專利名稱：一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物病毒，尤其是涉及一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)70年代Tischer等首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(PCV) ， PCV分為PCV1 和PCV2兩種基因型，其中PCV2有致病性，可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合 征(PMWS)，還是育肥豬的豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)的主要病因，并且 與懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫(CT)、增生性和壞死性肺 炎(PNP)的發(fā)生密切相關(guān)。由于該病屬于免疫抑制疾病，可引發(fā)嚴(yán)重的繼發(fā) 感染從而危害豬群健康，是繼豬繁殖呼吸道綜合征之后又一個嚴(yán)重危害全球養(yǎng) 豬業(yè)的重大疾病，在我國規(guī)?；i群中PCV2感染率超過90X。近兩年在國際 上已獲得批準(zhǔn)的豬圓環(huán)病毒疫苗有4個，這些疫苗中有的是通過基因工程技術(shù) 手段研制得到，也有采用常規(guī)病毒培養(yǎng)技術(shù)制備得到，但無論哪種技術(shù)手段均 獲得了嚴(yán)格的國際專利保護，這給研發(fā)新型PCV2疫苗設(shè)置了較高的門檻。在 我國還未有確實有效并經(jīng)過農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的PCV2疫苗。
目前國內(nèi)獸用細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)基本采用大方瓶和滾瓶技術(shù)，這些技術(shù)在規(guī) ?；a(chǎn)細(xì)胞和病毒時勞動強度高、占地大、批間差異大，難于進行標(biāo)準(zhǔn)化生 產(chǎn)的質(zhì)量控制。我國獸用疫苗市場中由于批間差異問題和病毒效價不高引起的 質(zhì)量不穩(wěn)定的問題時有發(fā)生。在細(xì)胞疫苗生產(chǎn)行業(yè)中大規(guī)模生產(chǎn)動物細(xì)胞和病 毒是疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的前提。提高病毒效價和產(chǎn)量，是提升疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的 必由之路。
生物反應(yīng)器技術(shù)高密度發(fā)酵工藝生產(chǎn)細(xì)胞和病毒是1970年代新開發(fā)的技 術(shù)，利用此技術(shù)的連續(xù)培養(yǎng)工藝生產(chǎn)非裂解型病毒(PCV2屬此類病毒)具有 良好的商業(yè)開發(fā)前景，國際上最成功的例子是狂犬病疫苗，采用該技術(shù)可以連 續(xù)收獲病毒30天以上，病毒效價提高5倍，增加病毒產(chǎn)量5倍以上，成本降低50%。利用生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)動物細(xì)胞和病毒基本上可以克服方瓶和滾 瓶技術(shù)的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、節(jié)省人工、可控程度高、病毒 效價和產(chǎn)量高、易于進行標(biāo)準(zhǔn)化控制，是新一代獸用細(xì)胞疫苗生產(chǎn)的必由之路。
目前，國際上采用的技術(shù)得到的PCV2的病毒效價在10"左右，還沒有解 決豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究過程中存在的如何提高病毒產(chǎn)量和病毒效價的難點 問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝合 理、病毒產(chǎn)量和效價高的制備豬圓環(huán)病毒的工藝。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn) 一種制備豬圓環(huán)病毒的工 藝，其特征在于，該方法包括以下步驟
(1) 制備密度為2xl()S個/毫升的PK15細(xì)胞液;
(2) 于7.5升生物反應(yīng)器內(nèi)接種5升細(xì)胞液，微載體濃度為5mg/ml;
(3) 加入細(xì)胞液體積8%的胎牛血清和1%的雙抗，并同步加入10%的豬 圓環(huán)病毒2型(PCV2)種毒；
(4) 于37X:培養(yǎng)48小時，生物反應(yīng)器的參數(shù)為轉(zhuǎn)速50rpm，溶氧量30 60%， 二氧化碳濃度5%， pH值7.2;
(5) 24小時后將生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞用PBS洗滌三次，加入200mM氨 基葡萄糖作用30分鐘；
(6) 棄去氨基葡萄糖，將細(xì)胞用PBS洗滌三次；
(7) 加入細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，生物反應(yīng)器的參數(shù)與步驟(4)中相
同；
(8) 24小時后，采用灌注工藝培養(yǎng)10天，灌注體積為2.5升/天，在生物 反應(yīng)器出口處放置4"C冰箱收集病毒；
(9) 10天后停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒與生物反應(yīng)器內(nèi)的病 毒混合，于-2(TC凍融兩次，凍融過程中不停搖晃，得到豬圓環(huán)病毒。
所述的微載體包括Cytodex 3。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備豬圓環(huán)病毒的工藝通過新型生物反應(yīng)器技術(shù)高密度發(fā)酵工藝生產(chǎn)細(xì)胞和PCV2病毒，提高了 PCV2的病毒效價，從而最 終提高PCV2疫苗免疫原性和研制高效的PCV2疫苗，本發(fā)明具有以下優(yōu)點
