專利名稱：：帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甾醇和皂苷類化合物具有重要的生理活性和生物學(xué)功能。甾醇是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)的一種物質(zhì)，可分為動物性甾醇、植物性甾醇和菌性甾醇。動物性甾醇以膽固醇為主。植物性甾醇主要包括谷甾醇(Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)和菜油甾醇(Campestanol)等。菌類甾醇主要包括麥角甾醇。植物甾醇能夠抑制人體對膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成，具有抑制心血管疾病、抗癌、抗腫瘤、消炎、提高免疫、調(diào)節(jié)生長、抗病毒等作用，此外，植物甾醇還具有良好的抗氧化性，可用作食品抗氧化劑。--谷甾醇("-Sitosterol)是細(xì)胞膜的重要組成部分，對于維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用。油菜素內(nèi)酯(brassinolide)被稱為第六大類植物激素，在植物生長發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。皂苷是螺甾垸及其生源相似的甾族化合物的低聚糖苷或三萜類化合物的低聚糖苷，廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中。三萜皂苷類代謝物在農(nóng)業(yè)科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。齊墩果酸具有降低轉(zhuǎn)氨酶的功能，臨床用于治療急性黃疸肝炎；燕麥在根尖合成的燕麥苷(avenacins)具有廣譜的抗菌功能，能防止多種病原菌侵染根部，發(fā)揮抗病作用(Haralampidisetal.,98:13431-13436);人參根部合成的人參皂苷類化合物是重要中藥的有效成分(Shuklaetal.,Phytochemistry，29:239-241)。樺木酸具有抗腫瘤、抗艾滋病病毒、抗炎和體外抗瘧病等多種生物活性。目前，對植物甾醇和三萜類皂苷的生物合成途徑己有初步認(rèn)識。異戊二烯途徑是獲得這些代謝產(chǎn)物的必由途徑，其生物合成路線為甲羥戊酸(Mevalonicacid)生成的異戊烯二磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯二磷酸(DAPP)在香草二磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成香葉二磷酸(GPP)，接著利用法呢二磷酸合成酶(FPS)轉(zhuǎn)化成法呢二磷酸(FPP)，又在鯊烯合成酶(Squalenesynthase,SQS)的作用下合成鯊烯，然后經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶(Squalene印oxidase，SQE)催化轉(zhuǎn)變?yōu)?，3-氧化鯊烯(2，3-oxidosqualene)，最后2，3-氧化鯊烯經(jīng)過2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶(0SCs)的環(huán)化作用得到植物甾醇和三萜類骨架。三萜類骨架依賴細(xì)胞色素P450單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行氧化、糖基化及?；然瘜W(xué)修飾，最終獲得不同種類的三砲類皂苷產(chǎn)物。2，3-氧化鯊烯在氧化鯊烯環(huán)化酶(0SCs)的作用下環(huán)化形成甾醇和三蔽類產(chǎn)物各自的前體物質(zhì)，如環(huán)阿屯醇(Cycloartenol)、P-香樹素(0-Amyrin)等。目前已經(jīng)從不同植物中分離得到了約10種編碼0SCs酶的基因，包括羽扇醇合成酶(Lupeolsynthas，LUP)、0-香樹素合成酶(P-Amyrinsynthase,P-AS)、葫盧二烯醇合成酶(cucurbitadienol，CPQ)、thalianolsynthase(THA)、marneralsynthase(MRN)、camelliolsynthase(CAMS)、baruolsynthase(BARS)、isomultiflorenolsynthase(IMS)、羊毛甾醇合成酶(lanosterolsynthase,LAS)和環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenolsynt|rase，CAS)(Philipsetal.，Currentopinioninplantbiology,9:1-10)，其中前8種酶可能是合成各類三砲類產(chǎn)物的前體，第io種酶是甾醇的前體。e-香樹素合成酶參與起始多數(shù)皂苷類物質(zhì)的合成(^-amyrinsynthases)，然后通過加氧、糖基化、?；纫幌盗蟹磻?yīng)產(chǎn)生三萜皂苷(Qietal.,PNAS，101:8233-8238)。羽扇豆醇合酶(lupeolsynthases)參與了稗木酸(Betulinicacid)的合成(Hayashietal.，Bio.Pharm.Bull,27:1086-1092)。羊毛甾醇，帕克醇和環(huán)阿屯醇是真核生物甾醇合成的三種中間產(chǎn)物。多數(shù)原核生物不合成甾醇類物質(zhì)，但個別真細(xì)菌能通過羊毛甾醇和帕克醇途徑合成甾醇，如浮霉菌(planctomycete)。除了環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇以外，棕鞭藻(OchromonasMalhamensis)還利用帕克醇(parkeol)生成多空甾醇(poriferasterol)和穿貝海綿甾醇(clio謹(jǐn)terol)(PalmerM.A.etal.，phytochemistry，17:1577-1580)，表明氧化鯊烯環(huán)化酶(0SC)基因具有催化生成多種甾醇前體(包括帕克醇)的功能。動物和真菌通過羊毛甾醇途徑合成膽固醇(cholesterol)和麥角固醇(ergosterol)。高等植物是通過環(huán)阿屯醇合成甾醇，同時保留了合成羊毛甾醇和帕克醇的能力。