專利名稱：：編碼青霉素結合蛋白的基因和生產(chǎn)l-谷氨酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被廣泛用作調(diào)味品等的原料。
背景技術：
：如果在含有有限量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌(coryneformbacteria),那么該細菌生產(chǎn)顯著量的L-谷氨酸。另一方面，如果在含有過量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌，那么該細菌不產(chǎn)生L-谷氨酸。然而，已知即使在這種條件下，如果向所述培養(yǎng)基中加入表面活性劑或諸如青霉素的生物素活性抑制劑，所述細菌的生長受到抑制，它們也開始生產(chǎn)顯著量的L-谷氨酸。對于通過向培養(yǎng)基中加入青霉素來誘導谷氨酸產(chǎn)生，已經(jīng)研究了《艮多年(T.D.Nimheimer，J.Birnbaum,E.D.Ihnen和A丄.Demasin，j;p/.M/craZ)z'o/.，20,215-217(1970))。人們認為青霉素的作用是引起細胞表層的結構變化，從而提高細胞質(zhì)膜對谷氨酸的通透性。另外，也已經(jīng)研究了有限的生物素量或加入表面活性劑或青霉素通過何種機制影響棒狀桿菌的L-谷氨酸生產(chǎn)能力，已經(jīng)闡明存在被認為參與了L-谷氨酸生產(chǎn)的基因(^yR基因)。而且，已經(jīng)證實，其中ifcR基因被破壞的菌抹即使在下述條件下也產(chǎn)生顯著量的L-谷氨酸，在所述條件中生物素的存在量使得野生菌抹幾乎不生產(chǎn)L-谷氨酸(國際專利/>布W095/23224)。而且，已經(jīng)獲得了許多同細胞質(zhì)膜通透性提高誘導谷氨酸生產(chǎn)的解釋相矛盾的發(fā)現(xiàn)，但仍不了解青霉素誘導谷氨酸產(chǎn)生的機制(E.Kimura,Y.Kawahara和W.Nakamatsu,TanpakusshituKakusanKoso(Protein,NucleicacidandEnzyme),第42巻，2633-2640頁(1997))。另外，眾所周知青霉素結合蛋白(PBP)在細菌細胞分裂中起重要作用。認為所述青霉素結合蛋白是存在于細菌細胞表層的酶，并且它們特異性結合諸如青霉素的p-內(nèi)酰胺類抗生素。盡管它可以根據(jù)物種有所不同，但認為它是通常在大腸桿菌(五.co/Z)中發(fā)現(xiàn)的3-8種蛋白，它們的分子量分布在大約40,000-120,000的范圍內(nèi)。青霉素通過結合所述青霉素結合蛋白活性位點的絲氨酸殘基抑制酶促反應。已經(jīng)闡明了7種存在于大腸軒菌中的青霉素結合蛋白，大腸桿菌尤其是研究的主要目標(B.G.Spratt,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,2999(1975))。其中，已經(jīng)證實稱為PBP2和PBP3的那些蛋白在細胞分裂中起重要作用(B.G.Spratt，J.Bacteriol.，131,293(1977))。然而，還不知道在棒狀桿菌中是否存在青霉素結合蛋白。本發(fā)明的公開本發(fā)明的發(fā)明人研究了在棒狀桿菌中是否也應當存在青霉素結合蛋白(下文簡寫為"PBP"),并分析其功能。結果，本發(fā)明人獲得到了一個被認為用于闡述青霉素在棒狀桿菌中誘導谷氨酸產(chǎn)生的機制的新發(fā)現(xiàn)，同時，他們發(fā)現(xiàn)該發(fā)現(xiàn)可以從仍未知的著眼點用于涉及棒狀桿菌的谷氨酸生產(chǎn)能力提高的研制。以前述發(fā)現(xiàn)為基礎實現(xiàn)本發(fā)明，它涉及生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括以下步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌，以在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)和累積L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中PBP在所述細菌中通常不起作用，且所述細菌具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌是其中在第一溫度PBP通常起作用，而在第二溫度PBP通常不起作用的細菌，所述方法包括在所述細菌增殖的第一溫度培養(yǎng)所述細菌的步驟和在L-谷氨酸產(chǎn)生的第二溫度培養(yǎng)所述細菌的步驟。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌含有包含編碼PBP的基因(PBP基因)和溫度敏感復制控制區(qū)的質(zhì)粒，其中在染色體上的PBP基因不起作用，而所述質(zhì)粒在所述第一溫度可以復制，而在所述第二溫度不能復制，在本發(fā)明的另一個實施方案中，由在所述方法中使用的棒狀桿菌產(chǎn)生的PBP具有溫度敏感型突變。在本發(fā)明的再一個實施方案中，當PBP結合青霉素G時，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示的PBP分子量約為60,000。本發(fā)明的第二方面是編碼在下述(A)或(B)中定義的蛋白的DNA:(A)具有序列表中SEQIDNO:2的氨基財列的蛋白；(B)具有序列表中SEQIDNO:2得氨基酸序列丙具有結合青霉素的活性的蛋白，所述氨基酸序列包括一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插入、添加或翻轉。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，前述DNA是在下述(a)或(b)中定義的DNA:(a)至少包括序列表中SEQEDNO:l的核香酸數(shù)881至2623的核苦酸序列的DNA;(b)在嚴格條件下可與至少包含序列表中SEQIDNO:l的核苷酸數(shù)881至2623的序列的核苷酸序列雜交，并編碼具有結合青霉素的活性的蛋白的DNA。以下將詳細說明本發(fā)明。