專利名稱：創(chuàng)傷弧菌的一管法半巢式pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用一管法半巢式PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，進(jìn)一步涉及使用一管法半巢式PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種人獸共患的病原，主要分布于世界各地的暖水性近海與海灣的海水、海底沉積物及動(dòng)物體內(nèi)(Pfeffer et al，2003；鄭國(guó)興等，1999)，可通過(guò)進(jìn)食生的或未熟透的海鮮食物或通過(guò)破損的皮膚接觸海水而引發(fā)感染，能強(qiáng)烈引起人類(Nascimento et al，2001)和多種水生動(dòng)物如石碟魚(yú)(沈志強(qiáng)等，2001)、軍曹魚(yú)(簡(jiǎn)紀(jì)常等，2003)、三疣梭子蟹(何偉賢，2004)等的死亡率極高的敗血癥與膿毒癥，由于該細(xì)菌易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，目前還沒(méi)有治療這一嚴(yán)重疾病的理想方法，因此，創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)將是促使人類健康和水產(chǎn)品健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵?，F(xiàn)有的創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)手段主要有傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)與生化鑒定、ELISA技術(shù)、DNA雜交技術(shù)、分子探針雜交技術(shù)、普通雙引物PCR技術(shù)等，這些方法有的具有費(fèi)時(shí)費(fèi)工和專業(yè)性要求高，有的具有操作難度大，有的具有敏感度低等缺點(diǎn)，很難在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中實(shí)際推廣，已明顯防礙了因創(chuàng)傷弧菌而引發(fā)的重大流行性疾病的防治。
半巢式PCR是通過(guò)3條特異性引物而實(shí)現(xiàn)的，其中一條為公用引物，另外兩條分別為內(nèi)外側(cè)引物，這一方法明顯提高了PCR檢測(cè)技術(shù)的特異性，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外病害研究學(xué)者進(jìn)行病原檢測(cè)的首選方法，因此，該技術(shù)在細(xì)菌性病原的檢測(cè)中已得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的一管法半巢式PCR檢測(cè)試劑盒，特別是提供3種創(chuàng)傷弧菌特異性引物Vvg1、Vvg2、Vvg3，并提供一種使用一管法半巢式PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法。
本發(fā)明利用創(chuàng)傷弧菌gyrB基因的3個(gè)特異性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)了半巢式PCR的3條寡聚核苷酸引物(Vvg1、Vvg2、Vvg3)，在高保真的PCR聚合酶系統(tǒng)中，首先用Vvg1和Vvg2進(jìn)行擴(kuò)增數(shù)個(gè)循環(huán)，可產(chǎn)生一定量的700bp的片段，然后再加入引物Vvg3，這時(shí)，兩對(duì)引物(Vvg1和Vvg2、Vvg1和Vvg3)均可對(duì)自身的模板進(jìn)行有效的擴(kuò)增，但Vvg1和Vvg3這一對(duì)引物的擴(kuò)增效率要大于前一對(duì)引物(Vvg1和Vvg2)的擴(kuò)增效率，這樣就確保了產(chǎn)物中700bp和350bp的2條片段的終產(chǎn)量基本相同，以此達(dá)到檢測(cè)的高靈敏和高準(zhǔn)確度。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種一管法半巢式PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，包括(1)DNA提取試劑含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B；試劑A含有NaCl 200～350mmol/L，三羥甲基氨基甲烷50～100mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二鈉50～100mmol/L；試劑B含有濃度為5～10％的十二烷基磺酸鈉水溶液；(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑C和反應(yīng)引物試劑D和E；試劑C包括10×反應(yīng)緩沖液5μL、500～1000μmol L-1的dNTPs(四種脫氧核苷酸等濃度的混合物)、1～5mmol L-1的MgCl2，1～2個(gè)單位的熱聚合酶和適量的滅菌超純水；試劑D包括2種引物，濃度均為5～20μmol L-1，這里的引物特指Vvg1(5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’)Vvg2(5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’)試劑E包括1種引物，其濃度為10～30μmol L-1，這里的引物特指Vvg3(5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’)(3)電泳和顯色試劑，包括試劑F、試劑G、試劑H和試劑I；試劑F為20-50倍電泳緩沖液，含三羥基甲基氨基甲烷——醋酸和乙二胺四乙酸二鈉，濃度分別為0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；試劑G含0.1～0.5g瓊脂糖；試劑HNucleic acid ClearDNA stain試劑I標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000使用上述一管法半巢式PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的試劑盒檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法包括下列步驟1、樣品處理取0.5～5克樣品(水樣1～5ml)，用50～1000μL試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻，1000～3000g離心3～10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，8000～15000g離心3～10分鐘，棄上清；