在高等植物中，環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenolsythases)參與植物甾醇(phytosterol)的合成(Coreyetal.，PNAS,90:11628-11632)。在高等植物中也存在羊毛甾醇和帕克醇，最近在雙子葉植物中克隆到了編碼羊毛甾醇合酶(lanosterolsynthases)的基因(Kolesnikovaetal.，ABB，447:87-95;Suzukietal.，Plantcellphysiol.47:565-571)，但到目前為止還沒有從任何植物中克隆得到的編碼帕克醇合成酶的基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的帕克醇合成相關(guān)蛋白，名稱為0s0SC9，來源于粳稻品種中花ll號(&yza厶5/p.japonica)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與帕克醇合成相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。上述取代和/或缺失和/或添加具體可為1至10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由759個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的0s0SC9便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的0s0SC9可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的0s0SC9的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'端第1至2280位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因^仍)W也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白的編碼基因可為如下l)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有9(^以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65。C條件下雜交并洗膜。序列表中的序列1由2280個堿基組成，序列2中自5，端第1至2280位核苷酸編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)用于擴(kuò)增所述基因(fefl5Z^)或所述基因(&0沉》)中的任一DNA片段的引物對。含有所述基因(&0沉》)的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有^096^基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因(&必C50構(gòu)建重組表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子；此外，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在細(xì)胞中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。所述表達(dá)載體具體可為酵母表達(dá)載體，如畢赤酵母(pic力&)表達(dá)載體或釀酒酵母(Saccharomyces)YES載體庫中的載體。所述酵母表達(dá)載體還可以包括1)用于蛋白分泌表達(dá)的a因子、pho;2)用于產(chǎn)生融合蛋白的C末端和/或N末端的6個HIS標(biāo)簽；3)用于制備抗體的c-myc表位；4)用于轉(zhuǎn)化子篩選的Zeocin、層P、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記；5)URA3報告基因；6)用于誘導(dǎo)表達(dá)的A0X1、GAP、AUG1、GAL1、TEF1等誘導(dǎo)型啟動子。所述重組表達(dá)載體具體可為圖2所示的pPICZ-0SC9。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系可通過將所述基因(&flSTP)導(dǎo)入細(xì)胞得到，具體可將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞得到，如將圖2所示的pPICZ-0SC9導(dǎo)入酵母細(xì)胞得到。所述酵母具體可為畢赤酵母或釀酒酵母。攜帶&05〗"基因的酵母表達(dá)載體可以通過任何常規(guī)分子生物學(xué)方法(如電擊法、熱擊法)導(dǎo)入酵母細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的單克隆酵母細(xì)胞系。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)帕克醇的方法，是培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，得到帕克醇。本發(fā)明提供的帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因可應(yīng)用于培育高產(chǎn)和抗病水稻品種，并同時減少農(nóng)藥用量和保護(hù)生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明通過將所述帕克醇合成相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)虢湍讣?xì)胞，得到了所述基因的酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞即可得到帕克醇。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價值和深遠(yuǎn)的意義。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為^G5Z"基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖2為pPICZ-0SC9的物理圖譜。