(1) 病毒產(chǎn)量高以5L工作體積為例，本發(fā)明灌注培養(yǎng)工藝可以生產(chǎn)病 毒25L，而傳統(tǒng)工藝僅能生產(chǎn)5L病毒；
(2) 操作方便以5L工作體積為例，本發(fā)明灌注培養(yǎng)工藝僅需l人就可 完成全部操作，而傳統(tǒng)工藝需要100個大方瓶或滾瓶最少需要4人才能完成， 隨著工作體積的增加這就優(yōu)勢更加明顯；
(3) 病毒效價高傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的病毒效價僅為104D/ml，而本發(fā)明灌注 培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的病毒效價可以達到105Q/ml;
(4) 操作空間小以5L工作體積為例，本發(fā)明灌注培養(yǎng)工藝僅需3n^的 操作區(qū)域，而傳統(tǒng)工藝需要30m2以上的操作區(qū)域，隨著工作體積的增加這就 優(yōu)勢更加明顯；
(5) 工藝參數(shù)控制精確本發(fā)明采用生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)工藝生產(chǎn)時可 控參數(shù)有溫度、pH值、溶氧量、二氧化碳濃度、轉(zhuǎn)速、載體濃度，可實現(xiàn)在線 監(jiān)測的參數(shù)有葡萄糖、乳酸和銨離子濃度，為實現(xiàn)批次質(zhì)量的穩(wěn)定性奠定了基 礎(chǔ)，而傳統(tǒng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異大。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例1
一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝，該方法包括以下步驟
(1) 制備密度為2xl()S個/毫升的Dulac系PK15細(xì)胞液；
(2) 于7.5升NBS公司的生物反應(yīng)器內(nèi)接種5升細(xì)胞液，微載體Cytodex 3濃度為5mg/ml;
(3) 加入細(xì)胞液體積8%的胎牛血清和1%的雙抗，并同步加入10%的豬 圓環(huán)病毒2型(PCV2)種毒；
(4) 于37。C培養(yǎng)48小時，生物反應(yīng)器的參數(shù)為轉(zhuǎn)速50rpm，溶氧量30 60%， 二氧化碳濃度5%， pH值7.2;
(5) 24小時后將生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞用PBS洗滌三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分鐘；
(6) 棄去氨基葡萄糖，將細(xì)胞用PBS洗滌三次；
(7) 加入細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，生物反應(yīng)器的參數(shù)與步驟(4)中相
同；
(8) 24小時后，采用灌注工藝培養(yǎng)10天，灌注體積為2.5升/天，在生物
反應(yīng)器出口處放置4t:冰箱收集病毒；
(9) 10天后停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒與生物反應(yīng)器內(nèi)的病 毒混合，于-2(TC凍融兩次，凍融過程中不停搖晃，得到豬圓環(huán)病毒。
取樣檢測病毒效價(細(xì)胞培養(yǎng)和PCR結(jié)合法)可達10^/ml細(xì)胞感染量。
權(quán)利要求
1.一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)制備密度為2×105個/毫升的PK15細(xì)胞液；(2)于7.5升生物反應(yīng)器內(nèi)接種5升細(xì)胞液，微載體濃度為5mg/ml；(3)加入細(xì)胞液體積8％的胎牛血清和1％的雙抗，并同步加入10％的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)種毒；(4)于37℃培養(yǎng)48小時，生物反應(yīng)器的參數(shù)為轉(zhuǎn)速50rpm，溶氧量30～60％，二氧化碳濃度5％，pH值7.2；(5)24小時后將生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞用PBS洗滌三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分鐘；(6)棄去氨基葡萄糖，將細(xì)胞用PBS洗滌三次；(7)加入細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，生物反應(yīng)器的參數(shù)與步驟(4)中相同；(8)24小時后，采用灌注工藝培養(yǎng)10天，灌注體積為2.5升/天，在生物反應(yīng)器出口處放置4℃冰箱收集病毒；(9)10天后停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒與生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒混合，于-20℃凍融兩次，凍融過程中不停搖晃，得到豬圓環(huán)病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝，其特征在于，所述 的微載體包括Cytodex3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備豬圓環(huán)病毒的工藝，該方法包括制備PK15細(xì)胞液、采用生物反應(yīng)器技術(shù)與灌注工藝培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有病毒產(chǎn)量高、操作方便、病毒效價高、操作空間小、工藝參數(shù)控制精確等優(yōu)點，可用以最終提高PCV2疫苗免疫原性和研制高效的PCV2疫苗。
文檔編號C12N7/00GK101289655SQ200710172409
公開日2008年10月22日 申請日期2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日
發(fā)明者勇 鄒 申請人:上海佳牧生物制品有限公司