2、DNA提取用50～150μL試劑A再次懸浮沉淀，并加入5～10μL試劑B，混勻，室溫放置5分鐘以上，沸水浴中保溫10～30分鐘；8000～15000g離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，并加入上清2/3體積的異丙醇；混勻后室溫放置10分鐘，8000～15000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于10～50μL滅菌雙蒸水，即制成了DNA提取液；3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增取0.5～2μL DNA提取液和40～45μL試劑C、1～2μL試劑D混合；在熱循環(huán)儀上按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增首先以94℃預(yù)變性1～4min；接著以92～95℃變性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，共擴(kuò)增5～15個(gè)循環(huán)；加入1～2μL試劑E，以92～95℃變性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，再擴(kuò)增20～40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5～10min，4℃保存；4、電泳和顯色檢測(cè)將試劑F稀釋成1倍的電泳緩沖液，取10～40mL的1倍電泳緩沖液和試劑G充分混勻后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平電泳槽制膠，凝固后加入適量的1倍電泳緩沖液，使液面高于膠面0.5～2mm左右；取5～20μL擴(kuò)增后的樣品與0.8～4μL試劑H在保鮮膜上混合，靜置5～10min以上，將此混合樣品加于上述膠孔中，同時(shí)，在另一膠孔中加入1～5μL的試劑I；50～100V電泳20～30min；紫外光下檢測(cè)，如果同時(shí)有一條700核苷酸對(duì)和一條350的核苷酸對(duì)條帶，說(shuō)明樣品已被創(chuàng)傷弧菌感染或污染；如果樣品中只有一條350核苷酸對(duì)條帶，則需要用引物Vvg1和Vvg3做另一擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，如果樣品中能產(chǎn)生一條700核苷酸對(duì)的條帶，同樣說(shuō)明樣品有創(chuàng)傷弧菌感染或污染；反之則沒(méi)有。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、目前，針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的PCR檢測(cè)，都是雙引物的普通PCR，本發(fā)明首次利用半巢式PCR實(shí)現(xiàn)了該病原的特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)。
2、標(biāo)準(zhǔn)的半巢式PCR需要分別在2個(gè)不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行2次擴(kuò)增，從采集樣品到讀出檢測(cè)結(jié)果所需的檢測(cè)時(shí)間在1天左右。通過(guò)條件優(yōu)化，本發(fā)明在1個(gè)反應(yīng)體系中經(jīng)過(guò)1次擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了半巢式PCR，從采集樣品到讀出檢測(cè)結(jié)果所需的檢測(cè)時(shí)間在4個(gè)小時(shí)之內(nèi)，提高了半巢式PCR的檢測(cè)效率。


圖1是紫外光下檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌靈敏度效果圖。M試劑I；1106個(gè)菌體/ml樣品；2105個(gè)菌體/ml樣品；3104個(gè)菌體/ml樣品；4103個(gè)菌體/ml樣品；5102個(gè)菌體/ml樣品；6101個(gè)菌體/ml樣品；7100個(gè)菌體/ml樣品；8和9空白樣品。
圖2是對(duì)環(huán)境海水樣品中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)效果圖。M試劑I；1海水樣品；20.22μm濾膜過(guò)濾海水樣品；3未加模板擴(kuò)增樣品；4ddH2O樣品。
圖3是對(duì)蝦消化道中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)效果圖。M試劑I；1對(duì)蝦消化道樣品；2未加模板擴(kuò)增樣品；3ddH2O樣品。
具體實(shí)施例方式
下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例一、檢測(cè)對(duì)創(chuàng)傷弧菌靈敏度的測(cè)試，按下列步驟進(jìn)行1、通過(guò)顯微計(jì)數(shù)法確定創(chuàng)傷弧菌原液濃度為106個(gè)菌體/ml；2、將上述原液作梯度稀釋為105個(gè)菌體/ml、104個(gè)菌體/ml、103個(gè)菌體/ml、102個(gè)菌體/ml、101個(gè)菌體/ml和100個(gè)菌體/ml；3、每個(gè)樣品取1ml，10000g離心3分鐘，棄上清；4、用60μL試劑A(NaCl 250mmol/L，三羥甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二鈉50mmol/L)懸浮沉淀，并加入8μL試劑B(8％的十二烷基磺酸鈉水溶液)，混勻，室溫放置5分鐘以上，沸水浴中保溫15分鐘；11000g離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，并加入50μL異丙醇；混勻后室溫放置10分鐘，12000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于30μL滅菌雙蒸水，即制成了DNA提取液；5、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增取1μL DNA提取液和22μL試劑C(10×反應(yīng)緩沖液5μL、800μmol L-1的dNTPs、2mmol L-1的MgCl2，2個(gè)單位的熱聚合酶和適量的滅菌超純水)、1μL試劑D(10μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在熱循環(huán)儀上按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增首先以94℃預(yù)變性4min；接著以93℃變性1.5min，62℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共擴(kuò)增8個(gè)循環(huán)；加入1μL試劑E(8μmol L-1的Vvg3)，以93℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1.5min，再擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min，4℃保存；
