專利名稱：一種炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶的方法
背景技術(shù)：
炭疽桿菌是一種能形成芽胞的革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，由它感染引起的炭疽病是危害人類的 致死性重大傳染病。炭疽桿菌在有氧條件下形成大量芽胞，芽胞被人體吸入后在肺泡周圍的 淋巴細(xì)胞中萌發(fā)，其繁殖體和毒素進(jìn)入血液，可致99%以上的未防護(hù)人群死亡。
芽胞生存力強(qiáng)，在干燥土壤中存活40年以上仍具有感染力，當(dāng)前新發(fā)突發(fā)細(xì)菌病原體不 斷出現(xiàn)，抗生素抗性越來(lái)越高，且在世界范圍內(nèi)普遍存在，裂解酶由于殺滅細(xì)菌的作用機(jī)制 與抗生素不同，裂解細(xì)菌細(xì)胞壁使之致死，細(xì)菌不會(huì)產(chǎn)生抗性，而Y噬菌體裂解酶專性裂解 炭疽桿菌，與炭疽桿菌結(jié)合力強(qiáng)，可替代抗生素，殺滅清除炭疽桿菌繁殖體與芽孢，具有開(kāi) 發(fā)成藥物的潛力。
2002年，Schuch (Nature ，2002 ，418(8) :884 - 889)等人首次證實(shí)了 Y噬菌體裂解酶(命 名為plyG)可快速裂解生長(zhǎng)中的炭疽桿菌并可有效地殺死感染炭疽桿菌小鼠中的病原菌。炭 疽桿菌Y噬菌體裂解酶由233個(gè)氨基酸殘基組成，是N—乙酰胞壁酸一L一丙氨酸酰胺酶，通 過(guò)破壞炭疽桿菌細(xì)胞壁中的N—乙酰胞壁酸和L一丙氨酸之間的交聯(lián)而使其裂解。體外試驗(yàn)表 明plyG可特異性裂解炭疽桿菌各株型的細(xì)菌和芽孢，而對(duì)與其非常接近的蠟樣芽孢桿菌、蘇 云金芽孢桿菌則沒(méi)有殺滅效果。對(duì)其它如枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、 短小芽孢桿菌也沒(méi)有作用。
Y噬菌體裂解酶對(duì)炭疽菌及芽孢的快速殺滅效果與高靈敏度，作為炭疽菌診斷試劑、炭 疽菌污染環(huán)境的洗消劑及炭疽治療藥物，具有開(kāi)發(fā)潛力。因此本項(xiàng)目用基因工程的方法表達(dá) Y噬菌體裂解酶，作為炭疽環(huán)境污染檢測(cè)試劑、炭疽洗消劑與炭疽治療藥物的用途。
根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，美國(guó)的RaymondSchuch (2002)對(duì)Y噬菌體裂解酶做功能鑒定時(shí)用 了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得具有活性的plyG，國(guó)內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所(2005)也 用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得Y噬菌體裂解酶plyG。該種方法表達(dá)純化的plyG量雖然較大，但該 系統(tǒng)的內(nèi)毒素及熱源問(wèn)題使其應(yīng)用仍有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能在畢赤酵母菌中高效表達(dá)炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶基因的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶的方法，是將上述PlyG基因插入真核細(xì)胞 表達(dá)載體，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌，獲得重組蛋白的宿主菌，經(jīng)過(guò)隨機(jī)挑選和加壓篩選，獲得生產(chǎn)菌株G6，使Y噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌P/c^'apo^w^ G6上清中獲得高表達(dá)， 且表達(dá)產(chǎn)物不含多余氨基酸。
所述真核細(xì)胞表達(dá)載體可為PPIC9K等商業(yè)酵母分泌型表達(dá)載體。
所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為pMEX9K。
所述PlyG插入到pMEX9K的feci和酶切位點(diǎn)間。
所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母P!'c/n'a pc^on's GS115。
所述工程菌為巴斯德畢赤酵母尸/c/z/aG6。
上述方法中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所用的誘導(dǎo)劑為甲醇，誘導(dǎo)濃度為終體積0. 51 所述工程菌的培養(yǎng)溫度為28-3(TC，優(yōu)選為28。C。
本發(fā)明使Y噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌P!'cWa; flWw^ G6上清中獲得高表達(dá)，且表 達(dá)產(chǎn)物不含多余氨基酸?；钚詼y(cè)定本發(fā)明表達(dá)的Y噬菌體裂解酶的活性達(dá)1200U/mg。
通過(guò)離心、過(guò)濾等方法除去菌體和大顆粒雜質(zhì)；再通過(guò)超濾的方法除去小分子的色素和 鹽，并且濃縮體積，將發(fā)酵液調(diào)整為合適的緩沖液，經(jīng)過(guò)離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò) 濾層析三步層析純化后，蛋白回收率為46%，原液純度可達(dá)95%以上。


圖1為Y噬菌體裂解酶基因PlyG的電泳圖(702bp) 圖2為所用的表達(dá)載體pMEX9K
圖3為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物plyG的SDS-PAGE分析圖譜。泳道1、泳道2、泳道3、 泳道5、泳道6為誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清。泳道4為誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清。M為蛋白 分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的蛋白27KD。
圖4為PlyG純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析。泳道1為柱前產(chǎn)物，泳道2為一次純化產(chǎn)物， 泳道3為二次純化產(chǎn)物，泳道4為三次純化產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中的方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