<1>棒狀桿菌的PBP在本發(fā)明中，棒狀桿菌包括那些到目前為止分類為短桿菌屬(genusBrevibacterium)但先知阿統(tǒng)一為棒狀桿菌屬(genusCorynebacterium)的細菌Int.J.Syst.Bacteriol,255(1981))，并包括屬于與棒狀桿菌屬密切相關的短桿菌屬的細菌以下列出了這些棒狀桿菌的實例，嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(corynebacteriumacetoacidophilum)醋谷棒狀桿菌(corynebacteriumacetoacidophilum)美棒狀桿菌(corynebacteriumacetoacidophilum)谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumacetoacidophilum)谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumlilium(corynebacteriumglutamicum))melassecola棒狀桿菌(corynebacteriummelassecola)谷氨酸棒狀桿菌(brevibacteriumdivaricatum(corynebacteriumglutamicum))黃色短桿菌(brevibacteriumflavum(corynebacteriumglutamicum))immariophilum短桿菌(brevibacteriumimmariophilum)乳發(fā)酵短桿菌(brevibacteriumlactofermentumcorynebacteriumglutamicum))玫瑰色短桿菌(brevibacteriumroseum)解糖短桿菌(brevibacteriumsaccharolyticum)生硫短桿菌(brevibacteriumthiogenitalis)thermoaminogenes棒狀桿菌(corynebacteriumthermoaminogenes)具體地說，以下菌株可以作為實例。嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870、醋谷棒狀桿菌ATCC15806美棒狀桿菌ATCC15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumIilium)ATCC15990melassecola棒狀桿菌ATCC17965谷氨酸棒狀桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)ATCC14020黃色短桿菌ATCC14067immariophilum短桿菌ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240thermoaminogenes棒狀桿菌AJ12340(FERMBP-1539)在本發(fā)明中涉及的PBP是一種存在于上述棒狀桿菌的細胞表層的膜蛋白，如果它與青霉素接觸，那么它以共價鍵與青霉素結合，可以通過例如向棒狀桿菌的膜部分加入標記的青霉素以開始反應，使可溶性的表面活性劑組分在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并目測標記，從而檢測PBP(青霉素結合實驗)。如在下文才是及的實施例中所示，在乳發(fā)酵短桿菌的PBP結合青霉素G的狀態(tài)下，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上檢測到它們于分子量約110kDa、100kDa和60kDa處有三條帶，將它們命名為PBP1、PBP2和PBP3。在研究這些PBP和衍生自青霉素G的氮蕈脒青霉素之間的親和力時，發(fā)現(xiàn)氮萆脒青霉素選擇性J4結合PBP3。而且，發(fā)現(xiàn)當在存在顯著量生物素的條件下培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌時，在一定濃度的氮萆脒青霉素存在下產(chǎn)生L-谷氨酸。這些事實提示，在存在顯著量的生物素時通過抑制PBP的作用，至少是抑制PBP3的作用，可以誘導L-谷氨酸產(chǎn)生。因此，即使存在顯著量的生物素，其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌也應該能夠在不加入生物素活性抑制劑的情況下誘導L-谷氨酸產(chǎn)生。而且，這種其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌應當具有提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力的可能性，此外，通過搡作PBP基因，應該獲得有關棒狀桿菌產(chǎn)生L-谷氨酸的新發(fā)現(xiàn)，可以利用它來從至今還未知的方面進行開發(fā)。在本發(fā)明中，表述"PBP通常不起作用，，意指在顯著量的生物素存在下誘導L-谷氨酸產(chǎn)生的狀態(tài)。它可以是一種因為抑制PBP基因的轉錄或翻譯而不產(chǎn)生PBP的狀態(tài)，或者是一種因為在產(chǎn)生的PBP時發(fā)生了突變而降低或消除了PBP作用的狀態(tài)，<2〉其中PBP通常不起作用的棒^1大桿菌用于按照本發(fā)明生產(chǎn)L-谷氬酸的方法的棒狀桿菌是其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌，在一個《尤選的實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌是其中在第一培養(yǎng)條件下PBP通常起作用，而在第二培養(yǎng)條件下PBP通常不起作用的細菌。這種棒狀桿菌可以在所述第一培養(yǎng)條件下增殖，而在所述第二培養(yǎng)條件下在顯著量的生物素存在時可以產(chǎn)生L-谷氨酸。至于PBP,優(yōu)選PBP3。關于上述的培養(yǎng)條件，可提及培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的滲透壓、pH、培養(yǎng)基的組分等等。培養(yǎng)基組分的實例包括諸如IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苦)和乙酸的誘導劑，以及諸如葡萄糖的抑制劑。