專利名稱：：重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組病毒轉(zhuǎn)移載體，尤其涉及一種重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：E3區(qū)是腺病毒體外復(fù)制的非必需區(qū)，在E3區(qū)插入外源基因不影響病毒的生長特性，常被用于克隆外源基因的區(qū)域。人與動物腺病毒中，除羊腺病毒外(Vrati等，1995)E3區(qū)都位于腺病毒基因組L4區(qū)的pVIII蛋白基因和L5區(qū)纖維蛋白基因之間，但各種腺病毒基因組大小不同，其E3區(qū)的起始位點(diǎn)也有差別。E完整的腺病毒E3區(qū)含有912個(gè)開放閱讀框架(ORF)，其中7個(gè)編碼產(chǎn)物已在感染細(xì)胞中確定，分別為E3—12.5K、E3—6.7K、E3一gpl9K、E3—11.6K、E3—10.4k、E3—14.5K、E3—14.7K。除了E3—12.5K(Dimitriove"厶1997;Tollefsone"厶1996)。CAV-1和CAV-2的E3區(qū)結(jié)構(gòu)均為部分缺失，CAV-1的E3區(qū)比CAV-2少約500bp。CAV-2的E3區(qū)編碼13.3kDa和40.7kDa的兩個(gè)蛋白，但具體功能尚不清楚，其兩側(cè)分別為PVIII蛋白基因和纖維蛋白基因，二者所編碼的蛋白均與病毒的毒力密切相關(guān)，是構(gòu)建E3區(qū)缺失載體不可缺少的部分。腺病毒基因組含有早期轉(zhuǎn)錄基因(El-E4)和晚期轉(zhuǎn)錄基因(LI-L5)，E1-E4區(qū)與病毒復(fù)制、病毒代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。El、E3和E4上游區(qū)都是外源基因主要的插入部位。El區(qū)缺失的腺病毒雖然可使外源基因高效表達(dá)，但它是復(fù)制缺陷型的，不能在人和動物體內(nèi)生長和繁殖，是在構(gòu)建基因治療性表達(dá)載體時(shí)最常用的外源基因插入部位。E4上游區(qū)存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄沉默區(qū)，在該區(qū)域插入外源基因不影響病毒的復(fù)制，但插入的容量受到限制。E3區(qū)是腺病毒的體外復(fù)制非必需區(qū)，在E3區(qū)(或缺失部分E3區(qū)序列)插入外源基因構(gòu)建的腺病毒載體為非依賴，可Si制性載體，這種載體在體內(nèi)各器宮及細(xì)胞中能自主復(fù)制和表達(dá)外源苯因，被廣泛應(yīng)用r蛋rr持性研究、診斷抗原和亞單位疫苗及重組活載體疫苗的制備。重組腺病毒載體疫苗作為一種新型疫苗，在各種人和動物病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病的免疫預(yù)防中進(jìn)行了大量的研究。目前在人病毒病的重組腺病毒載體疫苗研究中，已進(jìn)行研究的病原主要有人/猿免疫缺陷病病毒(H咖an/Simiani誦unodeficiencyvirus，HIV/SIV)、狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)，丙型肝炎病毒(泡pa&'&'sCw'r"s，HCV)、乙型肝炎病毒(H印atitisBvirus，HBV)、SARS冠狀病毒(SARS-coronavirus)、麻疹病毒(j/譜7esW潛)(Putze"厶2003)、登革病毒(Denguevirus)、巨細(xì)胞瘤病毒(Cytomegalovirus,CMV)(Shanleyeta厶2005)、EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)、埃博拉病毒(Ebolavirus)等，重組腺病毒均可有效的表達(dá)上述病毒的抗原基因，在實(shí)驗(yàn)動物和非人靈長類動物體進(jìn)行的免疫試驗(yàn)表明，可以刺激產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，其中HIV重組腺病毒載體疫苗已在人體進(jìn)行了免疫試驗(yàn)(Robinson"a厶2002)。在利用重組腺病毒表達(dá)人瘧原蟲(malaria)CS抗原蛋白進(jìn)行免疫研究中證明，其免疫效果甚至比放射孢子體的免疫效果還要好(Bruna-Romero"s厶2004)。在動物疫病的腺病毒活載體疫苗的研究中HAd5型復(fù)制缺陷型的腺病毒載體是最常應(yīng)用的。用表達(dá)偽狂犬病毒gD糖蛋白的重組痘病毒和重組腺病毒載體疫苗進(jìn)行對比試驗(yàn)，證明腺病毒在刺激特異性抗體應(yīng)答和免疫保護(hù)方面要好于痘病毒(Gonin"si，1996)，并且可以多途徑進(jìn)行免疫，說明人腺病毒HAd5具有較廣泛的細(xì)胞嗜性。而CAV-2的基本結(jié)構(gòu)與人腺病毒相類似，具有人腺病毒的優(yōu)點(diǎn)。且CAV-2只能感染犬，導(dǎo)致呼吸道疾病和腹瀉，對人類及其它動物不具感染性和致病性，作為活病毒載體研制雙價(jià)或多價(jià)疫苗有著明顯的優(yōu)勢。從理論上講，重組腺病毒核衣殼DNA的容量只有野生型腺病毒DNA的105%，即基因組大小為31323bp的CAV-2容納外源基因的最火限度僅為1560bp左右。在腺病毒早期研究中，人們發(fā)現(xiàn)腺病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件僅在病毒基因組兩端，即反向末端重復(fù)序列和包裝信號所在，加起來長度不到1kb。這部分順式作用元件稱為病毒的最基本結(jié)構(gòu)，除此之外的病^基閃組都可以被置換，其功能可用異位作用來補(bǔ)fg。腺病毒載體的構(gòu)建策略通常為通過缺失基因組的部分區(qū)域而擴(kuò)大禎入外源某因容量，E3區(qū)是腺病毒的基因組中最大的復(fù)制非必需區(qū)，因此在E3區(qū)(或缺失部分E3區(qū)序列)插入外源基因構(gòu)建非依賴型可復(fù)制性重組活載體具有重大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。插入E3區(qū)的外源基因的轉(zhuǎn)錄受E3啟動子或腺病毒MLP控制，一般不需要再加基因表達(dá)調(diào)控元件，且插入的外源基因與E3區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄同向，即從左向右才能高效表達(dá)。Johnson等(1988)在E3區(qū)構(gòu)建了SV40啟動子控制下的HSVgB蛋白表達(dá)載體，在人源細(xì)胞系上感染重組病毒后1260h都能表達(dá)gB。轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)gB基因直接受MLP和E3啟動子控制，而SV40啟動子被作為內(nèi)含子，在RNA加工時(shí)被剪切掉。Zakhartchouk等(1998)構(gòu)建了缺失完整E3區(qū)的BAV3病毒，將不含外源性啟動子的全長或截短的朋V-l糖蛋白gD基因插入BAV3.E3d的E3區(qū)，并使之與E3區(qū)同向，感染MDBK細(xì)胞后24h，用SDS-PAGE開始檢測到gD的表達(dá)，且在感染MDBK細(xì)胞過程中一直持續(xù)表達(dá)。而在感染細(xì)胞中加入DNA合成抑制劑(AraC)時(shí)，gD的表達(dá)降低，說明gD的表達(dá)部分由病毒MLP和E3啟動子控制。與上述研究結(jié)果不同的是，Reddy等(2002)[ps}首次將無任何調(diào)控序列的GFP基因分別插入PAV3不缺失E3區(qū)的SacI和Snagl位點(diǎn)，并使之與E3轉(zhuǎn)錄方向一致，但僅能得到GFP基因插入SnagI位點(diǎn)的病毒，這說明SacI位點(diǎn)所處的E30RF可能是病毒復(fù)制所需的。將無轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的PRVgD基因引入E3區(qū)缺失595bp的PAV3缺失E3區(qū)突變株后檢測到，gD的表達(dá)是一過性的，僅在感染后12h時(shí)能檢測到，說明該區(qū)域的表達(dá)是暫時(shí)調(diào)控的。Rasmussen等認(rèn)為CAV-2如果完全缺失El和E3區(qū)，理論上可插入5.8kb的外源DNA片段，但E3可缺失的最大極限還不十分清楚(1990)，F(xiàn)ischer等(2002)分別缺失了CAV-2E3區(qū)684bp和1263bp，所構(gòu)建的載體均能使外源基因獲得表達(dá)。邱微等(2003)構(gòu)建了缺失E3區(qū)1370bp表達(dá)載體，但外源基因的表達(dá)需要有外源啟動子存在。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體，該重組犬2型腺病渴轉(zhuǎn)移載體能夠?qū)⑷?型腺病毒E3區(qū)最大限度的缺失，從而可以插入和表達(dá)大片段的外源基因。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的-一種重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體，該重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體缺失了E3基因從24954bp到26360bp之間的片段，并且在所缺失的E3區(qū)片段位置插入hCMVIE啟動子、多克隆位點(diǎn)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)和SV40早期轉(zhuǎn)錄PolyA信號。作為一種最優(yōu)選的方案，本發(fā)明所述的重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體PUC-AE3-EGFP，其全基因序列為SEQIDN0:1所示。本發(fā)明重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體對E3區(qū)進(jìn)行了最大限度的缺失，即缺失了1412bp的E3區(qū)片段，使CAV-2E3區(qū)的容量增加到將近3kb，為了保證外源基因的有效表達(dá)，本發(fā)明載體在E3區(qū)啟動子的下游同向加入了hCMVIE啟動子，使外源基因同時(shí)受到兩個(gè)啟動子的控制。用本發(fā)明重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染CAV-2親本毒株感染的MDCK細(xì)胞，細(xì)胞病變后收取的病毒液經(jīng)傳代仍能觀察到綠色熒光，證明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體與親本CAV-2發(fā)生了同源重組。