá)到一定濃度時(shí)，提取時(shí)間在55min左右提取效果最好，再延長提取時(shí)間，提取效果反而下降，其原因可能是白藜蘆醇為熱不穩(wěn)定性物質(zhì)，提取時(shí)間越長，分解的越多。實(shí)施例6根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出乙醇濃度和液固比對白藜蘆醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，乙醇濃度和料液比的交互作用對白藜蘆醇提取影響顯著。在乙醇濃度較低時(shí)，提取率隨著液固比的增加而增加；但當(dāng)乙醇達(dá)到一定濃度時(shí)，液固比在10:l左右提取效果最好，再增加提取溶劑的量，提取效果反而下降。實(shí)施例7根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出提取溫度和提取時(shí)間對白藜蘆醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對白藜蘆醇的提取影響不顯著。當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，提取率隨著提取溫度的升高增加，溫度增加到59t:左右時(shí)提取率達(dá)到最高，之后提取率下降。當(dāng)提取溫度固定時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加68min達(dá)到，時(shí)間再延長，提取率反而下降。實(shí)施例8根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出提取時(shí)間和液固比對白藜聲醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對白藜聲醇的提取影響顯著。當(dāng)液固比較小時(shí)，提取率隨著提取溫度的增加而增加；當(dāng)液固比較大時(shí)，提取率隨著提取溫度的增加是先增加后減少；但當(dāng)液固比達(dá)到最大時(shí)，提取率隨著提取溫度的增加而減少實(shí)施例9根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出提取溫度和液固比對白藜蘆醇提取影響的響應(yīng)面和等高線圖，其結(jié)果見圖6。從圖中6可以看出，提取時(shí)間和液固比的交互作用對白藜,醇的提取影響不顯著。當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，提取率隨著液固比的增大而增加，液固比增大到12:1左右時(shí)，提取率達(dá)到最高，之后提取率下降。當(dāng)液固比固定時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加，在66min左右達(dá)到，時(shí)間再延長，提取率反而下降。實(shí)施例10進(jìn)一步用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經(jīng)分析得，在X產(chǎn)0.85，X產(chǎn)1.00,Xf-0.06,X4二1.00即在乙醇濃度為64.25%,提取溫度為55°C，提取時(shí)間為59.55min，液固比8:1,得到理論最大值(A鄉(xiāng)腦x20)為0.78306。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進(jìn)行白藜,醇提取實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利性，將提取條件修正為乙醇濃度64%，提取溫度55'C，提取時(shí)間60min，液固比為8:1。3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均值(A，加x20)為0.759,白藜蘆醇提取率為0.191%，與理論值相差3.07%。因此響應(yīng)面法對花生根白藜蘆醇提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的白藜,醇提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種利用黑曲霉發(fā)酵花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇。2、如權(quán)利要求1所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將黑曲霉菌液接種于滅菌后的花生根中，30。C培養(yǎng)3天；(2)將步驟(1)發(fā)酵所得的花生根加入乙醇提取白藜蘆醇；(3)將步驟(2)的液料混合物真空抽濾，得提取液，提取液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收乙醇，將濃縮液冷凍干燥，得白藜蘆醇樣品。3、如權(quán)利要求2所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜聲醇的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的黑曲霉菌液的制備方法為將斜面培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子用無菌水淋洗制成懸浮液，再接入裝有100mlPDY培養(yǎng)基中，于25。C150r/min培養(yǎng)3d。4、如權(quán)利要求2或3所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于所述的提取劑乙醇的濃度為64%。5、如權(quán)利要求2或3所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于所述的提取溫度為55°C。6、如權(quán)利要求2或3所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于所述的提取時(shí)間為60min。7、如權(quán)利要求2或3所述的利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇的方法，其特征在于所述的提取液料比為8:1。全文摘要本發(fā)明公開了一種黑曲霉發(fā)酵花生根提取白藜蘆醇的新方法，屬于利用綠色植物提取天然產(chǎn)物的
技術(shù)領(lǐng)域：
，其特征在于利用花生根發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶解花生根提取白藜蘆醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用花生根黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶代替商品纖維素酶進(jìn)行酶法提取，且利用酶法提取白藜蘆醇提取時(shí)間短，提取條件溫和，極大的提高了白藜蘆醇得率，極大地降低了白藜蘆醇的生產(chǎn)成本，更適合大規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。文檔編號C12P7/22GK101353675SQ20081014743公開日2009年1月28日申請日期2008年8月15日優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日發(fā)明者張初署,楊慶利,潘麗娟,禹山林申請人:山東省花生研究所