專利名稱：：一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩査的方法，通過同時檢測分析個體的MTRNR1基因上第1555，1494，1095,961SNP位點基因攜帶型來評估個體對氨基糖苷類藥物性耳聾的易感性，屬于分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：藥物性耳聾是指使用某些藥物所引起的位聽神經(jīng)系統(tǒng)中毒性損害而產(chǎn)生的聽力下降、眩暈甚至全聾。人們對氨基糖苷類抗生素耳毒性機制的研究，己有近半個世紀的歷史，但目前尚無定論。近年比較公認的有兩種觀點，內(nèi)耳代謝障礙與線粒體基因突變。1.內(nèi)耳代謝障礙氨基糖苷類藥物可以直接與耳內(nèi)聽毛細胞的細胞膜的粘多糖類和磷脂類相結(jié)合后破壞了膜的通透性，特別是細胞內(nèi)的線粒體，造成糖代謝和蛋白質(zhì)代謝的紊亂，導致細胞變性與死亡。同時氨基糖苷類藥物減低了多種酶活性，如ATP酶、溶酶體酶和脫氨酶，造成內(nèi)耳生理功能紊亂，細胞內(nèi)粒子環(huán)境紊亂，導致感覺細胞損傷。而血一迷路屏障的存在，造成藥物在內(nèi)耳液和內(nèi)耳組織中的積蓄使內(nèi)耳感覺細胞中毒變性。氨基糖苷類抗生素對離子通道的阻斷是電壓依賴性的，是急性的、可逆的、但當被代謝后便會不可逆地阻斷細胞內(nèi)的信號傳導途徑(PIP2)，導致外毛細胞的死亡。2.線粒體基因突變氨基糖苷類抗生素耳毒性是后天獲得性耳聾最常見的原因，而且聽力損傷顯示了母系遺傳的特點。大量的研究表明不同的個體對該藥物耳毒作用的反應(yīng)有很大的差別，不但大劑量、長時間的用藥可引起耳蝸一前庭損害，病人在短期使用常規(guī)劑量的此類抗生素后即患AAID(aminoglycosideantibioticinduceddeafness,AAID)，甚至小劑量的單次用藥也可造成耳聾。一些學者也報道了AAID的家族聚集現(xiàn)象，這表明某些個體對這類抗生素較高的敏感性具有家族遺傳性，提示存在遺傳易感性。近40年來對這種遺傳易感性深入研究提供了大量證據(jù)。1964年Robinson首先報告了結(jié)核病孕婦經(jīng)氨基糖苷類抗生素鏈酶素治療后引起胎兒的耳聾。Konigsmark等在1976年對大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的具氨基糖苷類耳毒致聾的家族的資料進行了總結(jié)，認為氨基糖苷類抗生素耳毒性的遺傳易感性可能屬于母系遺傳以及伴不完全外顯率的常染色體顯性遺傳的多因素性狀。1988年，Wallen等報道了首例由線粒體DNA(mtDNA)突變引起的人類疾病，明確了mtDNA突變可引起人類疾病，首次提出線粒體病概念。1989年Higashi回顧了有關(guān)文獻后，提出母系遺傳最可能的解釋是線粒體DNA缺陷。1993年P(guān)rezant等報道了三個中國家系，數(shù)個成員在使用氨基糖苷類抗生素后發(fā)生毒性耳聾，三個家系中均證實呈現(xiàn)母系遺傳的線粒體基因mtDNA12SrRNA的1555堿基A—G突變。隨后，非洲、西班牙、日本、蒙古、南美、以色列也有家系報道。在中國、日本、蒙古還有一些散發(fā)病例的報道，這些散發(fā)病例無家族史，都有毒性耳聾和mtDNAA1555G突變。中國學者ZhaoH從中國一個家系中建立了六個人的細胞株(四個有癥狀攜帶C1494T突變和兩個無癥狀攜帶C1494T突變的個體，和四個無關(guān)淋巴細胞系對照)。將細胞株暴露于高濃度的巴龍霉素或新霉素中，在突變的細胞系中觀察到耗氧量速度的顯著下降，因此，數(shù)據(jù)支持在線粒體12SrRNA的A區(qū)域是氨基糖苷類藥物引起耳聾的重要靶點。同時也顯示C1494T突變與氨基糖苷類藥物的毒性相關(guān)。Zhao，L等報道了三個由氨基糖苷引起的聽力損傷和非綜合癥聽力損傷的病例，這三個病例在1095堿基位置都存在T-to-C突變，在364個聽力正常中國人群對照組中不存在T1095C突變。而且，這個突變在意大利由氨基糖苷導致的聽力神經(jīng)損傷的家系中也有驗證。Marianne等在《歐洲人類遺傳學雜志》2007年15巻發(fā)表了采用人mtDNA全基因組芯片對1350個無癥狀感音神經(jīng)性耳聾的法國家族進行分析，其中29個大家族進具有明確的與母系遺傳特點。分析AAID相關(guān)資料表明線粒體12SrRNA基因中除A1555G、C1494T和961insC突變外，delT961、T961G、A827G突變也可造成機體對氨基糖苷類抗生素耳毒性的高度易感性。對母系遺傳性耳聾大家系研究表明，線粒體脫氧核糖核酸12SrRNA基因A1555G基因突變與家族性致聾有關(guān)，目前研究認為，線粒體12SrRNA基因是導致氨基糖苷類抗生素耳毒性高度易感的基因突變熱點位置。