通過蝕斑篩選獲得了遺傳穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的單一純化重組病毒克隆株rCAV-2AE3-EGFP，重組病毒rCAV-2AE3-EGFP，其微生物保藏號是CGMCCNO.2109，分類命名是表達(dá)EGFP缺失E3區(qū)的重組犬2型腺病毒(CanineAdeno-virusTypeII);保藏時(shí)間是2007年7月13日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明對所獲得的重組病毒克隆株rCAV-2AE3-EGFP的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，經(jīng)鑒定該重組病毒生物學(xué)特性穩(wěn)定，建立了表達(dá)外源基因的E3缺失重組CAV-2病毒表達(dá)系統(tǒng)及其克隆純化方法，為進(jìn)一歩開展CAV-2活載體疫苗研制及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了技術(shù)平臺。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體PUC-AE3-EGFP的方法。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種構(gòu)建匕述重組犬2型腺病4轉(zhuǎn)移載體PUC-AE3-EGFP的方法，包(1)制備含有犬2型腺病毒E3區(qū)及其側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pMD-E3;(2)以質(zhì)粒pMD-E3為模板，以SEQIDN0:2和SEQIDN0:3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到犬2型腺病毒上游同源重組臂基因；以質(zhì)粒pMD-E3為模板，以SEQIDN0:4和SEQIDNO:5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到犬2型腺病毒下游同源重組臂基因；(3)擴(kuò)增后得到的犬2型腺病毒下游同源重組臂基因經(jīng)《w71和歷V^III雙酶切與同樣處理的PUC18質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)，得到質(zhì)粒puc-x;將所擴(kuò)增得到上游同源重組臂基因與rac-x質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行EcoRI和KpnI雙酶切，將二者連接后缺失了兩同源重組臂之間的E3區(qū)序列，得到質(zhì)粒PUC-AE3;(4)以pEGFP-Nl載體為模板，以SEQIDN0:6和SEQIDN0:6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與PUC-AE3質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行SpeI酶切后相連接，即得。對于E3區(qū)的缺失，本發(fā)明也采用了新的方法，現(xiàn)有技術(shù)中，一般需要通過多步PCR進(jìn)行序列突變、酶切、連接用以缺失E3區(qū)。而本發(fā)明通過在所選擇的上、下游同源重組臂靠近缺失區(qū)域的一端引入相同的酶切位點(diǎn)，通過這兩個(gè)片段之間的連接缺失掉了中間的E3區(qū)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法極大的減少了工作量。為了篩選有外源基因插入的重組病毒，人們發(fā)展了與外源基因同時(shí)插入篩選標(biāo)記基因的方法，常見的有抗生素基因、可提供病毒蝕斑顏色的報(bào)告基因等。報(bào)告基因的應(yīng)用，大大減少了篩選病毒的工作量，但其中的報(bào)告基因又給重組疫苗的應(yīng)用帶來許多弊端，如攜帶抗生素基因的重組病毒免疫動物很可能會使動物機(jī)體產(chǎn)生抗藥性；用攜帶大腸桿菌lacZ基因的重組病毒免疫動物也可能由于lacZ基因的表達(dá)而干擾重組病毒的免疫效果因?yàn)樵谧匀唤缰械慕^大多數(shù)動物體內(nèi)都有抗大腸桿菌的免疫。EGFP報(bào)告基因近年來被廣泛用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究(Gedesetal1996;Tsienetal1998)，表達(dá)的EGFP在紫外光激發(fā)下能發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡便可直接觀察到，方便檢測。另外EGFP可作為融合蛋白顯示目的蛋白的表達(dá)而不影響F1的蛋白的性質(zhì)，對細(xì)胞也沒有毒性作用(Liuetal，1999)。CAV-2的E3區(qū)只有1521bp，盡管我們作了最大限度的缺失，但其包裝容量仍然有限，而源自質(zhì)粒pEGFP-Nl的EGFP只有780bp，加上hCMVIE啟動子、MCS和SV40poly-A信號僅翻bp，這也是本發(fā)明選用EGFP作報(bào)告基因的主要原因。本發(fā)明將質(zhì)粒pEGFP-Nl中所包括的各種表達(dá)元件按照與E3區(qū)轉(zhuǎn)錄相同的方向一并亞克隆至E3區(qū)缺失處，簡化了載體構(gòu)建的過程。本發(fā)明成功構(gòu)建了E3區(qū)缺失的重組CAV-2轉(zhuǎn)移載體并獲得了純化的含有EGFP報(bào)告基因的重組CAV-2毒株，對其克隆純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)鑒定該重組病毒生物學(xué)特性穩(wěn)定，為進(jìn)一步開展CAV-2活載體疫苗研制及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了技術(shù)平臺。圖1CAV-2的E3區(qū)及其側(cè)翼序列的擴(kuò)增。圖2質(zhì)粒pEGFP-Nl的物理圖譜。圖3本發(fā)明重組轉(zhuǎn)移載體PUC-AE3-EGFP的構(gòu)建示意圖。圖4上、下游同源重組臂序列的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；1.水對照；2.DL15000Marker;3.上游同源重組臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果；4.下游同源重組臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖5含有hCMVIE、MCS、EGFP和SV40polyA信號的pEGFP-Nl部分片段的擴(kuò)增；1.水對照；2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.DL2000Marker。圖6PUC-X的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.A^/I消化結(jié)果；3.歷/7din消化結(jié)果。圖7PUC-AE3的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.價(jià)fldIII消化結(jié)果；3.消化結(jié)果。圖8HindIII酶切篩選正向重組質(zhì)粒；l.外源表達(dá)元件反向插入；2.外源表達(dá)元件正向插入；3.DL15000Marker。圖9pUC-AE3-EGFP轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞24h后觀察到的瞬時(shí)表達(dá)(100X);A.EGFP在MDCK中的瞬時(shí)表達(dá);B.MDCK細(xì)胞對照。圖10rCAV-2AE3-E(;FP在MDCK細(xì)胞上形成的蝕斑。圖11熒光顯微鏡下觀察到的r(AV-2AE3-EGFP在MDCK細(xì)胞h形成的蝕斑(100X)圖12重組病毒rCAV-2AE3-EGFP的純化(100X);A.EGFP在純化后rCAV-2AE3-EGFP中的表達(dá)；B.MDCK對照。圖13rCAV-2AE3-EGFP的PCR鑒定；1.引物EGFP-S/EGFP-X鑒定親本CAV-2;2.DL2000Marker;3.引物EGFP-S/EGFP-X鑒定rCAV-2AE3-EGFP;4.引物AE3-S/AE3-X鑒定rCAV-2AE3-EGFP;5.引物AE3-S/AE3-X鑒定CAV-2圖14rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細(xì)胞上形成的細(xì)胞病變；l.rCAV-2AE3-EGFP形成的細(xì)胞病變；2.正常的MDCK細(xì)胞；3.親本CAV-2形成的細(xì)胞病變。圖15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的腺病毒樣顆粒。圖16rCAV-2AE3-EGFP的MDCK細(xì)胞生長曲線圖。圖17第1-15代rCAV-2AE3-EGFP的PCR鑒定；Al，B2，C5.引物AE3-S/AE3-X擴(kuò)增rCAV-2AE3-EGFP;A2，Bl，C3.引物AE3-S/AE3-X擴(kuò)增CAV-2;A3，B3,C4.DL15000Marker;A4，B4，B2.引物EGFP-S/EGFP-X擴(kuò)增rCAV-2AE3-EGFP;A5，B5，C1.引物EGFP-S/EGFP-X擴(kuò)增CAV-2。圖18EGFP在rCAV-2AE3-EGFP中表達(dá)的穩(wěn)定性檢測(100X)。圖19試驗(yàn)犬接種親本/重組病毒后病理變化的比較(40X)22。圖20CDVF基因的擴(kuò)增；A:1.Fl基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.DL2000Marker;3.陰性對照。B:1.F2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陰性對照；3.DL2000Marker。圖21CDVH基因的擴(kuò)增；1.H基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.DL2000Marker;3.陰性對照。圖22pUC-AE3-F的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.A^II酶切結(jié)果(7550bp);3.5^ni/AWI酶切結(jié)果(5546bp+2004bp)。圖23pUC-AE3-H的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.勘7I1酶切結(jié)果(7430bp);3.^^n/7fofl酶切結(jié)果(5592bp+1838bp)。圖24rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H在MDCK細(xì)胞上形成的細(xì)胞病變(100X);A.rCAV-2AE3-F在MDCK上形成的CPE;B.rCAV-H在MDCK上形成的CPE:C.CAV-2在MDCKl.形成的CPE;D.正常的MDCK細(xì)胞。圖25重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H的PCR鑒定；1.