專利名稱：鼠兔家族瘦素蛋白及其cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及瘦素(l印tin)蛋白，尤其是極端冷環(huán)境壓力下的冷適應(yīng)動(dòng) 物鼠兔家族的痩素蛋白及含有完整編碼區(qū)序列的cDNA序列。
背景技術(shù)：
我國生物資源豐富，有效保護(hù)和利用本國特有資源，已成為推動(dòng)我國社會(huì) 經(jīng)濟(jì)發(fā)展的強(qiáng)大動(dòng)力。我國青藏高原上所特有的動(dòng)植物資源，在世界上是獨(dú)一 無二的。高寒、低氧、強(qiáng)紫外線輻射的極端壓力環(huán)境不僅給這里的動(dòng)植物的生 存帶來了挑戰(zhàn)，同時(shí)也在長期適應(yīng)進(jìn)化過程中賦予給這些特色動(dòng)植物以新的功 能或是原有功能的增加以滿足這種壓力環(huán)境下生存的需要。極端環(huán)境壓力下的 特色動(dòng)植物的優(yōu)勢抗環(huán)境壓力功能基因的保護(hù)和開發(fā)，具有極其重要的科研及 產(chǎn)品的開發(fā)價(jià)值，與普通環(huán)境下相同功能基因相比，往往具有突出的功能優(yōu)勢。鼠兔是青藏高原的優(yōu)勢物種，全世界共有26種鼠兔，只有2種分布于北 美洲的海拔3000米以上的高山地區(qū)，其余都分布于亞洲，其中全世界鼠兔的 80%以上集中于青藏高原及其周邊地區(qū)，可見青藏高原為鼠兔的生存提供了最 適宜的生存環(huán)境。就全球鼠兔分布來看，呈現(xiàn)共同的生存環(huán)境的特征生活在高海拔高緯度的寒冷地區(qū)。鼠兔家族進(jìn)化史告訴我們所有鼠兔進(jìn)化源于亞洲，在中新世(約500萬年前)白令海峽開放， 一部分鼠兔遷移到北美大陸，在亞 洲的鼠兔由于300萬年前至100萬年前這一期間的青藏高原的三次抬升及氣候 的頻繁的波動(dòng)，加速了鼠兔種類的分化，至此形成了現(xiàn)今的青藏高原上多種類 鼠兔分布特征。鼠兔分布的化石資料也顯示，隨著全球氣候的變暖，鼠兔的分 布范圍逐漸縮小，海拔逐漸增高?？梢娙蚍秶鷥?nèi)所有鼠兔都是冷適應(yīng)動(dòng)物的 典型代表。能量代謝的改變是鼠兔生活在寒冷高原環(huán)境下最明顯生理特征。鼠兔通常 表現(xiàn)為提高基礎(chǔ)代謝率以及非顫抖性產(chǎn)熱來增加能量消耗以對(duì)付這種高寒低 氧的環(huán)境壓力。瘦素(l印tin)蛋白是ob基因編碼的主要由白色脂肪細(xì)胞分 泌的激素，與分布于中樞神經(jīng)和外周組織中的l印tin受體結(jié)合，發(fā)揮多種重 要的生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，
物生殖發(fā)育，調(diào)節(jié)血壓，大腦和骨骼發(fā)育，傷口愈合，細(xì)胞分化增殖，參與造血作用，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等功能(Ahima R-S， Flier J-S (2000) 7r朋血 ^^/ocr/朋7 i^s力11:327 - 332)。瘦素功能的多樣性尤其在能量調(diào)節(jié)方面的 關(guān)鍵作用，也賦予瘦素(l印tin)更大的產(chǎn)品開發(fā)的價(jià)值。自1994年人ob 基因首次被克隆以來(Zhang Y， Proenca R， Maffei M， Barone M, Leopold L， Friedman J-M (1994) 7fe"re 372:425 - 432)，有關(guān)人ob基因生物工程產(chǎn)品 的開發(fā)和利用已深入到許多領(lǐng)域包括減肥藥物的開發(fā)以及減肥產(chǎn)品的深加工， 治療糖尿病藥物開發(fā)，治療高血壓藥物開發(fā)，治療脂肪肝藥物開發(fā)等等。隨著 對(duì)其功能認(rèn)識(shí)的不斷深入，關(guān)于l印tin產(chǎn)業(yè)化前景將更加廣闊。目前國內(nèi)外大多數(shù)l印tin產(chǎn)品的開發(fā)和利用的物質(zhì)基礎(chǔ)均來自于普通環(huán) 境下動(dòng)物體內(nèi)分離獲得，然而就l印tin這一冷環(huán)境壓力下的敏感蛋白來說， 從壓力環(huán)境下的特色動(dòng)物體內(nèi)分離出抗環(huán)境壓力的敏感基因作為特色動(dòng)物對(duì) 這一極端環(huán)境生態(tài)適應(yīng)機(jī)制的科學(xué)研究以及對(duì)其產(chǎn)品的開發(fā)和利用在國內(nèi)外 均處于空白。