所述培養(yǎng)溫度將在下文描述中作為培養(yǎng)條件的實例進行說明，然而，關于其它培養(yǎng)條件，在以下描述中的術語"溫度"可以由表示另一條件的術語代替。作為其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌的實例，可以提及一種突變抹，在該菌抹中將突變引入到編碼PBP的基因(PBP基因)中，以使通常起作用的PBP不被表達。上述突變可以是抑制PBP基因轉錄或翻譯的突變，或者是產(chǎn)生通常不起作用的PBP的突變。因為引起PBP完全缺乏的突變對所述細茵應當是致死性的，所以上述突變抹可以作為諸如溫度敏感突變抹的條件突變抹獲得。通過例如利用紫外線照射或用化學試劑處理棒狀桿菌，獲得可以在第一溫度(例如低溫)增殖，但在第二溫度(例如高溫)不能增殖的突變抹，并從獲得的突變抹中選擇可以在第一溫度增殖，并當在第二溫度培養(yǎng)它時，在顯著量的生物素存在下可以產(chǎn)生L-谷氨酸的突變抹，從而可以得到所述突變抹。作為具有這種特性的突變抹，可以選才奪DTSR蛋白缺陷菌抹(國際專利公布W095/23224)或oc-KGDH缺陷菌抹(國際專利公開W095/34672)。然而，如果侯選菌抹是具有涉及PBP的突變的突變抹，那么可以通過對在所述第二溫度培養(yǎng)的細胞進行上述的青霉素結合實驗進行證實。如果一旦獲得這種突變抹，可以將該突變抹用作宿主克隆棒狀桿菌的PBP基因。即可以通過用包含得自棒狀桿菌的染色體DNA的質(zhì)粒轉化其中PBP通常不起作用的突變抹，選擇其中PBP.通常起作用的轉化抹并收集所述質(zhì)粒，從而獲得包含PBP基因的DNA片段.在本領域那些技術人員熟知的參考文獻(例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)等)中描述了用于通常的基因重組的技術，諸如那些用于DNA的消化和連接、轉化、由轉化體中提取重組DNA、集落雜交等技術。例如可以如下生產(chǎn)染色體DNA文庫。首先，用Miura等人的方法(H.Saito和K.Miura,Biochem.Biophys.Acta，72,619(1963))或類似的方法制備染色體DNA。然后，用合適的限制酶部分消化所述染色體DNA,以獲得各種片段的混合物，如果所述消化的程度通過調(diào)節(jié)消化反應時間等控制，那么可以^使用的限制酶范圍很廣。例如，于30。C或更高的溫度(優(yōu)選37'C或更高的溫度)，通過讓S做3AI以l-10單位/ml的酶濃度作用于染色體DNA不同的時間長度(l分鐘至2小時)，來消化所述染色體DNA。接著，將消化的染色體DNA片段連接到在大腸桿菌細胞可自主復制的載體DNA,以產(chǎn)生重組DNA。更具體地說，讓與用于消化染色體DNA的限制酶Sau3AI產(chǎn)生相同末端核苷酸序列的限制酶(例如SawHI),于30。C或更高的溫度，以1-100單位/ml的酶濃度，作用于所述載體DNA1小時或更長時間(最好1-3小時)，以完全消化所述載體并切斷它，然后，將染色體DNA片段的混合物和如上所述獲得的切斷的載體DNA混合，并讓DNA連接酶(優(yōu)選T4DNA連接酶)于4-16。C的溫度，以1-100單位/ml的酶濃度，作用于所述混合物1小時或更長時間(最好6-24小時)，以獲《尋重組DNA?？稍诖竽c桿菌細胞中自主復制的載體最好是在宿主細胞中自主復制的質(zhì)粒栽體，其實例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。而且，如果將具有使質(zhì)粒在才奉狀桿菌(它可以由例如pAM330(參見曰本專利公開(Kokai)第58-67699號)、pHM1519(參見日本專利公開第58-77895號)、pCGl(參見日本專利公開第57-134500號)、pCG2(參見曰本專利公開第58-35197號)、pCG4(參見日本專利公開第57-183799號)、pCGll(參見日本專利公開第57-183799號)等制備)中自主復制的能力的DNA片段插入到上述載體中，那么它們可以用作在大腸桿菌和棒狀桿菌中都自主復制的所謂的穿梭載體。這種穿梭載體的實例包括下文提及的那些栽體，下文也列出了帶有各種載體的微生物，其在國際保藏單位的保藏號分別列于圓括號中。pAJ655:大腸桿菌AJ11882(FERMBP-136)谷氨酸才奉狀桿菌SR8201(ATCC39135)pAJ1844:大腸桿菌AJ11883(FERMBP-137)谷氨Si豐奉狀桿菌SR8202(ATCC39136)pAJ611:大腸桿菌AJ11884(FERMBP-138)pAJ3148:谷氨酸+奉狀桿菌SR8203(ATCC39137)pAJ440:枯草桿菌AJ11901(FERMBP-140)例如通過使用獲得的重組DNA轉化大腸桿菌K-12菌抹，以制備染色體DNA文庫，該轉化可以利用D.M.Morrison的方法(MethodsinEnzymology,6S,326,1979)進4亍，該方法包括用氯化鉤處理受體細胞，以增加其對DNA(M.Mandel和A.Higa,J.Mol,53，159(1970))等的通透性。然后，用獲得的染色體DNA文庫轉化其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌的突變抹。作為轉化豐奉狀桿菌的方法，有上文提及的使用氯化鉤處理細胞的方法，或包括讓處于它們能夠吸收DNA的特殊生長階段的細胞吸收DNA的方法(由C.H.Duncan等人報導用于枯草桿菌(5acz7/ww&z7&))。除了這些，還可以使用的方法是使DNA受體細胞成為可以輕易吸收重組DNA的棵細胞或原生質(zhì)球，接著將所述重組DNA引入到所述細胞中，已知該方法可用于枯草桿菌、放線菌和酵母(S.Chang等，Mo/ec.Ge"《/(5S,111(1979);Bibb等，Atowe,27《398(1978);A.Hinnen等，Prac.A^/.^SL4,75,1929(1978))。除了這些以外，在曰本專利公開第2-207791號中也公開了用于轉化棒狀桿菌的方法。通過在未轉化的突變抹(宿主)不能生長的條件下平板接種轉化的突變抹，并選擇已形成菌落的菌抹，可以獲得引入PBP基因的轉化菌抹。例如使用P.Guerry等的方法(J.5a"en'o/.，1064(1973》、D.BClewell的方法(/Sac&n'o/.