引物rF-U/rF-L擴(kuò)增rCAV-2AE3-F的結(jié)果；2.引物EGFP-S/EGFP-X擴(kuò)增rCAV-2AE3-F的結(jié)果；3.DL2000Marker;4.引物rH-U/rH-L擴(kuò)增rCAV-2AE3-H的結(jié)果；5.引物EGFP-S/EGFP-X擴(kuò)增rCAV-2AE3-H的結(jié)果。圖26重組病毒在MDCK細(xì)胞上的間接免疫熒光(100X);A.rCAV-2△E3-F;B.rCAV-2AE3-H;C.MDCK細(xì)胞。圖27rCAV-2AE3-F的Westernblot分析；1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.rCAV-2AE3-F接種的MDCK細(xì)胞;3,CAV-2接種的MDCK細(xì)胞。圖28rCAV-2AE3-H的Westernblot分析；1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.rCAV-2AE3-H接種的MDCK細(xì)胞；3.CAV-2接種的MDCK細(xì)胞。具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。這里想要指出的是，下面的具體實(shí)施方式僅用來說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可以根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識對本發(fā)明進(jìn)行相應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1重組質(zhì)粒pMD-E3的構(gòu)建1材料與方法細(xì)胞、病毒和菌種MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10。/。胎牛血清的DMEM;CAV-2疫苗株由哈爾濱獸醫(yī)研究所經(jīng)濟(jì)動物研究室提供(說明本發(fā)明所用至IJCAV-2疫苗株也可按照下述義獻(xiàn)所公開的方法分離得到李六金等，犬腺病毒H型弱毒疫但株的分離、鑒定與篩選.肯?？萍?，2000年，6月，第7巻，增刊)，在MDCK細(xì)胞卜.增殖;受體菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑PrimeSTARHSDNA聚合酶，rTaqDNA聚合酶、pMD18-Tvector，dNTP，IPTG，X-Gal均購自TaKaRa公司。DMEM購自GIBCO—BRL公司，胎牛血清購自天津?yàn)笊锕尽Ｄz回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)購自上海華舜生物工程有限公司，其它試劑為進(jìn)口或國內(nèi)分析純產(chǎn)品。1.3病毒擴(kuò)增以O(shè).25%胰蛋白酶+0.02。/。EDTA常規(guī)方法消化MDCK細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM37。C靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層后，換成含2y。胎牛血清的DMEM維持液，并按培養(yǎng)液量的P/o接入CAV-2種毒，培養(yǎng)至80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收取細(xì)胞及維持液，將其反復(fù)凍融3次后，-7(TC凍存?zhèn)溆谩?.4引物參照GenBank中犬2型腺病毒TorontoA26/61株的全基因序列，利用01igo6.0設(shè)計(jì)一對引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于基因組2435828152位，包括了E3區(qū)及其上游的pVffl基因和下游的部分fiber基因在內(nèi)的側(cè)翼序列。引物序列如下CAV-2U5，TTTGTCAGGACAACCACCAGACAAGGCAC3，CAV-2L5'GTTTTAAACAGGGTACCTCCGCTTAGTCT3'1.5病毒基因組的提取用SDS-蛋白酶K裂解法提取病毒DNA。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物12000rpm離心5分鐘，吸取上清液437.于1.5inlEP管中，然后加入20mg/nil的蛋白酶K12.5W，10%SDS5(M(蛋f:i酶K使用濃度為500化7ml，SDS使用濃度為1%)，輕輕混勻，55°C30min水浴后分別用等體枳的酚/氯仿和氯仿各抽提一次，上層水相用1/10體積的3MNaAC(pH5.2)、2倍體積的冷乙醇沉淀，-20。C放置lh，4°C12000r/min離心15min，上清用75%乙醇洗滌，沉淀干燥后用適量TE重懸，-20。C保存。1.6目的基因的擴(kuò)增.以上述提取的CAV-2基因組為模板，擴(kuò)增E3區(qū)及其側(cè)翼序列。50ul反應(yīng)體系依次加入5倍PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10ul、PrimeSTARHSDNAPolymerase1.25U、CAV-2U+CAV-2L(10mM)2ul、dNTP(各2.5raM)4u1、模板1u1。同時(shí)設(shè)立MDCK細(xì)胞腦A和無DNA水對照。循環(huán)參數(shù)為95。C預(yù)熱2min，98°C10S，68°C4min，30個(gè)循環(huán)，72。C延伸20min。反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中加入0.5u1r7agDNA聚合酶和0.5u12.5mM的d-ATP，72。C延伸30min，取5ulPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取CAV-2基因組DNA，用特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的目的片段與預(yù)期大小一致(圖1)。1.7與pMD18-T的連接PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用華舜小量膠回收試劑盒回收目的片段與pMD18-T載體連接。反應(yīng)體系為TargetDNA4.5ul;pMD18-TVector0.5ul;2XligationBuffer5ul，16°C連接lh。1.8火腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備用TSS(TransformationandStorageSolution)法制備E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。以無菌接種環(huán)取凍存的E.coHDH5a菌種劃線接種于不加抗生尜LB瓊脂平板匕問時(shí)在含有抗性的培養(yǎng)基上劃線作對照，37t:過夜培養(yǎng)。次日挑取生長fe好的單個(gè)菌落，于含3mLLB培養(yǎng)^的試管中37°C振搖過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)物按1:100接種于200mLLB培養(yǎng)基中37。C振搖培養(yǎng)約3h，至對數(shù)生長期。將培養(yǎng)物無菌分裝于50mL離心管中，1000g4°C離心lOmin棄上清，沉淀用原始培養(yǎng)體積10%的冰預(yù)冷的無菌1XTSS溶液(配制方法見附錄)重懸，輕輕混勻(冰上操作)。用1.5mL離心管分裝感受態(tài)細(xì)胞，100叱/管，-70匸保存?zhèn)溆谩?.9轉(zhuǎn)化取10"1連接產(chǎn)物加入100ii1自制的DH-5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30rain，42。C熱休克90秒后立即置于冰浴中2min,然后加入800u1S0C液體培養(yǎng)基，于37。C振蕩培養(yǎng)45min。取100yl培養(yǎng)物涂布于含有IPTG、X-gal和Amp+的LB瓊脂板上，37"C培養(yǎng)過夜。1.10堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA挑取生長于LB培養(yǎng)基平板上的數(shù)個(gè)白色菌落，接種于裝有35mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37'C振搖過夜培養(yǎng)。取1.5mL培養(yǎng)物于1.5raLEP管中，腦Or/min離心lmin倒扣于吸水紙上待液體流盡，加入鮮L溶液I，徹底重懸；緩緩加入200叱新配制的溶液n，輕輕顛倒混勻35次，冰上放置不超過5min;加入150叱溶液ni，溫和顛倒混勻，冰上放置5min，12000r/min離心5min;取上清用等體積的飽和酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取水相加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置lOrnin，12000r/min離心5min;棄上清，沉淀用75。^的乙醇洗滌一次；離心棄上清，無菌干燥后沉淀溶于30WTE溶解，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為PMD-E3。1.11重組質(zhì)粒的序列測定與分析將初歩鑒定為陽性菌送生物公司測序，對所測序列進(jìn)行分析，并與TorontoA26/61強(qiáng)毒株進(jìn)行同源性比較。對擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行了測序，其核1^酸序列與預(yù)測的各0RF及其編碼的氨基酸序列見圖2(SEQIDN0.8)，各0RF在基因組中的相對位置見圖3。目的片段全長4614bp，該片段包括4個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，其中0RF1位于pVin基因內(nèi)部，編碼224個(gè)氨基酸殘基。在600bp處，即距E3區(qū)起始位置的上游340bp發(fā)現(xiàn)一TATAbox,推測為E3區(qū)的上游啟動子序列所在的位置。E3區(qū)位于pVIl基因和fiber基因之間，即圖中8972401bp，全長1504bp，正向有2個(gè)0RF，即圖中0RF2和0RF3。0RF2編碼118個(gè)氨基酸殘基，與0RF1間有14bp重疊，0RF3編碼364個(gè)氨基酸殘基。0RF4是fiber蛋白基因的編碼框內(nèi)部，本研究所克隆的fiber不完整。將該序列與GenBank中TorontoA26/61強(qiáng)毒株比較，發(fā)現(xiàn)二者只有7個(gè)堿基不同，分別在1968bp，2064bp，2089bp，2503bp，3162bp，3548bp，3702bp位置，核苷酸序列同源性高達(dá)99.81%。疫苗株與強(qiáng)毒TorontoA26/61E3區(qū)僅有2個(gè)堿基不同，且均為同義突變，所編碼的氨基酸不發(fā)生改變。