12SrRNA的A1555G、C1494T、T1095C,961insC突變與非綜合征型耳聾和氨基糖苷類抗生素導致的藥物性耳聾密切相關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于評估個體對氨基糖苷類抗生素導致的藥物性耳聾易感性的用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩査的方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩査的方法，其特征在于，其方法為-步驟l，用采樣拭在一個被測者口腔中左右兩腮至少需要各上下刮40-60次，以保證采集到足量的細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，共抽提2個樣本，采用電泳凝膠成像法對基因組DNA濃度和純度作檢測，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應(yīng)孔，l個反應(yīng)孔檢測961、1095位點，另一個1個反應(yīng)孔檢測1494、1555位點，每一個反應(yīng)孔分別測2個位點的基因分型采用熒光定量PCR技術(shù)進行擴增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點進行基因型進行確定3-1，反應(yīng)體系配置在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，標準反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng)體系總體積為20ul，其中QPCRMIX即PCR定量試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ngM的DNA模板3W，去離子水11.2ul;檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物正向引物CTCCTCAAAGCAATACACTG反向引物TGCTAAATCCACCTTCGAGC檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物正向引物CGATCAACCTAACCACCTCT反向引物TGGACAACCAGCTATCACCA3-2，PCR反應(yīng)條件將2個反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱95°C15分鐘；再進行35個循環(huán)的95°C、45秒；6(TC、45秒；72°C、60秒；72°C、7分鐘后降溫至4。C;3-3，將2個反應(yīng)孔在PCR擴增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進行電泳檢測a.1%瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNAmarker即DNA標記物6ulc.PCR產(chǎn)物4ul+電泳緩沖液1~:11!1d.電泳電壓120ve.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖7個樣本PCR后產(chǎn)物，25ng/ul的電泳結(jié)果圖，目的條帶800bp左右；7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖為3-4，純化終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0.2USAP+PCR產(chǎn)物純化試劑2.5UEX0N1/7ul;在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH203.825ul、PCR產(chǎn)物純化試劑SAP0.05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EX0N10.125ul、PCR產(chǎn)物3ul;反應(yīng)條件為37°C、60min;80°C、15min;4°C恒溫保存；3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進行測序，引物濃度為1uM，設(shè)備ABI3730測序儀；3-5-1，從-20度冰箱中取出PCR純化產(chǎn)物、測序試劑MIX、測序緩沖液seqbuffer、luM引物，測序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC;3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、MIX用量、PCR反應(yīng)條件；3-5-3，取一塊反應(yīng)板，表上模板名、引物名、日期；3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用兩個反應(yīng)孔，其中一個加入第一組引物，檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物，另一個加入另一組引物，檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物；3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的測序試劑mix3.1、1.4ul的測序緩沖液sequencebuffer、2ul的測序引物luMprimer、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0.lul的去離子水ddH20;體系分裝好后，上離心機，達900轉(zhuǎn)/分即停；3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96°C10秒；再進行25個循環(huán)的96。C、10秒；50°C、5秒；60°C、4分鐘；60°C、4分鐘后降溫至4'C恒溫保存；3-5-7，擴增結(jié)束后，在每孔加入lul125rnM乙二胺四乙酸EDTA;3-5-8，再在每孔加入100%乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉(zhuǎn)/分，4'C離心30分鐘;3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul70。