，//《667(1972))或類似的方法由獲得的轉化體中分離重組DNA,可以得到含有PBP基因的DNA片段。使用編碼已知的微生物的PBP(例如大腸桿菌的PBP)的基因，或者使用基于其核苷S臾序列產(chǎn)生的寡核香酸，通過雜交可能也可以獲得用包含PBP基因的重組DNA轉化的棒狀桿菌。除了誘變處理外，使用如上所述獲得的PBP基因可以產(chǎn)生其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌。通過用包含PBP基因的DNA轉化棒狀桿菌，所述PBP基因用內(nèi)部缺失修飾以便不產(chǎn)生通常起作用的PBP(缺失型PBP基因)，并在缺失型PBP基因和染色體上的PBP基因之間進行重組，可以破壞在染色體上的PBP基因。已經(jīng)確立了這種利用同源重組的基因破壞，并有使用線性DNA、含有溫度敏感復制控制區(qū)的質(zhì)粒等的方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選^f吏用含有溫度敏感復制控制區(qū)的質(zhì)粒的方法?？梢杂萌笔蚉BP基因如下置換在宿主染色體上的PBP基因，即首先通過插入溫度敏感復制控制區(qū)、突變PBP基因和抗諸如氯霉素的藥物的標記基因，制備重組DNA,用所述重組DNA轉化棒狀桿菌，此外，在溫度敏感復制控制區(qū)不起作用的溫度培養(yǎng)產(chǎn)生的轉化菌抹，接著可以在含有所述藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉化菌抹，以獲得其中重組DNA摻入到染色體DNA中的轉化體菌抹。在這種其中重組DNA摻入到染色體DNA中的菌抹中，突變PBP基因與最初存在于染色體上的PBP基因重組，將染色體PBP基因和缺失型PBP基因的兩個融合基因插入到所述染色體中，以便使重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感復制控制區(qū)和藥物抗性標記)存在于所述兩個融合基因之間，因此，所述轉化體表達PBP,因為正常的PBP基因在此狀態(tài)下是占優(yōu)勢的，所述它可以生長。然后，為了僅去掉在染色體DNA上的缺失型PBP基因，通過重組兩個PBP基因從染色體DNA中消除一個PBP基因的拷貝和所述載體區(qū)ll(包括所述溫度敏感復制控制區(qū)和所述藥物抗性標記)。在此情況下，在染色體DNA上留下正常的PBP基因，而缺失型PBP基因從染色體DNA上切除，或與此相反，在染色體DNA上留下缺失型PBP基因，而正常的PBP基因從DNA上切除。在這兩種情況下，當細胞在溫度敏感復制控制區(qū)可以起作用的溫度培養(yǎng)時，切除的DNA可以在細胞中作為質(zhì)粒保留。接著，在溫度敏感復制控制區(qū)不能起作用的溫度培養(yǎng)所述細胞。在該培養(yǎng)中，當在染色體DNA上留下缺失型PBP基因時細胞不能增殖，因為包含正常PBP基因的質(zhì)粒從細胞中丟失(drop)。另一方面，當在染色體DNA上留下正常PBP基因時，細胞可以增殖。因此，通過選擇在溫度敏感復制控制區(qū)起作用的溫度可以增殖，但在溫度敏感復制控制區(qū)不起作用的溫度不能增殖的菌抹，可以獲得其中染色體DNA上的PBP基因被破壞，而質(zhì)粒上帶有正常PBP基因的菌抹。當在溫度敏感復制控制區(qū)起作用的溫度(例如低溫)培養(yǎng)如上所述獲得的具有破壞的PBP基因的菌抹時，該菌抹在細胞中保留了PBP基因，而當在溫度敏感復制控制區(qū)不起作用的溫度(例如高溫)培養(yǎng)該菌抹時，它丟失了PBP基因。在以下的描述中，溫度敏感質(zhì)粒不能復制的溫度是指高溫。然而，不想排除所述溫度是低溫的可能性，如果獲得的溫度敏感復制控制區(qū)在低溫時不能復制但在高溫時可以復制，那么也可以使用它。在染色體DNA上的PBP基因被破壞，正常的PBP基因摻入到質(zhì)粒中之后被制成recA-的菌抹最好用作在本發(fā)明中使用的微生物，因為在這種菌抹中，防止了在培養(yǎng)過程中質(zhì)粒上的PBP基因在低溫下?lián)饺氲饺旧w中，并因此保證所述基因的丟失。通過在棒狀桿菌細胞中進行質(zhì)粒的自主復制并得到對誘變處理的藥物抗性，用所述質(zhì)粒轉化棒4大桿菌，并由在包含所述藥物的培養(yǎng)基中于低溫下可以生長但在高溫下不能生長的轉化體中提取質(zhì)粒，可以獲得所述溫度敏感復制控制區(qū)。至于誘變質(zhì)粒的方法，可以提及利用羥胺于體外處理質(zhì)粒的方法(G.O.Humpherys等，M/ec."5,101掘(1976)等),本文使用的術語"低溫"和"高溫"為相關的概念，低溫和高溫之間的界限沒有特別限定，所述"低溫"是指一個溫度范圍，當在此范圍內(nèi)培養(yǎng)棒狀桿菌時它們至少可以增殖。所述"高溫"是指一個溫度，在此溫度下棒狀桿菌本身不會死亡。在含有藥物的培養(yǎng)基中于不同的溫度培養(yǎng)帶有溫度敏感質(zhì)粒的轉化體，以確定下限溫度，在此溫度以上所述轉化體不能生長，可以以此確定所述低溫和所述高溫之間的界限。在棒狀桿菌細胞中具有起作用的溫度敏感復制控制區(qū)的質(zhì)粒的實例包括pHS4、pHS22和pHS23。質(zhì)粒pHSC4也可以作為溫度敏感質(zhì)粒用于本發(fā)明，該質(zhì)粒通過將由pHS4切除的并含有來自棒狀桿菌的復制控制區(qū)的DNA片段連接到大腸桿菌載體pHSG398獲得。pHSC4在棒狀桿菌和大腸桿菌中自主增殖，并賦予宿主氯霉素抗性。帶有pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11曰保藏在國立生命科學和人體技術研究所，工業(yè)科學和技術代理處，國際貿(mào)易和工業(yè)部，獲得的保藏號為FERMP-11763。然后，根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1991年8月26日轉移到國際保藏單位，獲得的保藏號為FERMBP-3524,這些溫度敏感質(zhì)粒在棒狀桿菌細胞中在大約10-32'C可以自主增殖，但它們在大約34'C或更高的溫度下不能自主增殖。通過例如用萬awHI和消化上述pHSC4，可以獲得具有溫度敏感復制控制區(qū)的DNA片段。在曰本專利公布(kokoku)第7-108228號中公開了上述質(zhì)粒的結構和包含其溫度敏感復制控制區(qū)的區(qū)的核苷酸序列。