圖3為^flSt^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定。圖4為發(fā)酵^flS6^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的帕克醇的色譜圖。圖5為發(fā)酵^flST9酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的帕克醇的MS分析圖。圖6為發(fā)酵0^^<"酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的帕克醇的結(jié)構(gòu)圖。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例l、flsfl5)"基因的獲得根據(jù)來源于燕麥的氧化鯊烯環(huán)化酶(0SC)基因序列AsC57(GenBankAccessionNumber:AJ311790)和AMS(GenBankAccessionNumber:AJ311789)在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn檢索，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)12個同源性較高的全長cDNA序列，根據(jù)其中一個基因(ttsflS^P)的核苷酸序列設(shè)計以下引物5，端引物5'-ATGTGGAGGCTGAAGGTGTCG-3';3，端引物5'-CTATATGTTGCCTGCAAGCAGT-3'。以粳稻品種中花ll號(0ryzasativaL.s卯.japonica)幼苗總RNA為模板，用上述引物對進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體步驟如下1、總RNA的提取用Trizol法(所用試劑購自Invitrogen公司)提取2周幼苗的總RNA，具體方法為收集100mg水稻材料，立即置于液氮中研磨，加入lmLTrizol試劑，充分混勻后，室溫放置5分鐘；加入0.2mL氯仿，劇烈振搖15秒，室溫溫育3分鐘；4°C，12000g離心15分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL離心管中，加入0.5raL異丙醇沉淀RNA;最后將RNA沉淀用lmL75%乙醇洗滌后溶于適量經(jīng)DEPC處理過的雙蒸水中，-70'C保存?zhèn)溆谩?、cDNA的合成應(yīng)用SuperscriptIIRT試劑盒(Invitrogen)并按試劑盒說明書進(jìn)行操作取1-5ug步驟1獲得的水稻總RNA放入滅活了RNase的PCR管中，加入1uLOligo(dT)12-18(500mg/mL)和1uLdNTP混合物(各lOmM)，用DEPC處理后的雙蒸水補(bǔ)充至12uL，混勻后在65。C下加熱5分鐘，然后迅速置于冰上，l分鐘。短暫離心后再加入4uL5X第一鏈合成緩沖液、2nL0.1MDTT禾B1uLRNaseOut(40U/ixL)，輕輕混勻后，42。C溫育2分鐘，然后加入1ULSuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(200U/uL)，混勻，42"C溫育50分鐘，7(TC加熱15分鐘使酶失活，得到第一鏈cDNA。3、基因克隆取l!iL步驟2獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在5'端引物和3'端引物的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為0.5nLproofstart(Qiagen公司)、5uL10X緩沖液(Qiagen公司)、luLdNTP、lyL5，端引物(10ixM/L)、luL3，端引物(10uM/L)、luL模板、加雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50uL。PCR反應(yīng)條件為先95°。5分鐘；再94。C45秒，60°C45秒，72°C5分鐘，共35個循環(huán)；最后72'C10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8X瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖l所示。圖1中，M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量XDNAA5boA7V歷/3o7i7;1:RT-PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明，得到了分子量約為2.2kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天為時代公司)回收該片段，然后將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)進(jìn)行連接。連接體系為luLT4DNA連接酶(3u/uL)、5uL2X連接酶緩沖液、0.5"LpGEM-TEasy(50ng/uL)和3.5uLPCR回收產(chǎn)物。連接反應(yīng)條件為4。C反應(yīng)12-24小時。參照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進(jìn)行核苷酸序列測定。測序結(jié)果表明擴(kuò)增到的序列由2280個堿基組成，其開放閱讀框(ORF)為序列表中序列1的自5'末端第1-2280位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)。將序列1所示的DNA序列命名為Os必t^將序列2所示的氨基酸序列命名為0s0SC9，將在pGEM-TEasy中插入序列1所示的核苷酸序列得到的重組載體命名為pTE-^仍Z^。將^G5r^和0s0SC9與As力AS"(GenBankAccessionNumber:AJ311789)進(jìn)行同源性比較，核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為60.28%和51.77%。