1、 PlyG基因的獲得
診斷用炭疽桿菌噬菌體由蘭州生物制品研究所惠贈(zèng)。提取噬菌體基因組，以基因組為模 板擴(kuò)增噬菌體裂解酶基因。噬菌體基因組的提取方法參照入噬菌體(也為dsDNA型)DNA的 提取方法。 (1)噬菌體平板培養(yǎng)1) 用SM液10倍梯度稀釋噬菌體原種。
2) 取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，加麥芽 糖(0.2%)， MgS04 (lOmm)， 37。C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。
3) 取熔化(47°C) 0.7Q/。瓊脂LB固體培養(yǎng)基3ml與上述管混勻，立即倒入預(yù)備<2-4天) 的含凝固1.5y。瓊脂LB固體培養(yǎng)基的平板內(nèi)，輕輕晃動(dòng)平板使均勻分布。
4) 37'C培養(yǎng)6-8hr后，觀察噬斑形成。
5) 用剪去部分頭部的吸頭挖取單個(gè)噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37 。C溫育10min。
6) 重復(fù)l) 一4)，獲得單個(gè)噬斑滴度。
(2) 噬菌體液體培養(yǎng)
1) 取2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，離心，0.4mlLB培養(yǎng)基重懸，加噬菌體0.1ml (新鮮獲得 的單個(gè)噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000)。
2) 加麥芽糖(0.2%)， MgS04 (10mM), 37。C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。
3) 加到lOOml LB液體培養(yǎng)基中，加麥芽糖(0.2%), MgS04 (10mM)， 37。C搖震培養(yǎng) 9-12hr后可見(jiàn)裂解發(fā)生。
4) 加0.1ml氯仿，37'C繼續(xù)搖震培養(yǎng)10-20min。
(3) 噬菌體DNA提取
1)將上述裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000gX10min,去細(xì)菌碎片，取上清液。
2) 力卩RNase A、 DNaseI至1 P g/ml， 37。C溫育30min。
3) 加9.3gPEG8000， 5.8gNaCl，搖勻至溶解，冰浴lhr或4。C過(guò)夜。
4) 4。C離心10000gX20min，去上清液。
5) 加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20u 1 10%SDS， 20n 1 0.5M EDTA， 68。Cl5min。
6) 加等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)，混勻，離心12000gX5min，取上層液到一 新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇(24: 1)，混勻，離心12000gX5min。
7) 取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-2(rClhr，4i:離心12000gX10min， 去上清液。
8) lml預(yù)冷的70。/。乙醇洗漆沉淀l-2次，4'C離心8000gX7min，棄上清，將沉淀室溫下 晾干。9)沉淀溶于20ulTE， -20^保存?zhèn)溆谩?br> (4)以基因組為模板擴(kuò)增噬菌體裂解酶基因。在目的基因兩端加入SacI和五coi I酶切位點(diǎn)， 設(shè)計(jì)引物如下
UPPER: 5-TGGAGCTCGAAATCCAAAAGAAATTAGTTGATC-3
LOWER: 5-GGGAATTC TTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT-3
以2ul基因組DNA為模板，加入引物各liig，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下U)94。C， 5min; (2) 94°C 30sec， 52°C lmin, 72°C lmin， 30循環(huán)；(3) 72°C， 7min。將產(chǎn)物進(jìn)行凝 膠電泳回收，電泳圖譜如圖l， PlyG基因?yàn)?02bp。
實(shí)施例2、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
用SacI及&oi I酶切PCR產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶切處理的分泌型酵母表達(dá)載體pMEX9K (圖2) 連接，TSS法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒。送Takara公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表 明該702bp大小的片段為PlyG基因，核苷酸兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，但均為同義突變，氨基酸序列 經(jīng)比對(duì)完全一致，表達(dá)載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pMEXplyG。
實(shí)施例3、 PlyG基因在酵母中的高效表達(dá)
提取重組質(zhì)粒pMEXplyG DNA，然后經(jīng)Sac I酶切使之線性化，分離純化后用電轉(zhuǎn)化法 轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。轉(zhuǎn)化后的GS115經(jīng)MD平板篩選得到HIS+重組克隆，將MD平板上 生長(zhǎng)的克隆接種YPD--G418平板，置于3(TC溫箱培養(yǎng)。將MD平板與不同G418濃度YPD 平板篩選出的重組克隆分別接種于5ml BMGY中，30°C300r/min培養(yǎng)至ODmo為2.0 6.0; 室溫4 000r/min離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮并稀釋至OD6。。為1.0后，30°C 300r/min 誘導(dǎo)。每1211補(bǔ)加甲醇至0.5%。誘導(dǎo)48h后收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)(圖3)， 并測(cè)定其生物活性。選取培養(yǎng)上清中表達(dá)量高的菌株G6作為生產(chǎn)菌株。將G6同時(shí)點(diǎn)種于 MD、 MM平板，3(TC培養(yǎng)2 3d，確定菌株的Mut表型為Mut+。