也已知在大腸桿菌中一些青霉素結合蛋白基因形成基因簇，并且murE基因和PBP3基因(ftsI)互相緊密定位(F.Ishino,NipponNogeikagaku,Kaishi,第63巻，第ll期，1755-1764(1989))。因此，通過用包含得自棒狀桿菌的染色體DNA的質(zhì)粒轉化作為宿主的已經(jīng)由棒狀桿菌獲得的murE溫度敏感突變體，以獲得在所述宿主不能生長的溫度能夠生長的轉化體菌抹，從而可以得到與murE基因一起的PBP基因。本發(fā)明的發(fā)明人如在下文提及的實施例中所述成功獲得了基于此原理的PBP基因。此外，因為本發(fā)明闡明了PBP基因和側翼區(qū)的核苷酸列，所以通過制備基于所述序列的引物和利用棒狀桿菌染色體DNA作為模板進行PCR(聚合酶鏈式反應；參見T.J.White等，TrendsGenet,5,185(1989)),可以容易地獲得PBP基因。含有在以后提及的實施例中獲得的PBP基因的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:l所示。在此核苷酸序列中存在三個開放讀框(ORF)(核苷酸數(shù)881-2623,2790-4454和4467-5345)。由所述ORF編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:2-4。當在現(xiàn)有蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索顯示與這些氨基酸序列同源的序列時，發(fā)現(xiàn)由第一個ORF編碼的氨基酸序列顯示與大腸桿菌的PBP3基因(ftsl)編碼的氨基酸序列在氨基酸水平上大約31%同源。由第二個ORF和第三個ORF編碼的氨基酸序列顯示分別與大腸桿菌的murE基因和murF基因編碼的氨基murF列同源，這些結果表明第一個ORF是對應于大腸桿菌的ftsI的PBP基因，本發(fā)明的PBP基因可以編碼一個或幾個置換、缺失、插入、添加或翻轉的氨基酸，只要用于結合青霉素的編碼蛋白的活性不被降解。由本文使用的術語"幾個"代表的數(shù)字可以根據(jù)在蛋白質(zhì)三維結構中的定位和氨基酸殘基的種類有所變化，這是緣于以下事實，即在氨基酸中諸如異亮氨酸和纈氨酸的類似的氨基酸和在這些氨基酸中的差異基本上不影響蛋白質(zhì)的三維結構，因此，所述編碼蛋白可以是具有相對于構成所述蛋白的完整氨基酸序列30-40%同源或更高，優(yōu)選55-65%同源或更高，并具有結合青霉素的活性的蛋白。通過用例如定點誘變修飾所述核脊酸序列，以使特定位點的氨基酸殘基應包括置換、缺失、插入、添加或翻轉，由此可以獲得這種編碼與如上所述的青霉素結合蛋白基本相同的蛋白的DNA。以上提及的這種修飾的DNA也可以通過已知的誘變處理獲得。所述誘變處理的實例包括用羥胺等體外處理編碼青霉素結合蛋白的DNA、利用紫外線照射或利用用于通常誘變處理的誘變劑(諸如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸)處理具有編碼青霉素結合蛋白的DNA的微生物(例如大腸桿菌)。上述的核苷酸的置換、缺失、插入、添加或翻轉也包括由于個體差異、具有青霉素結合蛋白的纟敬生物的物種或屬的差異而天然產(chǎn)生的突變(突變體或變種)，通過在合適的細胞中表達具有如上所述的這種突變的DNA,并檢測表達產(chǎn)物的青霉素結合活性，可以獲得編碼同青霉素結合蛋白基本相同的蛋白的DNA。通過由編碼具有突變的青霉素結合蛋白的DNA中或由具有該DNA的細胞中分離在嚴格條件下可與具有例如序列表中SEQIDNO:l的核苷酸數(shù)881至2623的核苦酸序列、并編碼具有青霉素結合活性的蛋白的DNA雜交的DNA,也可以獲得編碼與青霉素結合蛋白基本相同的蛋白的DNA。本文提到的"嚴格條件"是一種條件，在此條件下形成所謂的特異性雜交，而不形成非特異性雜交。難以用數(shù)值清楚表達此條件。但是，所述嚴格條件例如包括以下條件，在此條件下兩個具有高同源性的DNA(例如同源性不小于50。/。的兩個DNA)互相雜交，而兩個具有低于上述的同源性的DNA互相不雜交。另一方面，用以下條件，即60。C、lxsSC、0.1%SDS,優(yōu)選O.lxSSC、0.1%SDS,舉例說明所述嚴格條件，在該條件下在相當于DNA雜交中一般洗滌條件的鹽濃度下，兩個DNA互相雜交。產(chǎn)生的終止密碼子的基因和那些由于活性中心的突變而不具有活性的基因。然而，通過將所述基因與市售的活性表達載體連接，并檢測青霉素結合活性，可以很容易除去這類突變基因。<3>生產(chǎn)L-谷氨酸通過培養(yǎng)如上所述的這樣一種其中PBP通常不起作用且在液體培養(yǎng)基中具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌，以在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，可以生產(chǎn)L-谷氨酸，按照本發(fā)明的方法，在含有顯著量的生物素(如糖蜜)而不加入生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中可以生產(chǎn)L-谷氨酸。當使用的棒狀桿菌是其中PBP在第一溫度通常起作用，而在第二溫度通常不起作用的細菌時，在第一溫度培養(yǎng)所述細菌，以讓其增殖，然后將溫度轉換到第二溫度培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-谷氨酸。具體而言，所述溫度轉換例如可以通過在低溫下進行種子培養(yǎng)，并在高溫下在主培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(主培養(yǎng))實現(xiàn)。在預培養(yǎng)或主培養(yǎng)過程中也可以轉換溫度，不能明顯區(qū)分細胞增殖的步驟和質(zhì)粒丟失的步驟，質(zhì)粒丟失的步驟伴隨有細胞增殖。關于溫度轉換的時間，通過進行溫度轉換的不同培養(yǎng)時間段的初步實驗，可以容易地確定在低溫下的培養(yǎng)時間段，通常，該培養(yǎng)可以持續(xù)至在對數(shù)生長階段達到所需的細胞濃度，然后可以將溫度轉換到在該溫度下所述質(zhì)粒不能復制的水平，用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基沒有特別限制，可以使用通常的含有碳源、氮源和無機離子以及根據(jù)需要的有機痕量營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。