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供極端冷環(huán)境壓力下的冷適應(yīng)動(dòng)物鼠兔家族的瘦素 蛋白，以及含有該瘦素蛋白完整編碼區(qū)的cDNA序列，為今后開發(fā)痩素基因工 程產(chǎn)品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了一種瘦素蛋白，它為如下蛋白質(zhì)分子(i)或(ii):(i) 具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID N0:2中第1一146 位所示的成熟氨基酸序列；(ii) 在上述(i)的氨基酸序列經(jīng)過取代，缺失或疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸 衍生的蛋白質(zhì)且與(i)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。優(yōu)選蛋白質(zhì)分子(i i)具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 6 中第1一146位所示的成熟氨基酸序列；或蛋白質(zhì)分子(ii)具有SEQ ID N0:8 所示的氨基酸序列，或SEQ ID N0:8中第1一146位所示的成熟氨基酸序列； 或蛋白質(zhì)分子(ii)具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:IO 中第1一146位所示的成熟氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼上述瘦素蛋白的DNA分子。本發(fā)明選取了鼠兔家族中代表性的幾類鼠兔，分別來自于青藏高原的3
種以及內(nèi)蒙古草原的l種。分離克隆多種鼠兔的l印tincDNA序列目的在于揭 示鼠兔家族的l印tin的共性特征，為研究、開發(fā)和利用鼠兔家族l印tin資源 提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了來自內(nèi)蒙古草原Oc力"o朋A"rj'ca Z^/fb/Y/j'鼠兔的含有 完整編碼區(qū)的l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列。見SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。本發(fā)明提供了來自青藏高原&力oto;7a77"6r/ca鼠兔的含有完整編碼區(qū)的 l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列。見SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6。本發(fā)明提供了來自青藏高原^力W朋a cs/L "s鼠兔的含有完整編碼區(qū)的 l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列。見SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8。本發(fā)明提供了來自青藏高原ft7力W^7S s/Me"朋鼠兔的含有完整編碼區(qū) 的l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列。見SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10。本發(fā)明還提供了包含鼠兔l印tin基因的原核細(xì)胞表達(dá)體系、酵母細(xì)胞表 達(dá)體系、昆蟲動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系以及動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系。本發(fā)明實(shí)施選取了鼠兔家族中代表性的幾類鼠兔，分別來自于青藏高原 的3種以及內(nèi)蒙古草原的1種。分離克隆多種鼠兔的l印tincDNA序列目的在 于揭示鼠兔家族的l印tin的共性特征。本發(fā)明還將鼠兔家族l印tin的cDNA 序列與其他所有在Genbank數(shù)據(jù)庫中含有完整編碼區(qū)序列的脊椎動(dòng)物l印tin cDNA序列進(jìn)行全面的比對(duì)和進(jìn)化分析，確定了鼠兔家族l印tin蛋白中所特有 的適應(yīng)性功能進(jìn)化的20個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)；這20個(gè)變異位點(diǎn)可能就是鼠兔家 族l印tin蛋白比其他脊椎動(dòng)物l印tin蛋白具有功能優(yōu)勢的關(guān)鍵位點(diǎn)。因而我 們可以認(rèn)為鼠兔家族在與這種極端冷環(huán)境壓力的長期的適應(yīng)進(jìn)化過程中，冷 環(huán)境壓力敏感蛋白"l印tin蛋白發(fā)生了適應(yīng)性的功能的進(jìn)化，而這種 l印tin功能的改變或是功能的增強(qiáng)有助于鼠兔更好地耐受這種壓力環(huán)境。這 一結(jié)論也給我們一個(gè)重要啟示鼠兔家族l印tin蛋白這一特色資源蘊(yùn)含著巨 大的產(chǎn)品的開發(fā)潛力和價(jià)值。因此本次發(fā)明也首次提出和強(qiáng)調(diào)了應(yīng)該高度重視 這種特色資源，保護(hù)、開發(fā)和利用好鼠兔家族l印tin蛋白這種中國特色的資 源；并將鼠兔家族leptin蛋白用于生物工程產(chǎn)品開發(fā)。