將擴(kuò)增得到的E3區(qū)及其側(cè)翼序列與TorontoA26/61強(qiáng)毒株進(jìn)行了核苷酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)二者的pvm基因核苷酸同源性為ioox，其余序列中共有7個(gè)堿基不同，其中5個(gè)堿基均分布在fiber基因編碼框內(nèi)。在E3區(qū)的雖有2個(gè)突變堿基，但這兩個(gè)毒株E3區(qū)的氨基酸同源性為100X，這說明CAV-2E3區(qū)及其編碼的蛋白可能與病毒毒力的強(qiáng)弱無關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為下一步構(gòu)建E3缺失的CAV-2表達(dá)載體奠定了理論基礎(chǔ)。實(shí)施例2E3缺失重組犬2型腺病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析1材料和方法1.1病毒、載體及細(xì)胞CAV-2疫苗株、感受態(tài)細(xì)胞DH5a的來源同實(shí)施例l;pUC18載體購向大連寶生物工程公^;質(zhì)粒pEGFP-Nl(物理閣譜見圖4)為Clontech公「d產(chǎn)品，帶有hCMV立即早期啟動了-、MCS、EGFP和SV40polyA信號。1.2主要試劑DMEM購自GIBCO—BRL公司；胎牛血清購自天津?yàn)笊锕?；PrimeSTARHSDNAPolymerase,dNTP，DNAMarker,T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶fcoyI、《p/7l和5^el等均購自大連寶生物工程公司；磷酸,丐轉(zhuǎn)染試齊U盒(CalciumPhosphateTtansfectionKit)購自Invitrogen公司；小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司；六孔板購自Nunc公司，蛋白酶K購于Sigma公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Bio-rad公司。1.3E3缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建1.3.1E3區(qū)的缺失根據(jù)實(shí)施例1中對E3區(qū)及其側(cè)翼序列的核苷酸序列分析結(jié)果，分別選取2405024953bp及2636227238bp的序列作為轉(zhuǎn)移載體的上/下游同源重組臂，設(shè)計(jì)兩對引物，TS-U/TS-L用于擴(kuò)增上游同源臂TX-U/TX-L用于擴(kuò)增下游同源臂。在上游同源臂引物的兩端分別引入化oWI和I、5^el酶切位點(diǎn)，下游同源臂引物的兩端分別引入A^7l和^T7dlI酶切位點(diǎn)(序列中斜體部分)。TS-U:5'TTTGAATTCCAACCGCCTTTTTCCAAC3'(SEQIDNO.2)TS-L:5，TTTGGTACCACTAGTCCACCTGGTCCATGCTCTC3'(SEQIDNO.3)TX-U:5'TTCGGTACCACCCTCAGCCTTCTAAT3'(SEQIDNO.4)TX-L:5'TTT雄OTTTGGAAAGAGGCTCGTTGT3'(SEQIDNO.5)以質(zhì)粒pMD-E3為模板，PrimeSTARHSDNAPolymerasePCR擴(kuò)增上/下游同源重組臂基因。PCR反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，68。Clniin，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后得到的下游同源臂U的片段經(jīng)1和他./7dn雙酶切與同樣處理的pUC18質(zhì)粒做以下體系的連接載體pUC180.5叱，F(xiàn):I的基閃(PCR產(chǎn)物)3.7叱，10XTDNALigaseBuffer0.5W,，TDNAl,igase0.5叱。保溫瓶中16X:水浴，連接1小時(shí)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，挑取單個(gè)克隆菌，提取質(zhì)粒鑒定正確后命名為pUOX。上游同源臂目的片段與pUC-X質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行ibo7I和《如I雙酶切，將二者連接(方法同上)后缺失了兩同源重組臂之間的E3區(qū)序列，得到的質(zhì)粒命名為的pUC-AE3。1.3.2轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建根據(jù)pEGFP-Nl載體的核苷酸序列設(shè)計(jì)1對引物pE-U/pE-LpE-U:5'TTT釘縱CCGCCATGCATTAGTTATT3'(SEQIDNO.6)pE-L:5'TTT^C7^GTGCAGTGAAAAAAATGCTT3，(SEQIDNO.7)在上、下游引物的兩端同時(shí)引入了SpeI酶切位點(diǎn)(序列中劃線部分)這兩對引物可以擴(kuò)增包括hCMVIE、MCS、EGFP、SV40早期轉(zhuǎn)錄PolyA終止信號等在內(nèi)的1600bp的片段。反應(yīng)參數(shù)為95°C5rain，94°C30s，55°C30s，72°C30s，共30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增得到的目片段與pUC-AE3質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Spel酶切后相連接，通過酶切鑒定篩選出連接方向正確的質(zhì)粒命名為pUC-AE3-EGFP，完成了E3缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，構(gòu)建過程見圖5。試驗(yàn)結(jié)果以TS-U/TS-L為引物，以pMD-E3質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增了兩個(gè)片段，與預(yù)期的上、下游同源臂大小一致(圖6)，測序結(jié)果正確后將下游、上游同源臂先后克隆于PUC18載體，利用TS-U和TS-L中共有的酶切位點(diǎn)A^/I將二者連接得到中間克隆載體PUC-AE3，以pE-U/pE-L為弓I物擴(kuò)增質(zhì)粒pEGFP-Nl得到了約1600bp片段(圖7)，與預(yù)期的包含有hCMV立即早期啟動子、MCS、EGFP和SV40早期轉(zhuǎn)錄polyA信號的目的片段大小相符，將該片段插入到PUC-AE3的&el酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒中含有3個(gè)附/oin酶切位點(diǎn)，若插入的方向?yàn)檎?，酶切?yīng)得到約為2830bp、1880bp及1450bp的3個(gè)片段；反向則為2830bp、1750bp及1580bp的3個(gè)片段，篩選正向連接的質(zhì)粒經(jīng)測序正確后命名為PUC-AE3-EGFP，即為E3區(qū)缺失的重組轉(zhuǎn)移載體。各中間產(chǎn)物及重組轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定結(jié)果見圖8，圖9，圖10。1.4中量法提取PUC-AE3-EGFP質(zhì)粒并純化按Promega公司W(wǎng)ziardPureFectionPlasmidDNAPurificationSystem試劑盒說明書進(jìn)行。收集25ml細(xì)菌培養(yǎng)物，10，000g室溫離心10min，棄上清并用吸水紙吸盡殘液。加入1.25mlCellResuspensionSolution使細(xì)胞完全懸浮，然后再加入1.25mlCellLysisSolution,充分混勻后室溫作用5min，加入l.75mlNeutralizationSolution,立即顛倒6-8次混勻，10，000g室溫離心20min;將上清用0.45pm濾器過濾入新的離心管中，加入事先徹底混勻EndotoxinRemovalResin0.25ml，劇烈混勻后室溫靜止10min，期間間隔數(shù)秒混勻一次；將離心管放置在磁力棒上(Magnesi"MagneticS印arationUnit),輕輕搖動使樹脂完全吸附在管壁上，靜置30秒至溶液清晰后吸取上清至一新的離心管中；加入lral5raol/L的GuanidineThiocyanate，充分混勻后加入O.75mlMagnesilTMParamagneticParticles于管中，振蕩混勻后室溫作用2-3min，將管置于磁力棒上使顆粒吸附，溶液清晰并靜置30秒后，棄上清，將管從磁力棒上取下；加入lml4/10WashSolution振蕩重懸沉淀的顆粒，重復(fù)上述步驟，吸附棄上清；加入2.5ml80%的乙醇振蕩懸浮顆粒，吸附棄上清并重復(fù)洗滌三次；沉淀室溫干燥10min，用l.2ml滅菌去離子水重懸，劇烈振蕩10秒后，室溫靜置l分鐘，置于磁力棒上吸附后轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，加入O.5倍體積的7.5mol/L的醋酸納和2.5倍上述液體總體積的95%的乙醇，混勻后12000g室溫離心15min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12000g室溫離心5min,沉淀在無菌環(huán)境中自然干燥，加入200W滅菌去離子水重懸DNA，在紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度后一20。C保存?zhèn)溆谩?.5CAV-2親本病毒PFU的測定空斑滴定法(Nickin，1999)測定病毒滴度將MDCK細(xì)胞傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次；將試驗(yàn)一中收取的CAV-2病毒液用無血清的畫EM培養(yǎng)液作10倍比稀釋，每孔接種200叱每稀釋度作4孔，37.r吸附lh后吸出禍毒液；將2%的低烙點(diǎn)瓊脂糖融化后降至4(TC左厶，。'車先在37。C預(yù)熱的2XDMEM(含4%胎牛血清，0.02%中性紅)等體積混和，緩慢注入24孔板中，厚度約為2mm平放至瓊脂凝固，置于37'C培養(yǎng)，待蝕斑出現(xiàn)后計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒液中的病毒含量。滴度pfu/ml二plaquenumber/dilutionxvol咖e(ml)51.6重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞經(jīng)消化后接種于六孔板中，培養(yǎng)至長滿80%時(shí)，給細(xì)胞換成新鮮的培養(yǎng)液，每孔2ml，分別以105、1(f和107pFU的劑量感染親本CAV-2，2h后鈣轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PUC-AE3-EGFP質(zhì)粒每？