具體來說，在本發(fā)明中可以使用含有顯著量生物素的培養(yǎng)基。至于所述碳源，可以使用諸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉的水解產(chǎn)物的糖類；諸如乙醇和肌醇的醇類；諸如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸的有機酸等。至于所述氮源，可以使用諸如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨的無機銨鹽，諸如大豆水解產(chǎn)物、氨氣、氨水的有機氮等。至于所述無機離子或其來源，可以加入少量的磷酸鉀、石克酸鎂、鐵離子、錳離子等。至于痕量有才兒營養(yǎng)物，理想的是根據(jù)需要加入適量的諸如維生素B1和酵母提取物等的所需物質(zhì)。所述培養(yǎng)最好在有氧條件下進行16至72小時，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度控制在20-45℃，pH控制在5-8.5。至于調(diào)節(jié)pH,可以使用無機或有機酸性或堿性物質(zhì)、氨氣等。通常可以通過使用已知技術的組合，諸如使用離子交換樹脂、沉淀方法等的技術，從所述培養(yǎng)物收集L-谷氨酸。附圖簡述圖l是一幅曲線圖，顯示了氮萆脒青霉素對PBP3和青霉素G結合的抑制。箭頭指示最小抑制濃度，實施本發(fā)明的最佳方式以下將說明本發(fā)明的實施例。實施例1:檢測棒狀桿菌的PBP根據(jù)前述的Spratt等的方法進行棒狀桿菌的PBP的檢測，具體如下。<1〉制備膜部分PBP被認為是一種膜蛋白。如下制備棒狀桿菌的膜部分.將棒狀桿菌的野生菌抹乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌抹接種到20ml的A培養(yǎng)基(在1升水中含有10克聚蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl和5克葡萄糖)中，于30'C振蕩培養(yǎng)，并在660nm的吸收達到約1.0時收獲。在50mM的磷酸鈉緩沖液pH7.0中清洗細胞。然后，將玻璃珠加入到該緩沖液中并超聲處理破碎細胞。通過離心除去破碎碎片后，將所述緩沖液于100,000xg超速離心30分鐘，收集膜部分。用相同的緩沖液清洗獲得的部分，將最后懸浮于500pl相同緩沖液中的部分用作所述膜部分。通過使用蛋白定量試劑盒(由P正RCE生產(chǎn)，MicroBCA蛋白檢測試劑盒)測定此膜部分的蛋白濃度，實測值為4mg/ml。<2〉青霉素結合反應將3μl的14C-青霉素G(由Amersham生產(chǎn))加入到體積為30μl的所制備的膜部分中，并使其于30'C反應10分鐘。然后，加入2μl15%的十二烷基肌氨酸鈉(N-月桂酰肌氨酸鈉)和45mg/ml青霉素G,置于室溫20分鐘。然后，于20。C以13,000rpm離心所述部分30分鐘，得到可溶性部分。對此部分的樣品進行SDS-PAGE(使用含有10%聚丙烯酰胺的凝膠)，混合凝膠，干燥并用FujiPhotoFilmCo.，Ltd生產(chǎn)的圖象分析儀BAS2000分析。結果在110kDa、100kDa和60kDa檢測到三條帶，分別命名為PBP1、PBP2和PBP3。<3〉使用PBP結合抑制劑進行分析研究衍生自青霉素G的氮萆脒青霉素和PBP之間的親和性。通過在前述青霉素結合反應之前加入不同濃度的氮萆脒青霉素，并檢測對與同位素("C)標記的青霉素G結合的抑制程度，由此研究所述衍生物和PBP之間的親和性。結果，加入氮萆脒青霉素只抑制了PBP3與標記的青霉素G的結合。即闡明氮萆脒青霉素選才奪性地結合PBP3(圖1),實施例2:加入氮蕈脒青霉素誘導棒狀桿菌生產(chǎn)谷氨酸將乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌抹接種到前述的A培養(yǎng)基中，于30'C振蕩培養(yǎng)2小時，然后加入O.OljiM至100iiiM的氮萆脒青霉素，再振蕩培養(yǎng)8小時。然后，{吏用BiotechAnalyzerAS210(由AsahiChemicalIndustryCo.，Ltd.生產(chǎn))檢測所述培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度(表1)。表1<table><row><column>加入的氮萆脒青霉素濃度(uM)</column><column>L-谷氨酸濃度(mg/L)</column></row><row><column>0</column><column>0</column></row><row><column>0.1</column><column>0</column></row><row><column>1.0</column><column>0</column></row><row><column>10</column><column>0</column></row><row><column>100</column><column>575</column></row><table>因為在加入氮革脒青霉素誘導L-谷氨酸生產(chǎn)的條件下只有PBP3結合氮萆脒青霉素，所以證明至少是由抑制PBP3的作用促成了由加入青霉素或氮萆脒青霉素誘導的谷氨酸生產(chǎn)。實施例3:克隆乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的PBP基因(l)制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA在10mlL培養(yǎng)基(l。/。聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5gNaCl、0.1%葡萄糖，pH7.2)中過夜培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌株，并收獲。用50mMTris-HCl、50mMEDTA緩沖液(pH8.0)清洗細胞,并在800fil相同緩沖液中懸浮。