圖1:鼠兔家族l印tin蛋白與其他脊椎動(dòng)物l印tin蛋白氨基酸序列多重比對(duì)
圖i為不含信號(hào)肽序列成熟l印tin蛋白的多序列比對(duì)。圖中加框部分為 鼠兔家族l印tin序列。(.)代表與第1條序列的氨基酸位點(diǎn)相同。圖中除鼠 兔家族及兔子l印tin序列之外的脊椎動(dòng)物l印tin序列均來自GenBank數(shù)據(jù)庫 中cDNA核苷酸序列推導(dǎo)而來。這些脊椎動(dòng)物l印tin cDNA的序列號(hào)為普通 鯉魚(Cyprinids carpio: AY547279)、 草鯉魚(Ctenopharyngodon idella: AY551335)、小鼠(Mus musculus:麗—008493)、大鼠(Rattus norvegicus: NM一013076)、大猩猩(Gorilla gorilla: GGU72872)、人(Homo sapiens: NM一000230)、羊(0vis aries: 0AU84247)、豬(Sus scrofa: NM—213840)、牛 (Bos t證us:歷—173928)、狗(Canis familiaris: AB020986)、喜瑪拉雅黑 熊(Ursus thibetanus japonicus: AB255164)、貓(Felis catus: AB041360)。圖2:人l印tiri蛋白空間結(jié)構(gòu)中受體結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)、激活受體關(guān)鍵位點(diǎn) 以及鼠兔家族l印tin蛋白特異適應(yīng)性功能進(jìn)化氨基酸變異位點(diǎn)分布情況。圖2顯示的為leptin蛋白分子空間結(jié)構(gòu)，leptin蛋白分子由4股螺旋 組成，標(biāo)記為Helix A， Helix B， Helix C， Helix D。 A)圖顯示所有與受體 結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)、受體激活的關(guān)鍵位點(diǎn)以及鼠兔家族l印tin蛋白特異適應(yīng)性 功能進(jìn)化的氨基酸變異位點(diǎn)在分子空間結(jié)構(gòu)中的分布情況。圖中藍(lán)色位點(diǎn)代表 與l印tin受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)；黃色位點(diǎn)代表激活leptin受體的關(guān)鍵位點(diǎn)； 綠色位點(diǎn)表示發(fā)生于鼠兔家族l印tin蛋白中的適應(yīng)性功能進(jìn)化的氨基酸變異 位點(diǎn)。B)圖只顯示了與受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。C)圖只顯示了激活受體的關(guān)鍵 位點(diǎn)。D)圖只顯示了發(fā)生于鼠兔家族l印tin蛋白分子中的特異適應(yīng)性功能進(jìn) 化的氨基酸變異位點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)驗(yàn)方法 1、基因克隆所有鼠兔cDNA片段克隆過程均按下述方法實(shí)施動(dòng)物麻醉后，施與斷頸(鼠兔類)和靜脈空氣拴塞(兔類)處死后，立即 解剖取白絲脂肪組織迅速投入液氮中，回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至-70。C低溫冰箱中長期 保存?zhèn)溆?。采用Invitrogen公司的TRIzol試劑進(jìn)行一步法提取組織總RNA。 經(jīng)大連寶生物公司的無RNase的DNase I參照說明書所述方法消化總RNA中 殘存的基因組。去除基因組DNA后的總RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定完 整性后，紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度后，采用大連寶生物公司的RNA PCR Kit (AMV) Ver3.0試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離鑒 定后，采用大連寶生物的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2. 0試劑 盒進(jìn)行膠回收純化目的片段。純化產(chǎn)物連接到大連寶生物公司的PMD-18T在載 體中，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌中，培養(yǎng)后挑取白色重組菌落，增菌培 養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切鑒定后，測序。經(jīng)Genbank數(shù)據(jù) 庫中BLAST程序進(jìn)行檢索確定是否為目的克隆。序列經(jīng)DNASTAR軟件尋找開放 閱讀框并翻譯為氨基酸序列。