L4ng，具體操作為分別準(zhǔn)備兩個(gè)EP管，標(biāo)為A、B，在A管內(nèi)加入7.2MCacl和4ug質(zhì)粒，加水補(bǔ)足60W，混勻。B管加入60W2XHBS。逐滴將A管內(nèi)的液體加入B管，滴加同時(shí)用槍頭在B管從液面不斷向底部吹氣泡，直到液體完全混勻(液體內(nèi)沒有肉眼可見的顆粒，晶瑩透亮為止)。將混合好的AB液室溫放置30min后加入已感染CAV-2的細(xì)胞中，輕輕晃動以混勻，置于37。CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后將細(xì)胞內(nèi)的液體吸出，加入10XDMS0(PBS溶解，pH7.2)，準(zhǔn)確作用2.5min，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。每隔24h在熒光顯微鏡下(Leica公司)觀察綠色熒光的表達(dá)及病變情況。當(dāng)90X的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，超聲裂解，離心取上清一2(TC保存。在轉(zhuǎn)染時(shí)本發(fā)明采用的方法是CAV-2親本病毒先感染DK細(xì)胞再轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PUC-AE3-EGFP。這就需要用重組病毒進(jìn)行多次純化用以去除親本CAV-2的污染。之所以采用這種方法是因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中很難像構(gòu)建重組人腺病毒那樣，用酶切過的病毒DNA和質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染獲得重組病毒，其中原因首先是MDCK細(xì)胞不像293細(xì)胞那樣具有較高的轉(zhuǎn)染和重組效率，所用的CAV-2為致弱毒株，感染力及毒力均有減弱，其DNA的轉(zhuǎn)染能力自然不高。1.7重組病毒的篩選及純化將收獲的病毒液用含2%犢牛血清的DMEM稀釋后感染長滿^層的MDCK細(xì)胞，每隔12h監(jiān)測熒光。選擇出現(xiàn)綠色熒光蛋白集中的位賞川lilW筆圈下，用細(xì)胞刮將圈外部分刮除，余下的細(xì)胞反復(fù)凍融后再次感染細(xì)胞，多次重復(fù)，直至在熒光顯微鏡下監(jiān)測到被感染的大部分細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光。待病變完全收取病毒液以無血清DMEM10倍比稀釋后感染MDCK細(xì)胞，吸附lh后棄去細(xì)胞表面液體，加入2mL2XDMEM(含有0.02%中性紅染液和4%血清)和2%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合凝膠，待出現(xiàn)明顯的蝕斑時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。挑取有綠色熒光的蝕斑放入lmL無血清的DMEM培養(yǎng)液中，反復(fù)凍融3次后接種細(xì)胞進(jìn)行新一輪的蝕斑純化，直至所有病毒蝕斑在均呈現(xiàn)綠色熒光為止。將純化到的重組病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為rCAV-2AE3-EGFP。本發(fā)明用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAV-2親本病毒感染后的MDCK細(xì)胞病變后而用收獲的病毒液再次感染細(xì)胞則發(fā)現(xiàn)視野中僅有極少量的熒光。這說明親本病毒與PUC-AE3-EGFP質(zhì)粒的在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組的效率并不高，我們所收獲的病毒大多為親本病毒，我們曾嘗試直接通過蝕斑篩選重組病毒，而事實(shí)證明這是很難辦到的，為了克服此難題，所采用的辦法是用記號筆將在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光聚集的位置各自圈在盡量小的范圍內(nèi)，將余下的細(xì)胞刮除。用收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物再次感染細(xì)胞，如此反復(fù)多次，直至被感染的大部分細(xì)胞在視野中均能呈現(xiàn)綠色熒光，則表示重組病毒已成為優(yōu)勢病毒，這是再用蝕斑篩選重組病毒就很容易了。為了檢驗(yàn)外源基因的表達(dá)是否穩(wěn)定，本發(fā)明對13代的重組CAV-2作蝕斑鑒定，結(jié)果仍為陽性，熒光顯微鏡下觀察可見到EGFP的表達(dá)，證明EGFP在重組病毒中穩(wěn)定表達(dá)，這對于重組病毒而言至關(guān)重要。若外源基因表達(dá)不穩(wěn)定、在傳代過程中丟失，將直接影響到重組病毒作為活載體疫苗的可行性。pUC-AE3-EGFP經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定濃度為1.27Pg/叱，按每2化/mL的比例取純化的重組質(zhì)粒pUC-AE3-EGFP轉(zhuǎn)染已被親本CAV-2感染的MDCK細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)染24h后即可觀察到瞬時(shí)表達(dá)的綠色熒光蛋白(圖12)，72h后可看到明顯的細(xì)胞病變，收取病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后接種MDCK細(xì)胞，用含1。/。低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞爭:出現(xiàn)明顯的蝕斑吋(國13)，挑取在在炎光顯微鏡下M現(xiàn)綠色熒光的蝕斑(見圖14)進(jìn)行下-輪的純化，用經(jīng)過連續(xù)6次蝕斑純化的載組病毒接種MDCK細(xì)胞，24h后觀察到幾乎所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光(圖15)，且所形成的蝕斑均為綠色。1.8重組病毒的PCR鑒定在缺失的E3區(qū)內(nèi)部以及EGFP的內(nèi)部分別設(shè)計(jì)一對引物AE3-S/AE3-X;EGFP-S/EGFP-X。序列如下△E3-S5，GTATGCCCAAACCTGCAC3，△E3-X5，GCATTGCAGTGTCAGGTA3，EGFP-S5，CGACGTAAACGGCCACAAGTT3，EGFP-X5'ACTCCAGCAGGACCATGTGAT3'用重組病毒rCAV-2AE3-EGFP感染細(xì)胞，病變完全后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，SDS-蛋白酶K法提取重組病毒的核酸DNA，用上述兩對引物做PCR鑒定。若不能擴(kuò)出E3區(qū)缺失部分的基因，而EGFP的基因條帶特異而明顯，則表明已經(jīng)純化完全。將篩選到的表達(dá)EGFP陽性的蝕斑在MDCK細(xì)胞上擴(kuò)增后，提取重組病毒的核酸DNA，用E3區(qū)內(nèi)部的引物AE3-S/AE3-X及EGFP上的引物EGFP-S/EGFP-X作為鑒定引物，用野生型的CAV-2作為對照，結(jié)果如圖15所示。用AE3-S/AE3-X為引物，擴(kuò)增野生型的CAV-2的擴(kuò)增的理論值應(yīng)約為1300bp;以rCAV-2AE3-EGFP基因組為模板，用EGFP-S/EGFP-XPCR擴(kuò)增片段大小理論值約為650bp。從圖中可知AE3-S/AE3-X只能擴(kuò)出野生型的CAV-2的片段，而EGFP-S/EGFP-X只能擴(kuò)出rCAV-2AE3-EGFP的片段(圖16)，且實(shí)際值與理論值相符，證明獲得了純化的單一克隆的rCAV-2AE3-EGFP。1.9重組病毒的生長特性及形態(tài)學(xué)的鑒定用經(jīng)6代純化后篩選到的重組病毒感染MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞所形成的病變。所收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物超生波破碎后，離心取上清，磷鉤酸負(fù)染色，置電鏡下觀察病毒形態(tài)。重組病毐接種在MDCK細(xì)胞72h后，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓、葡萄串樣等典型的CAV-2樣病變(圖17)。在電鏡下可見腺病毒樣病毒粒子(圖18)。病毒粒子呈正二十面體結(jié)構(gòu)，病毒表面由五鄰粒和六鄰粒構(gòu)成的衣殼，還可見到由殼粒構(gòu)成的正三角行結(jié)構(gòu)(圖中箭頭所示)。以106PFU/mL的劑量分別將重組病毒rCAV-2AE3-EGFP及CAV-2親本病毒接種于長滿單層MDCK細(xì)胞，在接種后培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h和144h收獲病毒，空斑滴定法測定病毒滴度，繪制生長動力學(xué)曲線(圖19)。從圖18中可以看出，CAV-2和rCAV-2AE3-EGFP生長曲線走勢相似，從24h到96h期間病毒滴度不斷升高，且二者的滴度相近；自96h以后達(dá)到平穩(wěn)期，rCAV-2AE3-EGFP的滴度比CAV-2略低；120h后病毒滴度有所下降。1.10重組病毒遺傳穩(wěn)定性檢測將純化的rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳代13次，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)的情況。并用1.8中的方法對傳代后的的rCAV-2AE3-EGFP進(jìn)行PCR鑒定。用連續(xù)傳13代的rCAV-2AE3-EGFP接種MDCK細(xì)胞，48h后在熒光顯微鏡下可見除部分病變脫落的細(xì)胞外幾乎所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光。PCR鑒定結(jié)果與2.3的結(jié)論相同。將純化后的重組病毒rCAV-2AE3-EGFP連續(xù)傳15代，經(jīng)測定每一代病毒的滴度相接近(見表l)。選取第5、10、15代重組病毒進(jìn)行PCR鑒定，均只能擴(kuò)增出特異性外源基因條帶，而CAV-2對照只能擴(kuò)增出缺失的E3區(qū)基因(圖20)，證明外源基因在傳代過程中未丟失且無野生型病毒的污染。接種病毒24h后觀察熒光結(jié)果顯示EGFP在第5、10、15代:歐組病毒中均獲得了表達(dá)(圖21)。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所獲得的重組病毒rCAV-2AE3-EGFP能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因。