實施例2、^flSr^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的獲得及其鑒定一、酵母表達(dá)載體pPICZ-0SC9的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶M^I分別將pTE-fe必t^和pPICZA載體(Invitrogen)完全酶切。酶切體系為5ugpPICZA、2.5uL10X酶切緩沖液、1uLtV"I，加ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50yL。酶切反應(yīng)條件為37r酶切l(wèi)小時。2)用瓊脂糖電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，分別回收2.2kb左右的包含fts仍tP的片段和3kb左右的pPICZA載體片段，分別溶解于20uLddH20中。3)將步驟2)獲得的兩種片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為luLT4DNA連接酶、2uL10X連接酶緩沖液、3uL回收的包含6^05〗W基因的DNA片段、luLpPICZA載體片段。連接反應(yīng)條件為4"C連接12小時。4)將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有Zeocin的LB平板(Zeocin濃度為50ug/ml)進(jìn)行篩選。5)將陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，引物如下5'AOX引物:5'—GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3';tt^5t^基因特異反向引物5'-TGGACCCTCCCCAAGCAAT-3'。結(jié)果表明，6^^5t^基因插入了pPICZA，且方向正確，將該重組質(zhì)粒命名為pPICZ-0SC9，其物理圖譜如圖2所示。二、te仍〗3酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的獲得及其鑒定i、Osasr^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的獲得應(yīng)用電激儀(德國Eppendorf公司)并參照說明書進(jìn)行操作。將質(zhì)粒pPICZ-0SC9用電激法轉(zhuǎn)化野生型酵母X-33(Invitrogen)，用含有Zeocin的LB平板(Zeocin的濃度為400ug/ml)進(jìn)行篩選。用0s0SC9基因特異引物對(5'A0X引物和3'AOX引物)鑒定陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，具體步驟如下選取一個陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，重懸于10U1水；加入5U15U/Ul溶壁酶(Sigma)溶液，30。C溫浴10min，-80。C冰凍10min。PCR體系:5u110Xbuffer,5u125mMMgCl2，1ix125mMd證s，1u110pmo1/u15'AOX引物，lullOpmol/ul3'A0X引物，27ul蒸餾水，5ul上述細(xì)胞裂解液，混勻，加20ul石蠟油，置于PCR儀，95。C5min;加入5u10.16U/u1Taq(0.8unit)。PCR程序:30次(95。Clmin;54°Clmin;72°Clmin);72°C7min。0s0SC9基因特異引物對如下5'AOX引物5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC—3';3'AOX引物5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。電泳結(jié)果表明，得到了^仍〗"酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將質(zhì)粒pPICZA電激導(dǎo)入野生型酵母X-33，得到作為對照的轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞。實施例3、培養(yǎng)0^5〗W酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)帕克醇1、0仍V"酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)在250ml培養(yǎng)瓶加入25ml的MGY培養(yǎng)基(1.34%酵母氮源，1%甘油，0.00004%生物素)，接種單個tt^5f:9酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞，28-30°C、25(H300rpm振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到對數(shù)生長期(OD600=2-6)，大約16-18小時。離心(1500-3000g、5min)收集細(xì)胞，棄上清，用醒培養(yǎng)基(1.34%酵母氮源，0.00004%生物素，0.5%甲醇)重懸到0D6。。=1.0，大約100-200ml。把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到1L的長頸培養(yǎng)瓶，用2層無菌紗布蓋住培養(yǎng)72小時，每24小時添加一次100%的甲醇，使其甲醇的終濃度保持0.5%。試驗設(shè)IOO個重復(fù)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞，操作同上。2、帕克醇的鑒定1)初步鑒定①裂解和提取酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時后，分別收集25ml&05〗3酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物，室溫下3000g離心2-3min。加入2ml含20%的KOH和50%乙醇的裂解液，95°C處理15min。加入2ml正己烷進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取一次，合并2次萃取產(chǎn)物，揮干后溶解于100lil的氯仿。②鑒定取25-50ul步驟①得到的溶液，點(diǎn)到硅膠板上，在正己垸乙醚的混合物(正己烷乙醚=1:1)中展開，在空氣中干燥，用5ml染色液噴霧(4.8ml冰乙酸，100w1濃硫酸，100ulp-anisaldehyde)，130。