/。乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4'C離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；3-5-11，每孔加入8ul的95。/。甲酰胺，5%ddH20;3-5-12，在ABI3730上進行結(jié)果讀取，用網(wǎng)上免費下載軟件Chromas査閱測序檢測結(jié)果每一個被測者4個位置分別有4個結(jié)果；通過5000-10000個被測者的檢測，歸納出961位置實驗有3種結(jié)果，即正常結(jié)果、T缺失突變結(jié)果和C插入突變結(jié)果；1095位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1494位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1555位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；步驟4，結(jié)果分析每一個被測者的4個位置的結(jié)果得出檢測分析為1，未檢出突變您的檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)攜帶以上位點的突變；2.檢出突變強烈建議您在醫(yī)生指導下禁止使用氨基糖苷類藥物。本發(fā)明對母系線粒體耳聾相關(guān)基因A1555G,C1494T,T1095C，961delT/insC突變進行檢測，相應(yīng)位點特異性引物的設(shè)計以及用于熒光定量PCR檢測的實驗方案、試劑以及報告生成系統(tǒng)，通過同時檢測分析個體的MTRNR1基因上第1555，1494，1095，961SNP位點基因攜帶型來評估個體對氨基糖苷類藥物性耳聾的易感性。采集樣本的類型為口腔粘膜上皮細胞，采用此方法，具有無創(chuàng)、取材便捷、操作簡單的優(yōu)點。采用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA具有所需樣品量少，抽提質(zhì)量穩(wěn)定，抽提產(chǎn)物純度高，操作簡便的特點。利用本發(fā)明對超過100例以上中國人群樣本的撿測結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進行的MTRNRlA1555G等4個位點基因分型檢測檢出率可達99%以上，結(jié)果可重復性達到100°/。。同時，檢測數(shù)據(jù)與報道的中國人群基因頻率基本相符，說明該檢測方法準確可靠。本發(fā)明的優(yōu)點是可用于評估個體對氨基糖苷類抗生素導致的藥物性耳聾易感性。圖1為7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖圖2為961位置實驗正常結(jié)果示意圖；圖3為961位置實驗T缺失突變結(jié)果示意圖；圖4為961位置實驗C插入突變結(jié)果示意圖；圖5為1095位置實驗正常結(jié)果示意圖；圖6為1095位置實驗突變結(jié)果示意圖；圖7為1494位置實驗正常結(jié)果示意圖；圖8為1494位置實驗突變結(jié)果示意圖；圖9為1555位置實驗正常結(jié)果示意圖；圖10為1555位置實驗突變結(jié)果示意圖11為實施例被測者定位在961位置實驗突變結(jié)果示意圖；圖12為實施例被測者檢測報告示意圖。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例受撿者向醫(yī)生或遺傳咨詢?nèi)藛T檢測相關(guān)信息后，填寫和簽署檢測相關(guān)申請單和檢測告知書，如下表細胞分子遺傳學檢測申請單--------------<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>醫(yī)生給受檢者解釋檢測告知書通過與遺傳咨詢專業(yè)人員的交流，我完全理解并贊同以下內(nèi)容1.本檢測將采用測序和多態(tài)分型技術(shù)為我(我孩子)檢測與檢測項目相關(guān)的基因變異情況。2.如果我有需要，遺傳咨詢專業(yè)人員會在檢測后繼續(xù)為我提供相關(guān)的遺傳咨詢。3.未檢測出增加疾病風險的基因變異并不能完全排除其他未發(fā)現(xiàn)的變異或者環(huán)境因素導致疾病的可能性。4.該檢測只是針對特定檢測項目相關(guān)的基因變異情況進行檢測，并不涉及與其他疾病相關(guān)的基因變異情況。5.隨著科學的不斷發(fā)展，與檢測項目相關(guān)的基因變異情況可能會更新。6.在某些家庭中，檢測結(jié)果可能發(fā)現(xiàn)一些非血緣性關(guān)系，如領(lǐng)養(yǎng)關(guān)系等。7.檢測采用的設(shè)備都是目前最先進和可靠的，但是仍不能完全排除未檢出結(jié)果或結(jié)果出錯的極小可能性事件發(fā)生。8.檢測中心將竭盡全力在規(guī)定時間內(nèi)出具檢測結(jié)果，但不對因不可抗力導致的延遲負責。9.我(我孩子)的檢測結(jié)果將交給遺傳咨詢專業(yè)人員并向我解釋相關(guān)檢測結(jié)果。10.如果我(我孩子)的樣本因各種原因?qū)е聼o法獲取足夠的DNA，或者檢測相關(guān)的信息未填寫完整，檢測中心人員可以通過我填寫的聯(lián)系方式與我取得聯(lián)系。11.檢測中心將對我(我孩子)的個人信息和檢測信息進行嚴格的隱私保密。在未經(jīng)授權(quán)情況下，除指定遺傳咨詢專業(yè)人員外，不可將這些信息泄露給任何其他單位和個人。