專利名稱：：一種雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子及其制備方法。
背景技術(shù)：
：在人體腸道中棲息著400多種、數(shù)量多達(dá)百萬(wàn)億的細(xì)菌，其生物量達(dá)糞便干重的1/3-1/2。這些細(xì)菌按照對(duì)人體健康的影響可分為有益、有害和無(wú)害三類群，正常情況下這三類群細(xì)菌處于相對(duì)的平衡狀態(tài)。若人體有益菌如雙歧桿菌等處于優(yōu)勢(shì)，則對(duì)凈化腸道、改善營(yíng)養(yǎng)、維護(hù)人體健康起重要作用。雙歧桿菌(說(shuō)yWok^ten'i/m)是一種益生菌，其主要功能有維持腸道菌群平衡，治療腸道功能紊亂；抗腫瘤作用；激活免疫系統(tǒng)，提高人體免疫機(jī)能;營(yíng)養(yǎng)作用；控制內(nèi)毒素的產(chǎn)生；降低自氧化作用，延緩機(jī)體衰老；降低血清中膽固醇含量；提高宿主對(duì)放射線的耐受性等。由于雙歧桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，在大多數(shù)基質(zhì)中生長(zhǎng)緩慢，所以雙歧桿菌的培養(yǎng)和生長(zhǎng)常常需要添加雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子(bifidusfactor)來(lái)促進(jìn)其繁殖和生長(zhǎng)?，F(xiàn)有的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子主要包括以下六類物質(zhì)①純寡聚糖類物質(zhì)..一般是由2-10個(gè)單糖通過糖苷鍵聚合在一起所形成的，如已知的乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、異麥芽糖等二十余種。②蛋白酶解產(chǎn)物及一些蛋白質(zhì)類物質(zhì)，如胃粘膜蛋白酶解產(chǎn)物，其生物活性部分為糖蛋白中的寡糖；酪蛋白酶解物；牛奶中的(x-乳清蛋白和乳鐵蛋白等?！蚨嗵穷愇镔|(zhì)，如云芝多糖的水提物；胡蘿卜中的含氮多糖。短鏈脂肪酸類物質(zhì)，如費(fèi)氏丙酸桿菌產(chǎn)生的丙酸鹽(脂)能刺激和促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖。⑤天然植物及中草藥的提取物，如茶葉中的茶多酚；人參中的人參皂甙及五加科植物的水提物。⑥其他類物質(zhì)，如雙泛酰硫乙胺和泛酰硫氫乙胺等。其中，現(xiàn)有的用作雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的蛋白酶解產(chǎn)物主要有酵母提取物、牛肉浸液和大豆酶解產(chǎn)物?，F(xiàn)有的大豆酶解產(chǎn)物為只采用胰蛋白酶酶解大豆所得的產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種與現(xiàn)有的僅用胰蛋白酶酶解大豆制備雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的方法相比，具有更好的促進(jìn)雙歧桿菌的繁殖和生長(zhǎng)效果的新方法，以及由該方法制得的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。本發(fā)明的方法為在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，更佳的還加入胰蛋白酶，將其與中性蛋白酶共同酶解大豆(Glycinemax(L.)Merrill),即制得本發(fā)明的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。其中，所述的大豆的用量較佳的為7.99-20.00%;所述的水較佳的為去離子水，水的用量較佳的為79.80-92.00%;當(dāng)僅用中性蛋白酶酶解豆?jié){時(shí)，中性蛋白酶的用量較佳的為0.01-0.2%;當(dāng)用中性蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解時(shí)，中性蛋白酶的用量較佳的為0.005-0.1%，胰蛋白酶的用量較佳的為0.005-0.1%;上述百分比皆為占水、大豆和蛋白酶總質(zhì)量的百分比，所述的蛋白酶為中性蛋白酶或中性蛋白酶加胰蛋白酶。其中，對(duì)各原料的要求為本領(lǐng)域常規(guī)要求，如胰蛋白酶的酶活為2000-2500u/mg;中性蛋白酶的酶活為100-130u/mg;大豆中水溶性蛋白230.0%，雜質(zhì)^1.0%，水分^14.0%，子葉變色粒^5.0%;水較佳的為去離子水，去離子水中Na+S0.1%，SiO2<0.05%，pH值二6.5-7.5;百分比為質(zhì)量百分比。其中，所述的酶解按本領(lǐng)域常規(guī)酶解方法操作。優(yōu)選工藝步驟及其條件如下(1)向水和大豆混合磨槳制得的豆?jié){中加入酶進(jìn)行酶解，之后加熱酶解液。所述的豆?jié){可采用市售的豆?jié){或按本領(lǐng)域常規(guī)方法自制。制備方法較佳的為將7.99-20.00%的大豆和自來(lái)水在40-8(TC混合3-10小時(shí)，之后用去離子水沖洗，再加入79.80-92.00%的去離子水混合磨漿，加熱到60-10(TC，維持2-20分鐘，冷卻至42'C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)豆?jié){pH為7.5-8.0。所述的酶解的溫度較佳的為30-60°C，酶解的時(shí)間較佳的為2-10小時(shí)。酶解之后，加熱酶解液的溫度較佳的為60-10(TC，加熱時(shí)間為2-20分鐘。(2)離心取上清液，微孔濾膜抽濾，濃縮，葡聚糖凝膠柱層析，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，濃縮至干即可。所述的離心取上清液的較佳操作為先以3024g的速度離心10-50分鐘，取上清液，之后再以10000-20000g的速度離心10-50分鐘。所述的微孔濾膜的孔徑較佳的為0.45^tm。所述的濃縮可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，較佳的濃縮至蒸發(fā)前體積的1/6-1/5。所述的葡聚糖凝膠較佳的為葡聚糖凝膠SephadexG15。柱層析較佳的條件為濃縮物加入量為1毫升；洗脫液為質(zhì)量百分比為0.01%-0.1%的乙酸銨，洗脫液用量為柱體積的2.5-3.5倍；洗脫液流速為0.4毫升/分鐘。洗脫液以收集波長(zhǎng)為280nm的洗脫液為準(zhǔn)，一般在洗脫7小時(shí)15分鐘至8小時(shí)20分鐘的時(shí)段進(jìn)行收集。本發(fā)明還涉及由上述方法制得的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。該雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子可與益生菌合用，用于酸奶或豆酸奶的發(fā)酵；也可加入豆?jié){或牛奶中，用于促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖，提高雙歧桿菌的濃度，從而有利于雙歧桿菌生物制品的生產(chǎn)。