實(shí)施例4、三步層析純化PlyG蛋白
層析純化方法主要包括離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析以及凝膠過(guò)濾層析 等方法。本發(fā)明中，PlyG分泌表達(dá)在發(fā)酵上清液中，通過(guò)離心、過(guò)濾等方法除去菌體和大顆 粒雜質(zhì)；再通過(guò)超濾的方法除去小分子的色素和鹽，并且濃縮體積，將發(fā)酵液調(diào)整為合適的 緩沖液，利于下步的層析純化。
層析純化的第一步采用陽(yáng)離子交換介質(zhì)SP Sepharose XL， SP Sepharose XL介質(zhì)具有高載 量，快流速和易處理等特點(diǎn)，能快速有效地將plyG從超濾液中捕獲。上樣結(jié)束后，考慮到有利于下面的純化，采用20 mmol/L PB洗滌SP Sepharose XL層析柱步驟，再用20 mmol/L PB 1 mol/LNaCl洗脫蛋白。
層析第二步通過(guò)疏水相互作用介質(zhì)Phenyl Sepharose除去SP Sepharose XL洗脫蛋白峰中 殘留的雜質(zhì)和色素。用20 mmol/L PB 0.15 mmol/L NaCl 50%乙二醇可以有效從Phenyl Sepharose介質(zhì)上洗脫目的蛋白。
層析第三步利用凝膠層析Superdex 75除去少量的雜質(zhì)，并將緩沖液調(diào)整為磷酸鹽緩沖 液。經(jīng)過(guò)三歩層析純化后，回收率為46%，原液純度可達(dá)到95%以上(圖4)。進(jìn)行N端氨 基酸序列測(cè)定，序列測(cè)定結(jié)果表明N端氨基酸序列為MEIQK，與天然蛋白一致。
實(shí)施例5、 Y噬菌體裂解酶的活性檢測(cè)
將純化好的PlyG用Lowry法測(cè)蛋白濃度進(jìn)行定量，并取部分樣品進(jìn)行梯度稀釋。無(wú)毒炭 疽桿菌A15R用肉湯培養(yǎng)12h左右，制作吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定最適吸收波長(zhǎng)為0D6。。。取過(guò)夜 培養(yǎng)的無(wú)毒炭疽桿菌，離心收集菌體，1 XPBS(pH6)洗后重懸，并用l XPBS(pH6)稀釋，等 體積分裝，測(cè)定其初始0De。。。分別加入不同濃度的酶液，觀察其0De。。的下降情況，檢測(cè)對(duì)炭 疽桿菌的裂解情況。酶活性單位定義為以濃度lmg/mL的蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，按l :1在同體積的菌 液中加入同體積不同稀釋倍數(shù)的酶液，37°C，搖床溫育20min后，0D,下降至原值-半時(shí)的 酶液的稀釋倍數(shù)。酶的比活性約為1200U/mg。
權(quán)利要求
1、一種表達(dá)炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的方法。其特征在于以畢赤酵母作表達(dá)系統(tǒng)，將炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶基因插入酵母表達(dá)載體，構(gòu)建成新的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過(guò)隨機(jī)挑選和加壓篩選，獲得生產(chǎn)菌株G6，使γ噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中獲得表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物不含多余氨基酸。
2、 含有權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體、宿主菌、工程菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為pMEX9K。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述炭疽桿菌Y噬菌體裂解酶基因插入到pMEX9K的Sad和五co及I酶切位點(diǎn)間。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述工程菌為巴斯德畢赤酵 母尸/c/z/a戸加r/51 G6。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所用的誘導(dǎo)劑為甲醇，誘導(dǎo)濃度為終體積的0.5%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述工程菌的培養(yǎng)溫度為30'C， 誘導(dǎo)溫度為28-30°C。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述工程菌的誘導(dǎo)時(shí)間為48-60h。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)炭疽桿菌γ噬菌體裂解酶的方法。本發(fā)明采用畢赤酵母表達(dá)體系，利用已有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的表達(dá)載體pMEX9K(ZL02117906.9)，將炭疽桿菌噬菌體基因與pMEX9K連接，構(gòu)建成新的表達(dá)質(zhì)粒pMEXplyG，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化宿主菌巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115，經(jīng)過(guò)隨機(jī)挑選和加壓篩選，獲得生產(chǎn)菌株G6，使γ噬菌體裂解酶在畢赤酵母工程菌Pichia pastoris G6上清中獲得表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物不含多余氨基酸。經(jīng)離心、超濾、離子交換層析、疏水層析、凝膠層析獲得純度高于95％的γ噬菌體裂解酶。該酶對(duì)炭疽桿菌及萌發(fā)時(shí)的芽孢有裂解活性，可用于炭疽洗消劑、炭疽治療藥物的開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101319195SQ200710105978
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者玲 付, 候利華, 宋小紅, 張曉鵬, 曹曉梅, 曼 李, 李建民, 董大勇, 薇 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所;北京愛(ài)柯森倫生物工程科技有限公司