經(jīng)過_(遺傳咨詢專業(yè)人員姓名)的解釋，我已經(jīng)閱讀并理解上述文字，不存在任何誤解和歧義。受檢者簽名條形碼粘貼處；'年月日一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法為步驟1，用采樣拭在被測者口腔中左右兩腮至少需要各上下刮40次，以保證采集到足量的細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，共抽提2個樣本，采用電泳凝膠成像法對基因組DNA濃度和純度作檢測，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應(yīng)孔，l個反應(yīng)孔檢測961、1095位點，另一個1個反應(yīng)孔檢測1494、1555位點，每一個反應(yīng)孔分別測2個位點的基因分型采用熒光定量PCR技術(shù)進行擴增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點進行基因型進行確定3-1，反應(yīng)體系配置在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，標準反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng)體系總體積為20ul，其中QPCRMIX即PCR定量試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ngA4的DNA模板3W，去離子水11.2ul;檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物:正向引物CTCCTCAAAGCAATACACTG反向引物TGCTAAATCCACCTTCGAGC檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物正向引物CGATCAACCTAACCACCTCT反向引物TGGACAACCAGCTATCACCA3-2，PCR反應(yīng)條件將2個反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱95°C15分鐘；再進行35個循環(huán)的95°C、45秒；60°C、45秒；72°C、60秒；72°C、7分鐘后降溫至4。C;3-3，將2個反應(yīng)孔在PCR擴增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進行電泳檢測a.1%瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNAmarker即DNA標記物6ulc.PCR產(chǎn)物4ul+電泳緩沖液1~:1111d.電泳電壓120ve.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖7個樣本PCR后產(chǎn)物，25ng/ul的電泳結(jié)果圖，目的條帶800bp左右；7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖為3-4，純化終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0.2USAP+PCR產(chǎn)物純化試劑2.5UEX0N1/7ul;在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH203.825ul、PCR產(chǎn)物純化試劑SAP0.05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EX0N10.125ul、PCR產(chǎn)物3ul;反應(yīng)條件為37°C、60min;80°C、15min;4°C恒溫保存；3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進行測序，引物濃度為1uM，設(shè)備ABI3730測序儀；3-5-1，從-20度冰箱中取出PCR純化產(chǎn)物、測序試劑MIX、測序緩沖液seqbuffer、luM引物，測序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC;3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、MIX用量、PCR反應(yīng)條件；3-5-3，取一塊反應(yīng)板，表上模板名、引物名、日期；3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用兩個反應(yīng)孔，其中一個加入第一組引物，檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物，另一個加入另一組引物，檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物；3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的測序試劑mix3.1、1.4ul的測序緩沖液sequencebuffer、2ul的測序引物luMprimer、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0.lul的去離子水ddH20;體系分裝好后，上離心機，達900轉(zhuǎn)/分即停；3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96°C10秒；再進行25個循環(huán)的96。