向上述細胞懸浮液中加入40fil的50ml/ml溶菌酶溶液和20)li1的10mg/mlRNA酶溶液，于37'C溫育該混合物1小時，向混合物中加入20的20%SDS溶液，并于70'C溫育1小時。然后，向混合物中加入24的20mg/ml蛋白酶K溶液，于50。C溫育1小時，再加入24jil的蛋白酶K溶液，并溫育1小時。向如上所述獲得的細胞裂解液中加入等量的苯酚并攪拌。將所述裂解液置于4℃過夜，然后離心收集水層。用苯酚/氯仿提取水層2小時，并用氯仿/異戊醇提取30分鐘。通過在攪拌預定的一段時間后，對其離心以收集水層，留下裂解物，從而進行提取。通過乙醇沉淀由獲得的提取物中收集DNA。在300的TE緩沖液(IOmMTris-HC1、lmMEDTA,pH8.0)中溶解DNA沉淀。(2)制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA文庫用限制酶HindIII(TakaraShuzo)消化如上所述獲得的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA和高拷貝數(shù)的大腸桿菌載體pHSG398(TakaraShuzo)。以合適的量混合這兩種DNA,并使用TakaraDNA連接試劑盒2型(TakaraShuzo)連接，以構建乳發(fā)酵短桿茵ATCC13869的染色體DNA文庫.(3)選擇PBP基因克隆用如上所述獲得的乳發(fā)酵短4f菌ATCC13869的染色體DNA文庫轉化大腸桿菌的murE突變抹TLK1l(murE溫度敏感型突變，J.Bacteriol.,1972,110:41-46),并亍42'C在含有20昭/ml氯霉素的L瓊脂培養(yǎng)基(含有1.5%瓊脂的L培養(yǎng)基)上培養(yǎng)過夜，將形成的菌落接種到L液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，從獲得的細胞收集質(zhì)粒。結果在該質(zhì)粒中克隆了約5.3kb的HindlII片段，該質(zhì)粒命名為pHSGH-H。(4)測定克隆的DNA片段的核苷酸序列使用具有7-脫氮-2-脫氧鳥苷三磷酸的Thermo測序酶熒光標記引物循環(huán)測序試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)對前述的克隆片段進行雙脫氧反應，并使用DNA測序儀DSQ-1000L(Shimadzu)測定所述核苷酸序列。測定的核苷酸序列示于SEQIDNO:l。實施例4:構建PBP基因被破壞的乳發(fā)酵短桿菌菌抹使用在日本專利公開第5-7491號中公開的溫度敏感質(zhì)粒經(jīng)過同源重組，產(chǎn)生在染色體上具有破壞的PBP基因的乳發(fā)酵短桿菌。使用pHSGH-H作為模板，使用具有SEQIDNO:5和6所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，進行PCR,以擴增PBP基因片段。SEQIDNO:5所示的引物含有對應于SEQIDNO:l所示核苷酸序列的核苷酸數(shù)31-50的序列，SEQIDNO:6所示的引物含有對應于SEQIDNO:l所示核苷酸序列的核香酸數(shù)2991-3014的序列，而它們每個在5'末端序列中都具有EcoRI識別序列。使用市售PCR儀器(由TakaraShuzo等生產(chǎn)的DNA熱循環(huán)儀，型號PJ2000)和TaqDNA聚合酶(TakaraShuzo),按照廠商的方法進行所述PCR反應。用EcoRI處理獲得的擴增片段，并將其插入到pHSG299(由TakaraShuzo生產(chǎn))的EcoRI位點，產(chǎn)生pHSGE。另外用BamHI和Kpnl消化棒狀桿菌的溫度敏感質(zhì)粒pHSC4，獲得含有復制控制區(qū)的基因片IL使用由TakaraShuzo生產(chǎn)的平端試劑盒平端化獲得的片段，并使用Xbal接頭(由TakaraShuzo生產(chǎn))將其插入到pHSGE的Xbal位點，產(chǎn)生pHSGX。然后，用BamHI和Kpnl消化pHSGX,用由TakaraShuzo生產(chǎn)的平端試劑盒平端化，并使用TakaraDNA連接試劑盒2型(TakaraShuzo)使其產(chǎn)生自連接.獲得的質(zhì)粒pHSGXABK具有內(nèi)部缺失的PBP基因，使用如上所述獲得的用于PBP基因置換的質(zhì)粒pHSGXABK,利用雙重組技術進行缺失型PBP基因和在乳發(fā)酵短桿菌染色體DNA上的PBP基因之間的基因置換，具體而言，如下完成所述置換。通過電脈沖法(參見日本專利公布第2-207791號)，用pHSGXABK轉化乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869。于25'C在M-CM2G液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)轉化體6小時，并將其接種到含有25嗎/ml卡那霉素的M-CM2G培養(yǎng)基上.獲得于34'C形成菌落的菌抹.在獲得的菌抹中，將缺失型PBP基因與原來存在于染色體上的PBP基因重組，將染色體PBP基因和缺失型PBP基因的兩個融合基因插入到染色體中，這樣在兩個融合基因之間應當存在所述重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感復制控制區(qū)和藥物抗性標記)。因此，所述轉化體菌抹在高溫下可以生長，因為正常的PBP基因在此狀態(tài)下是占優(yōu)勢的。然后，于25。C培養(yǎng)所述轉化體菌抹，由在25'C可以生長但在34。C不能生長的菌抹中選擇其中染色體上的PBP基因用缺失型基因置換的菌株，并命名為AP3/p3菌抹。在所述AP3/p3菌抹中，在染色體DNA上留下缺失型PBP基因，而含有正常PBP基因的質(zhì)粒存在于細胞中。通過測定缺失區(qū)之后留下的連接區(qū)的核香酸序列，證實染色體上的PBP基因是否由缺失型置換。工業(yè)適用性按照本發(fā)明，提供棒狀桿菌的編碼青霉素結合蛋白的基因(PBP基因)。使用具有所述基因的棒狀桿菌(其中染色體上的PBP基因被破壞)，在存在顯箸量的生物素而不加入生物素活性抑制劑的情況下可以生產(chǎn)L-谷氨酸。序列表<110>AjinomotoCo.,Inc.