本發(fā)明中所有的原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。其在促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的方面的效果大于僅用胰蛋白酶酶解得到的促進(jìn)因子。該促進(jìn)因子能很好促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)繁殖，提高雙歧桿菌的濃度和活菌數(shù)，活菌數(shù)是未添加此因子的10倍。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。雙歧桿菌丹麥丹尼斯克公司胰蛋白酶國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司中性蛋白酶無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司葡聚糖凝膠型號(hào)為SephadexG15:GEHealthcareBio-sciencesAB公司凝膠柱型號(hào)為1.6X100cm層析柱上海錦華層析設(shè)備廠MRS培養(yǎng)基德國(guó)MerckkGaA公司下述各實(shí)施例中的大豆的水溶性蛋白=30.0%，雜質(zhì)=1.0%，水分=14.0%，子葉變色粒=5.0%;去離子水中Na+=0.1%，SiO2=0.04%，pH值二7.0;百分比為質(zhì)量百分比；實(shí)施例l、3和5中胰蛋白酶的酶活為2000u/mg;中性蛋白酶的酶活為100u/mg;實(shí)施例2、4、68和對(duì)比實(shí)施例中胰蛋白酶的酶活為2500u/mg;中性蛋白酶的酶活130u/mg。下述各實(shí)施例中的百分比皆為質(zhì)量百分比。實(shí)施例1雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆8.00%和自來(lái)水于451:混合8小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水91.99%,磨漿，于65"C水浴加熱18分鐘，冷卻至42'C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆?jié){中添加中性蛋白酶O.OP/。，于35。C酶解8小時(shí)，于70。C水浴加熱18分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為IO分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為15000g，離心時(shí)間為35分鐘;④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.04%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例2雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆'8.00。/。和自來(lái)水于4(TC混合10小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水91.99%，磨漿，于60。C水浴加熱20分鐘，冷卻至42"C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.005%和中性蛋白酶0.005%，于30'C酶解10小時(shí)，于6(TC水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為IO分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為10000g，離心時(shí)間為50分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.01%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量450ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例3雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆9.00。/。和自來(lái)水于8(TC混合3小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水90.96%,磨漿，于10(TC水浴加熱2分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.5;②向步驟①制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.025%和中性蛋白酶0.025%，于6(TC酶解2小時(shí)，于100。C水浴加熱2分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為50分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45nm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/6，得濃縮物；離心力為20000g，離心時(shí)間為10分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0,1%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量630ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。8實(shí)施例4雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆10.00%和自來(lái)水于60"混合4小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水89.95%，磨漿，于95。C水浴加熱4分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.02%和中性蛋白酶0.02%，于43。C酶解8小時(shí)，于95。C水浴加熱9分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為35分鐘；◎?qū)⒉襟E②的上清液離心，取上清液，0.45)im微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為20000g，離心時(shí)間為25分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例5雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆11.1P/。和自來(lái)水于53"C混合5小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水88.83%，磨漿，于90。