C、10秒；50°C、5秒；6CTC、4分鐘；6CTC、4分鐘后降溫至4'C恒溫保存；3-5-7，擴增結(jié)束后，在每孔加入lul125mM乙二胺四乙酸EDTA;3-5-8，再在每孔加入100%乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉(zhuǎn)/分，4。C離心30分鐘;3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul70。/。乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4。C離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；3-5-11，每孔加入8ul的95鬼甲酰胺，5%ddH20;3-5-12，在ABI3730上進行結(jié)果讀取，用網(wǎng)上免費下載軟件Chromas查閱測序被測者的4個位置的結(jié)果，圖11為實施例被測者定位在961位置實驗突變結(jié)果示意通過5000-10000個被測者的檢測，歸納出的4個位置的檢測結(jié)果為961位置實驗有3種結(jié)果，如圖2所示的正常結(jié)果示意圖、如圖3所示的T缺失突變結(jié)果示意圖和如圖4所示的C插入突變結(jié)果示意圖；1095位置實驗有2種結(jié)果，如圖5所示的正常結(jié)果示意圖和如圖6所示的突變結(jié)果示意圖；1494位置實驗有2種結(jié)果，如圖7所示的正常結(jié)果示意圖和如圖8所示的突變結(jié)果示意圖；1555位置實驗有2種結(jié)果，如圖9所示的正常結(jié)果示意圖和如圖10所示的突變結(jié)果示意步驟4，最后得出每一個被測者檢測報告，給出結(jié)果分析，如圖12所示，大量家系研究表明線粒體DNAMTRNR1上的A1555G;C1494T;T1095C;961T缺失/C插入位點與藥毒性耳聾有密切關(guān)系，攜帶這些位點風險基因型的個體其聽細胞對耳毒性藥物特別是氨基糖苷類抗生素的耳毒性具有高度敏感性。兒童由于藥物代謝能力較弱，更易產(chǎn)生聽力損傷。您的961T缺失/C插入位點檢測結(jié)果為DelT突變。強烈建議您在醫(yī)生指導下禁止使用氨基糖苷類藥物。能夠?qū)е露@的病因有很多種，其中藥物中毒所引起的耳聾占60%以上，其中氨基糖苷類抗生素致聾占藥物致耳聾的97%左右。目前的科學研究發(fā)現(xiàn)，以上檢測位點能夠解釋中國人群中20%-25%的氨基糖苷類抗生素致聾現(xiàn)象。權(quán)利要求1.一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法，其特征在于，其方法為步驟1，用采樣拭在一個被測者口腔中左右兩腮至少需要各上下刮40-60次，以保證采集到足量的細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，共抽提2個樣本，采用電泳凝膠成像法對基因組DNA濃度和純度作檢測，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應(yīng)孔，1個反應(yīng)孔檢測961、1095位點，另一個1個反應(yīng)孔檢測1494、1555位點，每一個反應(yīng)孔分別測2個位點的基因分型采用熒光定量PCR技術(shù)進行擴增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點進行基因型進行確定3-1，反應(yīng)體系配置在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，標準反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng)體系總體積為20ul，其中QPCRMIX即PCR定量試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的DNA模板3μl，去離子水11.2ul；檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物正向引物CTCCTCAAAGCAATACACTG反向引物TGCTAAATCCACCTTCGAGC檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物正向引物CGATCAACCTAACCACCTCT反向引物TGGACAACCAGCTATCACCA3-2，PCR反應(yīng)條件將2個反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱95℃15分鐘；再進行35個循環(huán)的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘后降溫至4℃；3-3，將2個反應(yīng)孔在PCR擴增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進行電泳檢測a.1％瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNAmarker即DNA標記物6ulc.PCR產(chǎn)物4ul+電泳緩沖液r1uld.電泳電壓120ve.