<120>編碼青霉素結合蛋白的基因和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法<130>0P843-PCT<141>1999年3月5日<150>JP10-55608<151>1998年3月6曰<160>6<170>Patentln,版本2.0<210>1<211>5347<212>DNA<213>乳發(fā)酵短桿菌<220><221>CDS<222>(881)..(2623)<220><223>CDS<224>(2790)..(4454)<220>—<225>CDS<226>(4467)..(5345)<400>1aagcttcggggaggggcgcgtcgataagcacgcaacctcgtcgtgacatggcgccgaaa60ggaacaacccgggccctggtgaaccctggcgtgcagcaacgcgtaattgatgcagcaca120agctgggctctcagcaggttatgtcggtgcgtggtcgccgcgttgaacaaaacgtgctg180gSltCC8Lgctg'tctgtgctggtggttatcctgctgtgcgttggtgttggcg240cgaccatgggtctgtccggiacgtctacacagcagactttccagttgcaggaacttcagg300caactgaacggatttgagcagtctctcaaccgagatgtggaagatgctc360gctcagcagcaaccttggcacggagatgggcttggtatccccagtggaac420ctggcgtgctcgcagtgcaggeia^cggtg2Ltgttgtggaggagcgcgaacmtccaga480gacacgccctatagttgacatcaatggacaacagacccgaccaatcgggcatcaagcaa540ccctgacgagactaacgcatactgaaaacctccaggcgattccacaagaagcagcagctc600cgccgtatcagaccaacactgttccttatgctgcaaccaccggacaagcaggtggcgcag660<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage25</formula>ccaaacggcgcgattggtgaaaacateateggtcgaateageatggac1519ProAsnGlyAlalieGlyGluAsnlielieGlyArglieSerMetAsp200205210ggcgaaggccagttcggctttgaggettecaacgattecctgttggca1567GlyGluGlyGinPheGlyPheGluAlaSerAsnAspSerLeuLeuAla215220225ggaaacaacggtcgcteaacccaggacatgtecattttgggacaagca1615GlyAsnAsnGlyArgSerThrGinAspMetSerlieLeuGlyGinAla230235240245ateccgggcacgUgagggatcaaattccagccattgatggtgccage1663lieProGlyThrLeuArgAspGinlieProAlalieAspGlyAlaSer250255260gttgaaetcaccgttgatctggatctgcaaacctatgtgcagcaggca1711ValGluLeuThrValAspLeuAspLeuGinThrTyrValGinGinAla265270275ttggagcaggcgaaagetaactecggtgcagaaaacgcctecgetgtg1759LeuGluGinAlaLysAlaAsnSerGlyAlaGiuAsnAlaSerAlaVaA280285290gttcttgatgccgagaccgetgaggttttggcgatggcaaacaccgat1807ValLeuAspAlaGluThrAlaGluValLeuAiaMetAlaAsnThrAsp295300305;accateaaccccaacgaagacacgggaaagcagattgagcagggcaagt855ThrlieAsnProAsnGluAspThrGlyLysGinlieGluGinGlyLys310315320325ageUtgacaatccttctgtcacccaccccttcgagcctggttctgtal903SerPheAspAsnProSerValThrHisProPheGluProGlySerVal330335340gccaaggtgattactgcagcaggcgtaattcaagacggcttgactact1951AlaLysVallieThrAlaAlaGlyVallieGinAspGlyLeuThrThr345350355ccagatgaagtgttgcaggtaccgggcagtattgaaatggccggtgtt1999ProAspGluValLeuGinValProGlySerlieGluMetAlaGlyVal360365370tctgtcggtgatgcgtgggaccacggtgtcgttccctataccactgca2047SerVal(UyAspMaTrpAspHisGlyValValProTyrThrThrAla375380385ggaatttttggtaagtectcgaatgUggcactctgatgcttgcgcac2095GlyliePheGlyLysSerSerAsnValGlyThrLeuMetLeuAlaHis390395400405ggtcttggtgaagataaaUtgetgattacctggaacgaUcggtgtg2143GlyLeuGlyGluAspLysPheAlaAspTyrLeuGluArgPheGlyVal410415420ggacagteaacgggtattgagcttccgagegaateccaaggcctgctg2191GlyGinSerThrGiylieGluLeuProSerGluSerGinGlyLeuLeu425430435cccgcacgtgagcagtggtctggcggtacttttgetaacctgcccateProAlaArgGluGinTrpSerGlyGlyThrPheAlaAsnLeuP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