采用SignalP軟件預(yù)測信號(hào)肽序列。利用SCRATCH 服務(wù)器進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。用SWISS-MOELD Server服務(wù)器進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。 用spdbv3. 7軟件進(jìn)行三位結(jié)構(gòu)觀察。 2、進(jìn)化分析分析過程采用無信號(hào)肽序列的成熟蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行 分析。為全面揭示鼠兔ob基因序列進(jìn)化，我們將GenBank中具有完整編碼區(qū) 序列的脊椎動(dòng)物的代表性物種的leptin序列一同進(jìn)行分析比較。我們收集了 以下幾種物種的l印tin序列普通鯉魚(Cyprinids carpio: AY547279)、草 鯉魚 (Ctenopharyngodon idella: AY551335)、 小鼠 (Mus musculus: NM—008493)、大鼠(Rattus norvegicus: NM—013076)、大猩猩(Gorilla gorilla: GGU72872)、人(Homo sapiens: NM—000230)、羊(0vis aries: 0AU84247)、豬 (Sus scrofa: NM—213840)、牛(Bos taurus: NM—173928)、狗(Canis familiaris: AB020986)、喜瑪拉雅黑熊(Ursus thibetanus japonicus: AB255164)、貓 (Felis catus: AB041360)。ModelTest 3. 7和PAUP*4. OblO軟件用于確定最佳的進(jìn)化分析模型以及 計(jì)算相關(guān)的參數(shù)用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。我們采用PHYLIP進(jìn)化分析軟件分別從 核苷酸序列和氨基酸序列利用距離法(neighbor-joining, NJ)、最大簡約法 (maxium parsimony, MP)禾口最大似然法(maxium likelihood. ML)構(gòu)建系 統(tǒng)進(jìn)化樹。利用RRTree軟件進(jìn)行相對(duì)率計(jì)算以評(píng)價(jià)ob基因的進(jìn)化速率。采用PAML進(jìn)化分析軟件中的C0DEML程序進(jìn)行了基因的選擇壓力分析，以 確定環(huán)境壓力和ob基因進(jìn)化的關(guān)系，以及確定鼠兔家族l印tin序列中發(fā)生適 應(yīng)性功能進(jìn)化的關(guān)鍵位點(diǎn)。實(shí)施例1. 內(nèi)蒙古草原Oc力oz^朋c/a"rica力ec/fb/Y/j'鼠兔的含有完整編 碼區(qū)的l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列
發(fā)明實(shí)施過程中，提取內(nèi)蒙古草原Ochotonadauricabedfordi鼠兔體內(nèi) 白色脂肪組織總RNA，設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增鼠兔家族含有完整編碼區(qū)的l印tin cDNA 片段的特異性引物PKLEPF0R和PKLEPREV (序列分別見SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4)。利用RT-PCR方法擴(kuò)增cDNA片段，經(jīng)電泳膠回收純化目的片段后，連 接入PMD-18T克隆載體(大連寶生物公司)中，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)菌中，過夜培養(yǎng)后，挑取白色重組菌落，增菌培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA經(jīng)Pst I和EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切鑒定插入片段后，送上海生工生物工程公司測 序。本實(shí)施例克隆出一段含有完整編碼區(qū)的l印tin cDNA序列，共646bp， 命名為DwrstL印基因。經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫檢索，證實(shí)所克隆的DwrstL印基因 為l印tin基因。用DNASTAR軟件尋找開放閱讀框并推導(dǎo)出氨基酸序列。讀碼 框位于該序列的11-514bp之間，共504bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TGA。蛋白質(zhì)序列顯示該鼠兔l印tin蛋白由167個(gè)氨基酸組成，SignalP軟 件分析顯示在其N末端含有一個(gè)21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。