C水浴加熱5分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.03%和中性蛋白酶0.03%，于42"酶解8小時(shí)，于9(TC水浴加熱10分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為30分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為18000g，離心時(shí)間為30分鐘；④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例6雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆15.00。/。和自來(lái)水于70。C混合4小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水84.88%，磨漿，于80'C水浴加熱12分鐘，冷卻至42"C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.06%和中性蛋白酶0.06%，于44'C酶解7小時(shí)，于85。C水浴加熱15分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為25分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45pm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為15000g，離心時(shí)間為45分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例7雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆20.00%和自來(lái)水于64"混合4.5小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水79.80%，磨漿，于75"C水浴加熱15分鐘，冷卻至42°C,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.1%和中性蛋白酶0.1%，于44。C酶解7小時(shí)，于80。C水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為40分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45nm微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為16000g，離心時(shí)間為40分鐘；④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。實(shí)施例8雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆?jié){將大豆20.00%和自來(lái)水于64°(:混合4.5小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水79.80%，磨漿，于75。C水浴加熱15分鐘，冷卻至42°C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆槳中添加中性蛋白酶0.2n/。，于44'C酶解7小時(shí)，于80'C水浴加熱20分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為40分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45)im微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為16000g，離心時(shí)間為40分鐘；將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.06%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。對(duì)比實(shí)施例僅添加胰蛋白酶的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制造方法①制備豆槳將大豆11.11%和自來(lái)水于53"混合5小時(shí)，用去離子水沖洗，添加去離子水88.83%,磨漿，于9(TC水浴加熱5分鐘，冷卻至42。C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0;②向步驟①制得的豆?jié){中添加胰蛋白酶0.06。/。，于42'C酶解8小時(shí)，于90。C水浴加熱10分鐘，離心，取上清液；離心力為3024g，離心時(shí)間為30分鐘；③將步驟②的上清液離心，取上清液，0.45jiim微孔濾膜抽濾，蒸發(fā)水分至體積為蒸發(fā)前的1/5，得濃縮物；離心力為18000g，離心時(shí)間為30分鐘;④將上述濃縮物1ml用葡聚糖凝膠G15過濾層析，0.05%乙酸銨洗脫，乙酸銨用量540ml;紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，蒸干溶劑，得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。效果實(shí)施例1雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用將實(shí)施例18和對(duì)比實(shí)施例的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子按5%的比例添加至純豆?jié){培養(yǎng)基中，接種雙歧桿菌，與空白樣(指沒有添加過促進(jìn)因子的豆?jié){)在相同條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)雙歧桿菌活菌數(shù)來(lái)考察雙歧桿菌促進(jìn)因子的增殖作用。具體步驟如下-(1)浸泡將干豆洗凈，用50'C左右的溫水浸泡5小時(shí)；(2)磨漿用水沖洗后，進(jìn)行磨漿，得空白樣；(3)向步驟(2)中的空白樣中添加雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子；(4)滅菌90。C熱處理5分鐘；(5)預(yù)熱將步驟(4)得到的豆?jié){在無(wú)菌條件下預(yù)熱至約42。C;(6)接種在無(wú)菌條件下添加用無(wú)菌水溶解的雙歧桿菌菌粉，添加量為0.1g菌粉/100g豆?jié){；(7)發(fā)酵放置于42'C恒溫箱連續(xù)發(fā)酵7小時(shí)；(8)平板計(jì)數(shù)將發(fā)酵好的豆酸奶震蕩均勻，用無(wú)菌水按照10"的梯度進(jìn)行梯度稀釋，使用雙歧桿菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基TPY瓊脂培養(yǎng)基作培養(yǎng)基，通過平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)，與空白樣相比，實(shí)施例18和對(duì)比實(shí)施例的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子增加的雙歧桿菌活菌的倍數(shù)列于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由以上數(shù)據(jù)顯示，本專利所提及的提取物對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。