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖7個樣本PCR后產(chǎn)物，25ng/ul的電泳結(jié)果圖，目的條帶800bp左右；7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖為3-4，純化終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0.2USAP+PCR產(chǎn)物純化試劑2.5UEXON1/7ul；在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH2O3.825ul、PCR產(chǎn)物純化試劑SAP0.05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EXON10.125ul、PCR產(chǎn)物3ul；反應(yīng)條件為37℃、60min；80℃、15min；4℃恒溫保存；3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進行測序，引物濃度為1uM，設(shè)備ABI3730測序儀；3-5-1，從-20度冰箱中取出PCR純化產(chǎn)物、測序試劑MIX、測序緩沖液seqbuffer、1uM引物，測序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC；3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、MIX用量、PCR反應(yīng)條件；3-5-3，取一塊反應(yīng)板，表上模板名、引物名、日期；3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用兩個反應(yīng)孔，其中一個加入第一組引物，檢測961、1095位點的線粒體DNA611-1411正向和反向引物，另一個加入另一組引物，檢測1494、1555位點的線粒體DNA1245-2007正向和反向引物；3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的測序試劑mix3.1、1.4ul的測序緩沖液sequencebuffer、2ul的測序引物1uMprimer、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0.1ul的去離子水ddH2O；體系分裝好后，上離心機，達900轉(zhuǎn)/分即停；3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96℃10秒；再進行25個循環(huán)的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分鐘；60℃、4分鐘后降溫至4℃恒溫保存；3-5-7，擴增結(jié)束后，在每孔加入1ul125mM乙二胺四乙酸EDTA；3-5-8，再在每孔加入100％乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心30分鐘；3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul70％乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板導致離心，達800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；3-5-11，每孔加入8ul的95％甲酰胺，5％ddH2O；3-5-12，在ABI3730上進行結(jié)果讀取，用網(wǎng)上免費下載軟件Chromas查閱測序檢測結(jié)果每一個被測者4個位置分別有4個結(jié)果；通過5000-10000個被測者的檢測，歸納出961位置實驗有3種結(jié)果，即正常結(jié)果、T缺失突變結(jié)果和C插入突變結(jié)果；1095位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1494位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1555位置實驗有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；步驟4，結(jié)果分析根據(jù)每一個被測者的4個位置的結(jié)果，得出檢測分析為1，未檢出突變您的檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)攜帶以上位點的突變；2.檢出突變強烈建議您在醫(yī)生指導下禁止使用氨基糖苷類藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于個體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法，其特征在于，其方法為用采樣拭在一個被測者口腔中左右兩腮至少需要各上下刮40-60次，采集到足量的細胞樣本，進行基因組DNA的抽提，對母系線粒體耳聾相關(guān)基因A1555G，U1494A，T1095C，961delT/insC突變進行檢測，通過同時檢測分析個體的MTRNR1基因上第1555，1494，1095，961SNP位點基因攜帶型來評估個體對氨基糖苷類藥物性耳聾的易感性。本發(fā)明的優(yōu)點是可用于評估個體對氨基糖苷類抗生素導致的藥物性耳聾易感性。文檔編號C12Q1/68GK101560547SQ200810040318公開日2009年10月21日申請日期2008年7月8日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者傅詠南,宋艷絨,邵敏華申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司