成熟蛋白 由146個(gè)氨基酸組成，預(yù)測的分子量為16kDa。預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)為四股超螺旋 結(jié)構(gòu)。DwrstL印基因的核苷酸序列見SEQ ID N0:1，其編碼區(qū)氨基酸序列見 SEQ ID NO:2。實(shí)施例2.青藏高原^C力0"/7S /7i/Z72^CS鼠兔的含有完整編碼區(qū)的l印tincDNA核苷酸序列及氨基酸序列本發(fā)明實(shí)施過程中提取青藏高原^力Oto/7s t7"fo^'CS鼠兔體內(nèi)白色脂肪組織總RNA，擴(kuò)增引物及克隆方法同實(shí)施例1所示。本發(fā)明克隆出一段含有完整編碼區(qū)的l印tincDNA序列，共646bp，命名 為NubrL印基因。序列分析方法與發(fā)明1中相同。該基因讀碼框位于11-514bp 之間，共504bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列顯 示該鼠兔l印tin蛋白由167個(gè)氨基酸組成，在其N末端含有一個(gè)21個(gè)氨基 酸組成的信號(hào)肽序列。成熟蛋白由146個(gè)氨基酸組成，預(yù)測的分子量為16kDa。 預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)為四股超螺旋結(jié)構(gòu)。NubrL印基因的核苷酸序列見SEQ IDN0:5， 其編碼區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID N0:6。實(shí)施例3.青藏高原Oc力oto朋cs/lsm鼠兔的含有完整編碼區(qū)的l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列 本發(fā)明實(shí)施過程中提取青藏高原Oc力"朋a 鼠兔體內(nèi)白色脂肪組織總RNA，擴(kuò)增引物及克隆方法同實(shí)施例l所示。本發(fā)明克隆出一段含有完整編碼區(qū)的l印tincDNA序列，共646bp，命名 為CansL印基因。序列分析方法與發(fā)明1中相同。該基因讀碼框位于l卜514bp 之間，共504bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列顯 示該鼠兔leptin蛋白由167個(gè)氨基酸組成，在其N末端含有一個(gè)21個(gè)氨基 酸組成的信號(hào)肽序列。成熟蛋白由146個(gè)氨基酸組成，預(yù)測的分子量為16kDa。 預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)為四股超螺旋結(jié)構(gòu)。CansL印基因的核苷酸序列見SEQ ID NO: 7， 其編碼區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID N0:8。實(shí)施例4.青藏高原ft;力oto77a a/7"e"朋鼠兔的含有完整編碼區(qū)的l印tin cDNA核苷酸序列及氨基酸序列本發(fā)明實(shí)施過程中提取青藏高原^力"朋a a/Mecte/7鼠兔體內(nèi)白色脂肪組 織總RNA，擴(kuò)增引物及克隆方法同實(shí)施例1所示。本發(fā)明克隆出一段含有完整編碼區(qū)的l印tincDNA序列，共646bp，命名 為AnneL印基因。序列分析方法與發(fā)明1中相同。該基因讀碼框位于11-514bp 之間，共504bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列顯 示該鼠兔l印tin蛋白由167個(gè)氨基酸組成，在其N末端含有一個(gè)21個(gè)氨基 酸組成的信號(hào)肽序列。成熟蛋白由146個(gè)氨基酸組成，預(yù)測的分子量為16kDa。 預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)為四股超螺旋結(jié)構(gòu)。A皿eL印基因的核苷酸序列見SEQ IDN0:9， 其編碼區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID N0:10。實(shí)施例5.確定了發(fā)生于鼠兔家族l印tin蛋白所特有的適應(yīng)性功能進(jìn)化關(guān) 鍵變異位點(diǎn)本發(fā)明實(shí)施過程中，通過將鼠兔家族leptin與其他脊椎動(dòng)物的l印tin編 碼區(qū)的cDNA序列進(jìn)行全面的比對(duì)及進(jìn)化分析，得出了一條重要的結(jié)論鼠兔 家族在這種極端冷環(huán)境壓力下長期的適應(yīng)進(jìn)化過程中，l印tin蛋白發(fā)生了適 應(yīng)性的功能的進(jìn)化，而這種l印tin功能的改變或是功能的增強(qiáng)有助于鼠兔更 好地耐受這種壓力環(huán)境。這一重要結(jié)論也使我們首次清楚地認(rèn)識(shí)到鼠兔家族 l印tin蛋白這種特色資源的重要性及其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)潛在價(jià)值，也為今后的保 護(hù)、開發(fā)、利用鼠兔家族l印tin蛋白資源提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明實(shí)施中確定下面20個(gè)僅發(fā)生于鼠兔家族l印tin蛋白中的特異的適