C烘烤顯色。結(jié)果見圖3，圖3中，1:酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物；2:轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物。結(jié)果表明，在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)以后，與轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的酵母細(xì)胞相比，Os仍Z^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞多了一條帶，說明OsOSC9能在酵母中產(chǎn)生其催化產(chǎn)物。2)進(jìn)一步鑒定①裂解和提取酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物同上述步驟l)中的①。②鑒定將50u1步驟①得到的溶液，用氮?dú)獯蹈珊笥?0u1BSTFA禾B25u1pyridine溶解，在80。C衍生化1小時，取4叱用于GC-MS(Agilent6890GasChromatograph)分析，毛細(xì)管柱為DB-5(Hewlett-PackardHP5,35mlength30.25mmdiameter30.25mmthickness)。結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，攜帶水稻^asr^的酵母細(xì)胞表達(dá)物比轉(zhuǎn)化空載體的酵母細(xì)胞在27.6min多了一個色譜峰。MS的檢測器在70eV能量下，以30次/秒的速度掃描，掃描區(qū)間為30-700u。將MS峰的數(shù)據(jù)和已知的三萜化合物數(shù)據(jù)庫比對，見圖5。圖5中，a為本實驗獲得OsOSC9產(chǎn)物的MS峰圖，b為發(fā)表文獻(xiàn)中parkeol的MS峰圖3)分別將5-10升afl5t^酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，以上述步驟1)中相同的方法裂解、提取、硅膠板層析后，刮取OsOSC9對應(yīng)的層析帶，用5ml氯仿洗脫3次，收集上清，揮干后獲得5mg產(chǎn)物，經(jīng)^-、13C-NMR(600MHz)和MS分析，確定產(chǎn)物為帕克醇，結(jié)構(gòu)見圖6。0s0SC9產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下:EI-MSm/z:498[M+Si(CH3)3]+，466，385，311，295，241，213，173，129。力-NMR(CDC1"600MHz)5:0.65，0.75，0.82，0.88，0.99，1.04，1.60，1.68(各3H，8XCH》，3.20(1H，dd，7=4.2，12.0Hz，3。-H)，5.09(1H，m，H-24)，5.22(1H，m，H-11)。13C-麗R(CDC13，125MHz)S:14.64(C-18)，15.65(C-30),17.67(C-26)，18.57(C-21)，18.91(C-28)，21.38(C-6)，22.26(C-19)，25.04(C-23)，25.73(C-27)，27.83(C-2)，28.09(C-7)，28.24(C-16)，28.28(C-29)，38.87(C-15)，35.14(C-12)，35.67(C—20)，36.12(C—1)，37.28(C—22)，39.11(C—4)，39.39(C—10)，41.82(C-8)，44.31(C—13)，47.16(C-14)，50.78(C—17)，52.51(C-5)，78.92(C-3)，114.98(C-11)，125.12(C-24)，130.92(C-25)，148.53(C-9)。序列表〈110〉中國科學(xué)院植物研究所<120>帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用<130〉CGG臓Y81566<160〉2〈210〉1〈211〉2280〈212〉DNA<213〉稻屬水稻(ftrz3ss"raLspp.japonica)〈400〉13tgtggaggctg犯ggtgtcggagggcggca^gcccalggctgcggtcggtaaacaatctc60ctcggccggcaagtgtgggsgttcgaccctgacctcggcacgccagaggagcgcgccgat120gtgg卿aggcgcgccgcgagttcgccgagcaccgcttcgagcgcaagcattctagcgac180ctcctcatgcggatgcagttcgcta^3g肌a^ctgtc肌aagctggaccttctcgctgtc240aagcgtggaga_gca_cgaag3cgtcatgggggaagctgtgtggagctctttg犯3CgggCC3003t犯gCCgCgtttgtaatttgcaggcacatgatggacactggcccgggga_ttatgc3gga_360cttatgttcttutgcctggcttgattataacsttgcatgtc明tggagttctgaacact420gttttatcatCgg肌C3tC3gaagg卿tgcgccggtacatctataatcacc3gaatga^480gatggagggtgggggttgC8LcattgagggcC3cagcacc3tgcttggctcatccctgaac540tatgttgctttgagattgcttggggagggtccaaatggtggagatggatgcatagagaat600ggtcgeia^ct■gga_ttttsg3tcatggagg3gccacatttacgacatcatggggga3gttc660tggctctcggtacttggagtatttgattggtccggtaataacccagtgccaccagagtta720ttactattgccgtatcaactgccgtttcacccaggtcgaatgtcgagctatatccgaatg780gtgtttatacccatgtcttacatttatggaaaaaggtttgttggcccagta^caccagtt840gtgct卿gctaagaagtgagacccctatgatgagattgaCtgg犯C3犯900gctcgtactcagtgtgcaaaggaagatatgtactatccacgttcatccaa3Ctgg3t3tg960ttttggtcctttctccacaagtttattg犯ccagttttgttgcgctggcctggg卿犯ei1020ctgagggagaaagctctggccacttccatga_ggaMgttcetct3tgaagatgagtgcact1080cgatacatctgtttcggtggtgtacccaaggcattaaatatccttgcttgctggattgaa1140gatccaagctcagaggcattcaaatgccatattgcacgcgta/t3tga_tt￡itttatggatc1200gctga卿cggcatgaagatgc3gatttacgatggcagcca_ggtgtggg￡icgcetggtttg1260acagttgaggcccttgtggctactgaccttgtC朋3g3gCttggaccaactctt3肪cga1320gcgcattccttccttaagaattcgcagttgcttgacaattgcccccgagatttcaaccgc1380tggtatcgccatatatccaa3ggtgg3tggacatttacaacagctgatgatggctggcetei1440gtttcagattgcacggcgac3gcactgaaggcatgtctattgttaitca^ggatatctcct1500gaaatcgttggtgaaccactgg333ttgatgcacaatacgatgctgttaattgtctgatg1560tctttgatgaatgataatggtggcttttcagcatttgaactcgtaaggtctaataca_tgg1620Ctgg3gCElt8ttaatcctacagaggcatttgggcgtgtaatgattgaatatccgtatgtc1680g肪tgt3C3tcatcatcaattcagtgtctagcattattcaaaaaacttcaCCC2lgggC2lC1740cgcaaggaagaggtgg肌aattgtatcagcaaaggtgctaatttc3ttg3gagttctcag1800卿agcg3tggttcatggtatggttcUgggggatttgtttcacctatgccacatggttt1860gcagtga_caggattagtttctgcaggcaggacacttgggaatagcgctac3gtt3g3gi3g1920gcatgtgactttctcttgtcaaaacagcttccttcgggtggctggggcgagagctatttg1980tcatgtcatg3Cg3ggttt3cacaaatcttaaaggcaaccgacctcacggtacgcacact2040gcgtgggccatgattgcactaattgatgcagggc鄉(xiāng)ctg3犯g3gatccagtgcctctg2100catcgagcagccaaggctttgctcaacttgc朋tt3g3ggtcc3cagca32160gaaattgttggagtctttctccaaactgccatgatcagtt3ttcccagtacaggaacatc2220ttccctataatggctctcac3gggt3tCgCcgccgagtactgcttgcagg2280〈210〉2<211〉759<212>PRT<213〉稻屬7jC稻(OiTzssatiraLspp.japonica)<400>2MetTrpArgLeuLysValSerGluGlyGlySerPro15ValAsnAsnLeuLeuGlyThrPro35HisLeu20GluAlaGlu50MetGinPheAlaLys65LysArgGlyArgGinArgArgPheGluGluArgAlaLeuLysHisTrpGlyArgGluHis85lieGlu70GluSerAla100GlyAspTyrAlaPro115ThriLeuHisVallielie130GluHisGinLysGlu145AspGlyGlyLysTrpMet150LeuSer135ArgHisSerSerLeuAsn180GlyCyslieGluGlyGlyAsp195AlaThrPheThrGlyGly210LeuGlyValPheAsp225Trp230Val25ValGlySerProTrp10TrpGluPheAspLeuArg15AspSerLeuAsp40LysHisSer'SerPro30ArgGluPheArg55AsnCysGinLysGluLysAlaArg45LeuLeuMetArgAsp60AspLeuLeuAlaAspValMetArgLeu75GluAlaValTrpValGly90AsnLeuGinAlaCys105LeuMetPhePheSer95AspVal80SerGlyGly120GlyValLeuAsnHis110ProGlyLeuLeu125ValLeuSerSerArglieGly165TyrValAlaLeuAsn200SerTyrGluArg185GlylieGly170LeuArgGlyThr140AsnHisGinAsnTyr155HisSerThrMetLeuAsnLeu175ProGlu160GlyAsnThr215SerGlyAsnAsnTrpGlyLysPro235GlyGluGly190TrplieLeuAspHis205TrpLeuSerValPhe220ValProProGluLeu240LeuLeuLeuProTyrGinLeuProPheHisProGlyArgMetSerSer245ValPhelieProTyrlieArgMet260ProValThrProHis250SerTyrliePheValGly275AspMet265ValLeuGluLeuArgTyrSer255LysArgTyrCys305PheAsn290AlaLysGluTrpSerPheGlyProTyrAspTyrAspVal280lieAspTrpAsnGly270SerGluLeuGlu295TyrTyrProMet310HisLysPhelieTrpArgArg285AlaArgThrGinLys300SerLysLeuAspProGlyArgLeu325LeuArgGluLysSer315ProValLeuLeuValHisTyr355AlaLeuAsnlieLysLeuArgGluLysAla340345GluAspGluCysThrArgGlu330LeuAlaThrSerArg335ArgMet320TrpAsnProGlu385AlaLys370AlaPheLysCysThr360AlaGluAspAspAlaGlyGluLeuGly435LeuLysGlyLeuAlaCys375lieAlaArgValTyrlieCysTrpMet350GlyGlyValliePhe365AspProSerSerHis390LysMetGinlieGlu380AspTyrLeuTrpMet405ThrValGluAlaTyr395AspGlySerGinLeu420ProThrLeuLysTyr410ValAlaThrAspLeu425AlaHisSerPheVal415Vallie400TrpLysGinlie465Leu450SerAspAsnCysGlyArg440ArgAspPheAsnLysGlyGlyTrp470Pro455ThrPheThrThrAla475Arg460AspLeu445TrpAspLeu430LysAsnSerTyrGlyArgTrpHisGin480ValSerAspCysThrAlaThrAlaLeuLysAlaCysLeuLeuLeuSer485GlulieValGlyArglieSerTyrAspPro500ValAsnCysLeuLys490ProLeuGluliePheAla515AlaPheGluLeuGlu505SerLeuMetAsnLeu495AlaGinSer530ProThrGluAlaMet520ArgSerAsnThrAsp510AsnGlyGlyAsn545GluCysThrSerPhe550SerVal535GlyArgValMetAsp525LeuGluHislieTrp540GluTyrProTyrSer565ArgLysGluGluHisProGlyHis580lieGluSerSerlieGinCysLeu570Glulie555AlaLeuPheLysAlaAsnPhe595GlyVal585ArgSerSerLeu625AlalieTrp610ValSerAlaCysAspGluSerTyrPheCysGlyLeu645SerPheArg630LeuGin600TyrAlaThrThr615ThrLeuGlyAsnAsnAspTrpCysGlylieSer605AlaSer590TrpLys575LysVal560LeuGlyTyrGlyValThrGlyPhe620AlaThrValArgSerLysCysHisAspLeu660HisGlyThrHisAsnArgPro675GlyGinAlaGluAspLys705Ala690AlaLeuLeuAsnLeu710Arg695GinThr680AspGinGlu665AlaLeu650ValSer635ProSerGlyGlyTrpValLeuGluAspTyrThrAsnAlaMetTrp655LysL>ys640GlyGlyLeu670AlaLeulieProVslProGly715lie685HisArgAlaAlaLeu700GluPheProGinGin720GlulieValGlyValPheLeuGinThrAlaMetlieSerTyrSerGin725730735TyrArgAsnliePheProlieMetAlaLeuThrGlyTyrArgArgArg740745750ValLeuLeuAlaGlyAsnlie75權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與帕克醇合成相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因為如下l)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。4、用于擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因或所述基因中的任一DNA片段的引物對。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為酵母表達(dá)載體，優(yōu)選畢赤酵母表達(dá)載體或釀酒酵母表達(dá)載體。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為圖2所示的pPICZ-0SC9。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)虢湍讣?xì)胞得到的。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，所述酵母為畢赤酵母或釀酒酵母。10、一種生產(chǎn)帕克醇的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求8或9所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，得到帕克醇。全文摘要本發(fā)明公開了一種帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的帕克醇合成相關(guān)蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與帕克醇合成相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的帕克醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因可應(yīng)用于培育高產(chǎn)和抗病水稻品種，并同時減少農(nóng)藥用量和保護(hù)生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明通過將所述帕克醇合成相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)虢湍讣?xì)胞，得到了所述基因的酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞即可得到帕克醇。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價值和深遠(yuǎn)的意義。文檔編號C12N9/00GK101633913SQ20081011722公開日2010年1月27日申請日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日發(fā)明者段禮新,漆小泉,薛哲勇申請人:中國科學(xué)院植物研究所