表1rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細(xì)胞上傳代后病毒滴度的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>1.11重組病毒作為疫苗載體的安全性評估5只1月齡的幼犬隔離飼養(yǎng)于哈爾濱獸醫(yī)研究所動物房，生長至4月齡時(shí)經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)檢測犬腺病毒抗體為陰性。將5只犬隨機(jī)分為3組第一組2只接種rCAV-2AE3-EGFP(5X108PFU/mL)，肌注5mL/只;第二組兩只接種同樣劑量的CAV-2;第三組一只肌注5mLDMEM培養(yǎng)液。接種后每天觀察犬的臨床變化。3周后剖檢犬，觀察心、肝、脾、腎、肺、氣管、腮腺、扁桃體、肩前淋巴結(jié)，頜下淋巴結(jié)等器官的病理變化。三組犬接種病毒后均無明顯臨床癥狀，3周后剖檢做病理切片。接種CAV-2犬、接種rCAV-2AE3-EGFP犬與對照犬各組織器官病理變化的比較見表2及圖21。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接種rCAV-2AE3-EGFP的犬組織無明顯病變，僅個(gè)別組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，屬正常免疫反應(yīng)，說明E3區(qū)的缺失未使CAV-2的致病力增強(qiáng)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中(一)表示無明顯病理變化。本發(fā)明成功構(gòu)建了E3區(qū)缺失的重組CAV-2轉(zhuǎn)移載體并獲得了純化的含有EGFP報(bào)告基因的重組CAV-2毒株，對其克隆純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)鑒定該重組病毒生物學(xué)特性穩(wěn)定，為進(jìn)一步開展CAV-2活載體疫苗研制及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了技術(shù)平臺。試驗(yàn)例1犬瘟熱病毒A株F和H蛋白在重組犬腺病毒中的表達(dá)腺病毒為載體的重組活疫苗，不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫而且還產(chǎn)生良好的局部粘膜免疫，可對抗母源抗體的干擾，且可通過多種途徑傳播，口服、點(diǎn)眼、滴鼻、氣霧和注射均引起病毒感染，給疫苗應(yīng)用提供了方便，特別適用于動物的群體免疫。因此選用腺病毒作載體進(jìn)行活載體重組疫苗的研究是有實(shí)用意義的。CAV-2以犬為天然宿主，常用作弱毒疫苗用于犬傳染性肝炎和犬傳染性喉氣管炎的預(yù)防，本研究擬將CDV中能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的兩種主要的免疫原性蛋白F及H的編碼基因插入表達(dá)載體pUC-AE3-EGFP中，用以構(gòu)建表達(dá)CDV-F和CDV-H的重組CAV-2，為研制能夠同時(shí)預(yù)防犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬瘟熱的重組活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。1材料及方法1.1病毒和細(xì)胞重組2型犬腺病毒rCAV-2AE3-EGFP由本發(fā)明實(shí)施例2所構(gòu)建，犬瘟熱病毒A株種毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所經(jīng)濟(jì)動物研究室提供，在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖培養(yǎng)；MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2質(zhì)粒表達(dá)載體pUOAE3-EGFP山本發(fā)明實(shí)施例2所構(gòu)建。1.3主要試劑TRIzolReagent購自Invitrogen公司DEPC，Taq、限制性內(nèi)切酶^^1I禾nAtotI、IPTG、NC膜均購自TaKaRa公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬IgG、FITC標(biāo)記的兔抗犬IgG熒光抗體購自KPL公司，其它試劑同實(shí)施例2。1.4SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。1.5犬瘟熱病毒的增殖取911日齡的SPF雞胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒氣室部位，無菌取雞胚，棄去頭、四肢和內(nèi)臟，剪成約2mm大小的組織塊；用Hank，s液洗滌組織塊，去除污血后，以5mL/胚的比例加入0.25%胰酶溶液，放置在37。C水浴中消化15min;倒掉胰酶，用Hank's液洗滌23次后加入適當(dāng)?shù)暮?0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分散細(xì)胞，用6層紗布過濾，制成1(f10'個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分散于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，制成雞胚成纖維細(xì)胞(Chickenembryofibroblast,CEF)待細(xì)胞長成單層后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞以去除殘留血清。取A株CDV種毒1:100倍稀釋后取少量接種細(xì)胞，37'C吸附lh，加入DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變完全，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后于-7(TC保存?zhèn)溆谩?.6RT-PCR引物設(shè)計(jì)參照己發(fā)表的CDVF和H基因序列，分別設(shè)計(jì)了用于分段擴(kuò)增F基因的兩對引物F1U/F1L和F2U/F2L;及用于擴(kuò)增H基因的引物HU/HL，由上海生物工程公司合成。合成后所有上游引物均采用DEPC處理的滅菌水溶解。F1U:5'AGAAGGCAGATCATTATCGGAC3'F1L:5，CATCTCTGCCCAA〔'TAATTCAC3，F(xiàn)2U:5'GATGTGAATTAGTTGGGCAGAGA3'F2L:5，TGTTGGACTACCTGAGCCCTAA3，HU:5'TAGGGCTCAGGTAGTCCARCAAT3，HL:5'GTATACGGCCTAAATCTTCGACA3，1.7病毒基因組RNA的提取參照TRIzolReagent的說明書進(jìn)行，具體步驟如下取病毒懸液約200uL加入ImL的TRIzol裂解液，顛倒混勻室溫放置5min，加入200uL氯仿蓋緊EP管用力振蕩15S，室溫放置23min，4°C12000rpm離心15min，小心吸出上清加入等量的異丙醇混勻后于室溫放置10min，4°C12000rpm離心15min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌后真空干燥，用DEPC水重懸，紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度及純度，立即反轉(zhuǎn)錄或-7(TC保存。1.8反轉(zhuǎn)錄在DEPC處理的EP管里配置反應(yīng)液，模板RNA3叱，RandomPrimerl叱(25pmol/叱)混勻后置于7(TC5min，于冰上依次加入以下組分M-MLVX5ReactionBuffer5叱，dNTPMixture(10mmol/U機(jī)，Ribo匿leaseInhibitorl叱，M-MLVl叱，加滅菌DEPC水定容至25叱，37。C作用lh，70°C10min后冰浴2min，所得的cDNA模板用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。1.9目的基因的PCR擴(kuò)增取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板50叱反應(yīng)體系依次加入TaKaRaLATaq(5u/叱)l叱，10XLApCR"'BufferII(Mg"'Plus)10叱，上游引物(10mM)2叱、下游引物(10mM)2叱、dNTP(各2.5mM)8叱、模板3叱。PCR反應(yīng)參數(shù)為95。C預(yù)變性3min，94°C30S，60°C(F1)/55。C(F2)/58。C(H)2mm，30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。取5叱PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確后將PCR產(chǎn)物送英杰生物公司測序。I.IO序列分析選擇GenBank中幾種標(biāo)準(zhǔn)疫苗株0nderst印oort(AF378705)丄ederle株(AF164967)、Convac(Z35493)及從不同國家分離到的具有代表性的野毒株5408P(AY86316)、11103B(DQ494319)、012689(AY649446)、A75/17(AF164947)、GN(EF445054)、SC01(EF)、Yanaka(AB028914)、5VD(AY297454)、HM6(AB040768)、MS01(DQ922630)、ZD01(EF445051)、顧(EF445053)、982645(AY542312)、25259(AY964114)、002601(AY395984)等與A株的F、H基因進(jìn)行了核苷酸及氨基酸序列的比對。1.ll重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建通過對上述PCR產(chǎn)物基因測序結(jié)果的分析，設(shè)計(jì)2對引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L分別用于擴(kuò)增包括完整閱讀框的CDV-F和CDV-H。在兩條上游引物的5'端均引入了^^II酶切位點(diǎn)，兩條下游引物的5'端均引入了A^H酶切位點(diǎn)，引物序列(斜線部分為酶切位點(diǎn))如下rF-U:5，CCC掘7TrCCCCATGCACAAGGAAAT3，rF-L:5'ATA■紅G6TTATTGCAGTTGAGTGAC3'rH-U:5，CCC■7tTCGCMTGCTCTCCTACCAAGAC3,rH-L:5'AAA<6TAGTGGTCACATGAGAATC3'提取A株CDV基因組RNA，分別以rF-U/rF-L、rH-U/rH-L為引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增了CDV-H及CDV-F。兩目的片段用S^II和vVotI消化后，分別與經(jīng)過同樣處理的pUC-AE3-EGFP載體連接，用插入的外源基因替換了綠色熒光蛋白基因，鑒定連接正確的質(zhì)粒分別命名為pUC-AE3-F。