應(yīng)性功能進(jìn)化的氨基酸變異位點(diǎn)(以無信號(hào)肽序列的由146個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白來計(jì)算變異位點(diǎn))第2位由Pro變?yōu)?^r，第4位由Gin變?yōu)?>/ ， 第7位由Gin變?yōu)閊r《，第28位由Gin變?yōu)闅vs，第29位由Ser變?yōu)槿衧， 第36位由Val變?yōu)閆/e，第44位由Gly變?yōu)锳/a，第59位由Ala變?yōu)?amp;7， 第60位由Val變?yōu)閆ew，第62位由Gin變?yōu)閆^，第63位由Gin變?yōu)闅vs， 第92位由Phe變?yōu)镴7a，第94位由Lys變?yōu)?7/7，第95位由Ser變?yōu)?7力 第98位由Leu變?yōu)槭瑀o，第103位由Gly變?yōu)閥^/ ，第106位由Thr變?yōu)?^， 第108位由Asp變?yōu)閥l9/7，第111位由Gly變?yōu)?7"，第113位由Val變?yōu)閕7e (注斜體加黑的氨基酸殘基為鼠兔家族l印tin蛋白的氨基酸殘基)。圖1 顯示了脊椎動(dòng)物l印tin蛋白的氨基酸多重組列比對(duì)結(jié)果，幫助識(shí)別變異的位 點(diǎn)。對(duì)目前已有的關(guān)于l印tin蛋白與其受體相互作用的研究資料(/fo'W "e/ (2004) 279:41038 - 41046; U^> obcrj'/7o 7(2004) 18:150 - 161; 6b j'(2005) 118:2519 - 2527; /所o7 O e歷(2006) 281:15496 - 15504)并結(jié) 合本次發(fā)明中的鼠兔家族l印tin蛋白特異的適應(yīng)性功能進(jìn)化的關(guān)鍵變異位點(diǎn) 分析表明在lepUn蛋白與受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)以及激活受體的關(guān)鍵位點(diǎn)中， 鼠兔家族l印tin蛋白與其他脊椎動(dòng)物l印tin蛋白具有高度保守性，也就是說 在這些與受體結(jié)合和激活受體的關(guān)鍵位點(diǎn)中鼠兔家族l印tin很少發(fā)生適應(yīng)性 功能進(jìn)化的變異，而在l印tin功能重要片段85-119位點(diǎn)之間 (^ht/ocj^70^^7(1997) 138:1413 - 1418; 尸ept (1999) 85:93 - 100;/^3z)etes (1999) 48:2204 - 2209; / 5io CAe/z (1998) 273:35245 - 35249)， 鼠兔家族l印tin蛋白有9個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化的氨基酸變異。圖2顯示 了 l印tin蛋白中受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，激活受體的關(guān)鍵位點(diǎn)以及鼠兔家族 l印tin蛋白發(fā)生特異的適應(yīng)性功能進(jìn)化的氨基酸變異位點(diǎn)在l印tin分子空間 結(jié)構(gòu)中的分布。實(shí)施例6.在E. coli中表達(dá)重組l印tin蛋白 制備步驟1)原核表達(dá)載體制備用含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)序列引物，擴(kuò)增 l印tin成熟蛋白編碼區(qū)序列(不含信號(hào)肽序列)，采用相同的內(nèi)切酶EcoR I/Xho I消化pGEX-4T-l原核表達(dá)載體(GE公司)，將擴(kuò)增片段連接入載體中，轉(zhuǎn)化 BL21大腸桿菌，鑒定重組菌的插入片段的方向及序列。2) 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白將含有目的片段的重組體pGEX-4T-1-L印的BL21 大腸桿菌進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，再以1/100比例稀釋于LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培 養(yǎng)至0D600值達(dá)O.S — l.O時(shí)，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)繼續(xù)培養(yǎng) lh-4h。