效果實(shí)施例2雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用2將實(shí)施例5的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子按5%的比例添加至MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，接種雙歧桿菌，發(fā)酵培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)雙歧桿菌活菌數(shù)來(lái)考察雙歧桿菌促進(jìn)因子的增殖作用。具體步驟如下(1)接種在無(wú)菌條件下將用無(wú)菌水溶解的雙歧桿菌菌粉添加到MRS培養(yǎng)基中，添加量為O.lg菌粉A00g培養(yǎng)基。MRS是微生物領(lǐng)域里常有的培養(yǎng)基，其MRS分別是MAN,ROGOSA，SHARPE三個(gè)單詞的縮寫；(2)將實(shí)施例5中的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子按5%的比例添加至步驟(1)得到的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；(3)發(fā)酵放置于42"C恒溫箱連續(xù)發(fā)酵7小時(shí)；(8)平板計(jì)數(shù)將發(fā)酵好的培養(yǎng)基，用無(wú)菌水按照10—1的梯度進(jìn)行梯度稀釋使用雙歧桿菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基TPY瓊脂培養(yǎng)基作培養(yǎng)基，通過平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)，雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子增加的雙歧桿菌活菌的倍數(shù)列于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、一種雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制備方法，其特征在于在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。2、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量為0.01-0.2%;所述的百分比為中性蛋白酶質(zhì)量占水、大豆和中性蛋白酶總質(zhì)量的百分比。3、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的酶活為100-130u/mg。4、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在水中進(jìn)行所述的酶解時(shí)還加入胰蛋白酶，將其與中性蛋白酶共同酶解大豆。5、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量為0.005-0.1%;胰蛋白酶的用量為0.005-0.1%;所述的百分比為中性蛋白酶或胰蛋白酶的質(zhì)量占水、大豆、中性蛋白酶和胰蛋白酶總質(zhì)量的百分比。6、如權(quán)利要求1或4所述的制備方法，其特征在于所述的大豆的用量為7.99-20.00%;所述的水的用量為79.80-92.00%;所述的百分比為大豆或水占水、大豆、和蛋白酶總質(zhì)量的百分比，所述的蛋白酶為中性蛋白酶，或中性蛋白酶加胰蛋白酶。7、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的胰蛋白酶的酶活為2000-2500u/mg。8、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于其包含下述步驟(1)向水和大豆混合磨漿制得的豆?jié){中加入酶進(jìn)行酶解，之后加熱酶(2)離心取上清液，微孔濾膜抽濾，濃縮，葡聚糖凝膠柱層析，收集紫外光波長(zhǎng)為280nm的洗脫液，濃縮至干即可。9、如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述的豆?jié){的pH為7.5-8.0;所述的酶解的溫度為30-60°C，酶解的時(shí)間為2-10小時(shí)；酶解之后，所述的加熱酶解液的溫度為60-10(TC，加熱時(shí)間為2-20分鐘；步驟(2)中，所述的離心取上清液的操作為先以3024g的速度離心10-50分鐘，取上清液，之后再以10000-20000g的速度離心10-50分鐘；所述的微孔濾膜的孔徑為0.45所述的濃縮的操作為濃縮至蒸發(fā)前體積的1/6-1/5;所述的葡聚糖凝膠柱為葡聚糖凝膠SephadexG15;柱層析條件為濃縮物加入量為1毫升；洗脫液為質(zhì)量百分比為0.01%-0.1%的乙酸銨，洗脫液用量為柱體積的2.5-3.5倍；洗脫液流速為0.4毫升/分鐘；在洗脫7小時(shí)15分鐘至8小時(shí)20分鐘的時(shí)段進(jìn)行收集。10、用權(quán)利要求19任一項(xiàng)所述的方法制得的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。全文摘要本發(fā)明公開了一種雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制備方法在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子的制備方法制得的雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。本發(fā)明首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。其在促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的方面的效果大于僅用胰蛋白酶酶解得到的促進(jìn)因子。該促進(jìn)因子能很好促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)繁殖，提高雙歧桿菌的濃度和活菌數(shù)，活菌數(shù)是未添加此因子的10倍。文檔編號(hào)C12P21/06GK101643765SQ20081004138公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2008年8月5日優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日發(fā)明者徐成勇,王蔭榆,郭本恒申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司