1.12重組病毒的篩選MDCK細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)至單層，以每孔107PFU的劑量接種重組病毒rCAV-2AE3-EGFP，每孔200uL吸附lh后棄去感染液，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法(具體操作同實(shí)施例2)分別轉(zhuǎn)染純化的重組質(zhì)粒pUC-AE3-F、pUC-△E3-H。待細(xì)胞病變完全后收取病毒液繼續(xù)接種MDCK細(xì)胞，在熒光顯微鏡下篩選無綠色熒光的蝕斑，經(jīng)多次蝕斑純化復(fù)至用篩選到的重組病^感染細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光為止，將篩選到的重組病毒分別命名為rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H，擴(kuò)大培養(yǎng)后-7(TC保存。1.13重組病毒的PCR鑒定SDS-蛋白酶K法(同實(shí)施例1)提取重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2△E3-H的核酸DNA，分別用rF-U/rF-L和rH-U/rH-L做PCR鑒定，驗(yàn)證F和H基因是否重組到rCAV-2AE3-EGFP的基因組中，用引物EGFP-S/EGFP-X做PCR鑒定檢驗(yàn)重組病毒的純化是否完全。1.14間接免疫熒光鑒定將重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H感染后的MDCK細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化；PBS洗滌，2000rpm離心5min，將吹打均勻的細(xì)胞滴在載玻片上，自然干燥；冷丙酮固定5-10min后，自然干燥；用PBS洗滌3次，每次5min;CDV單因子陽性血清用PBS稀釋100倍，滴加在載玻片上，37。C作用45rain;載玻片用PBS洗滌3次，每次5min，用去離子水洗滌一次，自然干燥；取FITC標(biāo)記的兔抗犬IgG熒光抗體用的PBS稀釋到工作濃度，滴加在載玻片上，37。C作用45min;用PBS洗滌3次，用去離子水脫鹽后，自然干燥；滴加堿性甘油，加蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察。1.15Westernblot分析用重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H分別感染MDCK細(xì)胞待細(xì)胞病變完全，刮取細(xì)胞作為檢測樣品。加入等體積的2XSDS電泳上樣緩沖液置于沸水中煮沸10min。處理好的樣品進(jìn)行10。/。凝膠SDS-PAGE蛋白電泳，具體操作按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，第二版)進(jìn)行。將6張濾紙和硝酸纖維素(NC)膜剪成與凝膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min，按3張濾紙、NC膜、PAGE凝膠、3張濾紙的順序依次疊放在一起，按NC膜側(cè)在陽極、凝膠側(cè)在陰極將其放入轉(zhuǎn)移槽中穩(wěn)流(40mA)轉(zhuǎn)印2h。轉(zhuǎn)印結(jié)束將NC模放入封i:i袋中，加入封閉液4r封閉過夜。然后用PBST(0.05%Tween20)洗滌三次，每次35min，加入用封閉液配制的l:100倍稀釋的CDV多克隆抗血清，37。C感作lh,棄去一抗，用PBST洗3次，每次10min。然后加入用PBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬IgG，37°C感作lh，再用PBST漂洗3次后顯色，待出現(xiàn)明顯的條帶時(shí)去離子水終止顯色反應(yīng)。2結(jié)果2.1F和H基因的擴(kuò)增結(jié)果提取的病毒基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用特異性引物F1U/F1L和F2U/F2L分別擴(kuò)增了約1200bp和1500bp的兩個(gè)片段(圖23);HU/HL擴(kuò)增后得到了約1900bp的片段，與預(yù)期大小一致(圖24)。2.2F和H基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析對PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行了分析，A株CDV的F基因編碼框全長1989bp,共編碼662個(gè)氨基酸殘基，與其它毒株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)A株CDV的F基因與標(biāo)準(zhǔn)疫苗株Onderst印oort的核苷酸及氨基酸序列同源性最高，分別為97%和96.4%。與另外8株的核苷酸同源性在96.6%91.6%之間，氨基酸同源性在94.9%89.8%之間。H基因編碼框全長1824bp，共編碼607個(gè)氨基酸殘基，與其它毒株進(jìn)行了序列比較發(fā)現(xiàn)A株H基因與Lederle株Onderst印oort株序列同源性較高，核苷酸同源性分別為98.8%和96.6%;氨基酸同源性分別為97.5%和95.4%，與其余毒株的核苷酸及氨基酸同源性分別在90%和89%以上。2.3轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的F、H基因片段用勘/II和A^1消化后，分別'j經(jīng)過同樣處理的pUOAE3-EGFP載體連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUC-AE3F和pUC-△E3-H。對重組質(zhì)粒分別作《^n單酶切鑒定，7%711和7W^I雙酶切鑒定所得到條帶均與理論上的大小相一致(圖25，圖26)。2.4重組病毒的篩選及PCR鑒定用純化的重組質(zhì)粒pUC-AE3-F、pUC-AE3-H分別轉(zhuǎn)染rCAV-2AE3-EGFP感染的MDCK細(xì)胞，病變完全后收取病毒液繼續(xù)接種MDCK細(xì)胞，在熒光顯微鏡下篩選無綠色熒光的蝕斑，經(jīng)多次蝕斑純化直至用篩選到的單一克隆株感染細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光并能夠形成典型的CAV-2樣細(xì)胞病變?yōu)橹?圖27)，將篩選到的兩株單一克隆重組病毒分別命名為rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H。用引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L對所篩選到的兩種單一克隆株進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果為陽性，而引物EGFP-S/EGFP-X擴(kuò)增的結(jié)果為陰性(圖28)2.5間接免疫熒光檢測間接免疫熒光結(jié)果(見圖29)證實(shí)F及H基因在重組病毒中均獲得了表達(dá)。2.6Westernblot分析將重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H分別接種MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)，刮取病變細(xì)胞作為檢測樣品進(jìn)行WesternBlot，以CAV-2接種的MDCK細(xì)胞作對照。結(jié)果在rCAV-2AE3-F的細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到大小約為43kDa和20kDa的蛋白，與F1、F2蛋白大小一致；在rCAV-2△E3-H的細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到大小約為68kDa的蛋白，與H蛋白大小相一致；證明F及H蛋白在重組病毒中均獲得了表達(dá)，并具有抗原反應(yīng)原性(圖30，圖31)CDV病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要冇核衣蛋白(N)、磷蛋國、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、附著蛋fl(H)，其中F、H為分布在囊膜表面的兩種糖蛋白，囊膜糖蛋白為宿主免疫識別的主要靶抗原，是病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中必不可少的。其中F蛋白是融合過程中所必需的，它所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒進(jìn)一步侵染，并在病毒增殖的情況下對癥狀的發(fā)生具有一定的抑制作用。純化的F蛋白免疫犬可免受致死量的CDV攻擊(Blixenkron-Mollereta人1992)。H蛋白是CDV與細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白，決定著病毒的細(xì)胞噬性，與F蛋白一起介導(dǎo)了病毒感染細(xì)胞合胞體的形成，H蛋白上分布著許多中和抗體表位，是產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。具有中和作用的抗H蛋白抗體和抑制細(xì)胞融合的抗F抗體，在抗CDV感染的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。因此，在構(gòu)建病毒的亞單位疫苗或重組基因工程疫苗方面，主要以這兩個(gè)蛋白作為切入點(diǎn)。在實(shí)施例2中所構(gòu)建的重組載體pUC-AE3-EGFP缺失了E3區(qū)1412bp的片斷，從理論上講可使外源基因的容量擴(kuò)增至3000bp，但所插入的hCMVIE啟動子、多克隆位點(diǎn)，綠色熒光蛋白基因、SV40早期轉(zhuǎn)錄PolyA信號等元件又占用了約1600bp的容量，而CDV-F和CDV-H基因片斷大小分別為1998，1824bp,若將二者直接插入載體pUC-AE3-EGFP中則會超過CAV-2核衣殼的包裝限度。對此本發(fā)明所采取的措施是，去除pUC-AE3-EGFP中的EGFP基因，即分別用CDV-F和CDV-H基因取代EGFP基因。為了方便篩選，本發(fā)明用篩選獲得的遺傳穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的單一純化重組病毒克隆rCAV-2AE3-EGFP作為親本病毒感染MDCK細(xì)胞，使其基因組分別與重組質(zhì)粒-rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組。通過篩選無綠色熒光的蝕斑來篩選重組病毒。本實(shí)驗(yàn)對篩選的重組病毒進(jìn)行了Western-blot檢測，在感染rCAV-2AE3-F的細(xì)胞培養(yǎng)物檢測到了大小約為40kDa和23kDa的兩個(gè)蛋白。