3) 融合蛋白的純化將培養(yǎng)后菌液離心回收細(xì)胞，重新溶解于MTPBS液 中，低溫超聲波破碎細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液經(jīng)glutathionS印harose4B進(jìn)行純 化回收。4) 去除GST標(biāo)簽采用凝血酶切除融合肽中GST標(biāo)簽。采用含谷胱甘肽 的瓊脂糖顆粒吸附切割下來的GST或含有GST的融合蛋白，洗脫液為純的不含 GST的重組l印tin蛋白。實(shí)施例7.在真核細(xì)胞中表達(dá)l印tin蛋白 制備步驟1) 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建用含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)序列引物，擴(kuò)增 l印tin蛋白完整編碼區(qū)序列(含信號(hào)肽序列)，采用相同內(nèi)切酶EcoR I/Xho I 消化真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (Invitrogen公司)，將擴(kuò)增片段連接入載體中， 轉(zhuǎn)化DH5cx大腸桿菌，鑒定重組菌的插入片段方向及序列。2) 真核細(xì)胞表達(dá)37。C過夜培養(yǎng)COS-1細(xì)胞(DEME， 10%胎牛血清，10Q/。C02)， 采用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，換用Opti-MEM培養(yǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞90h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中含有分泌的l印tin蛋白。采用Western bloting鑒定表達(dá)情況。
權(quán)利要求
1.一種瘦素蛋白，它為如下蛋白質(zhì)分子(i)或(ii)(i)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO2中第1-146位所示的成熟氨基酸序列；(ii)在上述(i)的氨基酸序列經(jīng)過取代，缺失或疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(i)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘦素蛋白，其特征在于，蛋白質(zhì)分子(ii)具有 SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列，或SEQ ID N0:6中第1 — 146位所示的成熟 氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘦素蛋白，其特征在于，蛋白質(zhì)分子(ii)具有 SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，或SEQ ID N0:8中第1一146位所示的成熟氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘦素蛋白，其特征在于，蛋白質(zhì)分子(ii)具有 SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 10中第1一146位所示的成 熟氨基酸序列。
5. —種編碼權(quán)利要求1所述鼠兔家族痩素蛋白的DNA分子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其編碼序列具有SEQ ID N0:1中第11一514bp所示的核苷酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其編碼序列具有SEQ ID N0:5中第11一514bp所示的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其編碼序列具有SEQ ID N0:7中第11一514bp所示的核苷酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其編碼序列具有SEQ ID N0:9中第11一514bp所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的瘦素蛋白及其編碼的DNA序列。這類新的瘦素蛋白來自極端冷環(huán)境壓力下的冷適應(yīng)動(dòng)物鼠兔家族。本發(fā)明為保護(hù)、開發(fā)和利用鼠兔家族瘦素蛋白這種中國特色的資源，并將鼠兔家族瘦素蛋白用于生物工程產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101113175SQ200710103660
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者潔 楊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所