在對rCAV-2AE3-H中重組H蛋白的檢測中，得到了與預(yù)期大小相符的約67kDa的蛋白，但在其它的下方出現(xiàn)一條分子量略小于H蛋白的特異性條帶，推測為病毒系統(tǒng)對重組蛋白加工、剪切的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)利用在實(shí)施例2中已驗(yàn)證的能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的的E3區(qū)缺失的CAV-2載體構(gòu)建了表達(dá)了A株CDV的F和H基因的重組病毒，經(jīng)Western-blot檢測所表達(dá)蛋白具有良好的免疫活性。序列表SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>重組犬2型腺病毒轉(zhuǎn)移載體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用<130〉22〈160>10〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>6152<212>隨〈213〉A(chǔ)rtificial<400>1tcgcgcgtttcggtgatgscggtg3333CCtctgacac3tgcagctcccgg3g3CggtC360cagcttgtctgtaagcggatgccggg3gcagacaagcccgtcagggcgcgtC3gCgggtg120ttggcgggtgtcggggctggCtt38Ct8tgcggcatcagsgcag3ttgtaCtg3g8gtgC1803CC3t3tgCggtgtgaaataCCgC3C3g3tgCgt33gg3gsaastacegeatcsggcgcc240attcgccattC3ggctgcgc33CtgUggg33gggCg8tCggtgcgggcctcttcgctat300t8cgccagctggcg認(rèn)ggggg3tgtgCtgcaaggcg8tt33gttgggt33CgCC3gggt360tttCCC3gtC3Cg3CgttgtaaaacgacggccagtgccaagCUgC3tgCctgcaggtcg4203CtCt3gaggatccccgggt3CCg3gCtCgaattccaaccgcctttttccaac3ctgtac480gCC8tCttCC33C333gC3gaggctcccccacggc3tt3acagatccctc540agatccctcct33g38gCtgtctct3CC3Caagtcagagg3gC3gCtgCtgCgC3CgCg360038Cg3CgCCgaagctttgctC33C333t3CtgtC38gg3Ctcgagtccggcacagactga660gcaeitgtctaaagaaataccaaccccttatatgtggagct8CC33CCgC38acgggacac720gccgccggcgrctcccaggactactccaccggttt3gtgCtgggccatca7803tg3ttagtc服gtttatggC3ttagagacttgCg(，33C3fl3gt11tgflt83cccagg(:a840aacaataatggatCCgCC33tttggCC3gCtgccatgctt900gttcaggaagCCgCCCC3CCC3333CggtC〖ictctgcccagfl犯CC3C3CCCt3g33C3g960gctstgacc3actctggggcgC3gCt3gCggg3gg3Cgac3gCtgtgCCCctcccaaatii1020gCCC3gtgCtggCtggC3Cgggcattcagctt9gCg33g3catcccx8g('1080g(:rtrrtgga1(:agg(::ccgacggcat3tTcgggggtCT(:gcU'gt(('"('1卜l()C8CCCtgC3Scaggcatcct(:g3('gcrg('g1200gtgggC3CCtaccagttt.gtgcgcg犯tttgtgCC3g3ggtataccttaaccctttttea1260ggaccaccggacacctttcctgatcagttcattcctaactacg8cattgtaaccaactct1320gtcgatggct3tgactgsgg卿gcatggaccaggtggactagtccgccatgcattagtt1380attaatagta8tC33tt3CggggtC3tt3gttcatagcccttccgcgtt31440cataacttacggtsaatggcccgcctggctg3CCgCCC33Cg3CCCCCgCccattgacgt1500C3at3atgacgtatgttcccatagtaacgcC33taggg3Ct.ttccattgaCgtC33tggg1560tggagtatttacggtaaactgcccacttggC8gtacatc33gtgt8tcatatgccsagta1620cgccccctattg3CgtC33tgacggtaaatggcccgcctggcattatgccC3gt3C3tg31680CCtt3tggg3CtttCC"t3CttggcagtacatctacgtaU3g"tC3tCgCtattaccatggmotgatgcggttttggC3gt8CatcaatgggcgtggatagcggtttgactcaCgggg3tttC1800caagtctccaccccattgacgtC33tggg3gtttgttttggcaccaaaatcaacgggact1860ttccaaaatgtcgtaac8actccgccccattgacgc3a3tgggcggt鄉(xiāng)cgtgtacggt1920gggaggtctatataagC8gagctggtt.tagtg3accgtc3gatccgctagCgCt3CCgg31980ctcagatctcg3gCtC33gCttcgaattctgC8gtCg3Cggtsccgcgggcccgggatcc2040accggtcgccaccatggtgagC33gggCg3gg3gCtgttC3CCggggtggtgCCC3tCCt2100ggtcgagctggacggcgacgt833CggCC3caagttcagcgtgtccggcg3gggcgaggg2160cgatgccacctacggcaagctg3CCCtg33gttcatctgcaccaccggcaagctgcccgt2220gccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcsgtgcttcagccgctaccc2280cgaccscatg^mgC3gC3Cgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccagga2340gcgcaccatcttcttcaaggacg3cggcaactscaag3cccgcgccgaggtg犯gttcga2400gggCg8C8CCCtggtg33CCgcatcgagctg犯gggC3t.CgacttC3aggaggacggcaa2460CEltCCtggggC3caagctggagtacaactaC33C3gCC3Caacgtct3tatcatggccga2520caagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgcCaC33C3tCg3gg3CggC3g2580CgtgC3gCtCgccgaccactaccsgcagaacacccccstcggcgscggccccgt.gctgct2640gcccg3caaccactacctgagcacccagtccgccctgagc333g3CCCC33Cg3g33gCg2700cgatc3C3tggtcctgctgg3gttcgtgaccgccgccggg3tC3CtCtCggC3tggscga2760gCtg"t3C33gtsaagcggccgcgactct3g3tcata3tcagCC3taCC3Catttgt卿g2820gttttacttgCttt333333CCtCCC3C3Cctccccctgaacctgaascataa83tgaat2880gcaattgttgttgttaacttgtttattgc3gcttataatggtt3caa8t.a3agcsat3gc2940atcac3aatttcacaaataaagcatttttttcactgcact3gtggt3CC3ccctcagcct3000tct33tgggaaa3tC3ggcccatgtagctt3060ttttgctaag9CgtCtgggtcctgcgtttct3tgtCC3CCa(化gtcccctcttcccagct3120ttggtacttccacttgtgcgCgCg3gCC3gcttgcggatgtgCUg333g8t33tgtggt3180ctctcccaacagcttcccgttC3CC8gC8Ccagggccatg朋gcggei〔:3Cgaagagctct3240acct.gcaaattstgaccctgt3t3tCC3t3cgacgcccccgggmircaC3C33CCCCC3300gtCtC3Ctg3gtcacccccaggaw'c('tgg(:tgt(，tgt3360ttCCCC.tCC3ctaac('t111ctacgttagg1gccatt隆ict"('('n('HggtCCCgg3Ct3420C3CCCtC33Cg3gggC33gltacaagccagCtt3gggCC('caaatac(:ga3480gggCC883tCactgttgaaaatgtcaacaaggttt.tgtcttttacctcccC3tt3C3t333540actgtatccctagcgctagg卿tgggtt3gaag3tgaaaatggcaccct3600taaagtgaccttccctactccccctcccccgctacaattctcccctcccc3660aggtggtactgtttccttgcCCCtgC83g3ctccatgcaagtgac83atgg3333Ctggg3720cgttaagcctaccacctacgcacctcccttg犯aaaaactg3CC3gC33gttagcctcca3780agtaggctcgggtctcaccgtgattascgaacagttgc33gctgtccagcctcccgcaac3840gagcctctttccaaaagcttgcatgcctgcaggtcgactct3g3gg3tCC3900CCgggt3CCg3gCtCg33ttCgt33tC3tggtcatagctgtttcctgtgtgaaaUgtta3960tccgctcacaattccacacaacatacgagcCgg犯gC3t3aagtgtaaagcctggggtgc4020ctaatgagtg8gCt33CtC3cattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccsgtcggg4080aaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgCgggg3g3ggcggtttgcg4140tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcg4200gcgagcggtatcagctcactC333ggCggtaatacggttatccacagaatC3gggg3t334260CgC3gg333g33C3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