6、電泳和顯色檢測(cè)將試劑F稀釋成1倍的電泳緩沖液，取25mL的1倍電泳緩沖液和試劑G(0.3g瓊脂糖)充分混勻后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平電泳槽制膠，凝固后加入適量的1倍電泳緩沖液，使液面高于膠面0.5mm左右；取10μL擴(kuò)增后的樣品與2μL試劑H在保鮮膜上混合，靜置15min，將此混合樣品加于上述膠孔中，同時(shí)，在另一膠孔中加入3μL的試劑I；60V電泳25min；紫外光下檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，除101個(gè)菌體/ml樣品的兩條帶(350bp和700bp)較弱外，其它5個(gè)濃度梯度(106~102)均有明顯的700bp和350bp的兩條帶。
從檢測(cè)結(jié)果中可以得出結(jié)論本發(fā)明所提供的檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的試劑盒的檢測(cè)極限可達(dá)10個(gè)菌體/ml。
實(shí)施例二、按下列步驟對(duì)環(huán)境海水樣品中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)1、從?？谀澈^(qū)取海水3ml，10000g離心10分鐘，棄上清，用50μL試劑A(NaCl 250mmol/L，三羥甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二鈉50mmol/L)懸浮樣品，并將樣品充分混勻；2、加入5μL試劑B(8％的十二烷基磺酸鈉水溶液)，混勻，室溫放置8分鐘以上，沸水浴中保溫20分鐘；12000g離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，并加入40μL異丙醇；混勻后室溫放置10分鐘，12000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于20μL滅菌雙蒸水，即制成了DNA提取液；
3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增取3μL DNA提取液和43μL試劑C(10×反應(yīng)緩沖液5μL、1000μmol L-1的dNTPs、2.5mmol L-1的MgCl2，1.5個(gè)單位的熱聚合酶和適量的滅菌超純水)、2μL試劑D(10μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在熱循環(huán)儀上按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增首先以94℃預(yù)變性4min；接著以93℃變性1min，61℃退火1min，72℃延伸1.5min，共擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；加入2μL試劑E(10μmol L-1的Vvg3)，以93℃變性1min，62℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，再擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存；4、電泳和顯色檢測(cè)將試劑F稀釋成1倍的電泳緩沖液，取30mL的1倍電泳緩沖液和試劑G(0.3g瓊脂糖)充分混勻后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平電泳槽制膠，凝固后加入適量的1倍電泳緩沖液，使液面高于膠面0.5mm左右；取10μL擴(kuò)增后的樣品與2μL試劑H在保鮮膜上混合，靜置10min以上，將此混合樣品加于上述膠孔中，同時(shí)，在另一膠孔中加入3μL的試劑I；60V電泳40min；紫外光下檢測(cè)，明顯可見(jiàn)一條700核苷酸對(duì)和一條350的核苷酸對(duì)條帶(見(jiàn)圖2)，表明該水域樣品中含有創(chuàng)傷弧菌。
實(shí)施例三、按下列步驟對(duì)蝦消化道中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)1、從市場(chǎng)購(gòu)得養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦500g(體長(zhǎng)為20cm左右)，隨機(jī)取2尾作為檢測(cè)樣品，解剖分離樣品的消化道，轉(zhuǎn)入5ml無(wú)菌離心管中，加入1000μL試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻，1500g離心10分鐘；取上清轉(zhuǎn)管，12000g離心8分鐘，棄上清；
2、用50μL試劑A(NaCl 250mmol/L，三羥甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二鈉50mmol/L)懸浮樣品，并將樣品充分混勻，加入5μL試劑B(10％的十二烷基磺酸鈉水溶液)，混勻，室溫放置5分鐘以上，沸水浴中保溫25分鐘；10000g離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，并加入40μL異丙醇；混勻后室溫放置10分鐘，12000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于30μL滅菌雙蒸水，即制成了DNA提取液；3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增取2μL DNA提取液和50μL試劑C(10×反應(yīng)緩沖液5μL、1000μmol L-1的dNTPs、2.5mmol L-1的MgCl2，1.5個(gè)單位的熱聚合酶和適量的滅菌超純水)、2μL試劑D(15μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在熱循環(huán)儀上按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min；接著以93℃變性1min，60℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；加入2μL試劑E(10μmol L-1的Vvg3)，以93℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，再擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存；4、電泳和顯色檢測(cè)將試劑F稀釋成1倍的電泳緩沖液，取25mL的1倍電泳緩沖液和試劑G(0.25g瓊脂糖)充分混勻后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平電泳槽制膠，凝固后加入適量的1倍電泳緩沖液，使液面高于膠面0.5mm左右；取10μL擴(kuò)增后的樣品與2μL試劑H在保鮮膜上混合，靜置10min以上，將此混合樣品加于上述膠孔中，同時(shí)，在另一膠孔中加入3μL的試劑I；60V電泳40min；紫外光下檢測(cè)，明顯可見(jiàn)一條700核苷酸對(duì)和一條350的核苷酸對(duì)條帶(見(jiàn)圖3)，結(jié)果表明該對(duì)蝦樣品已被創(chuàng)傷弧菌污染。
權(quán)利要求
1.一種一管法半巢式PCR檢測(cè)試劑盒，包括(1)DNA提取試劑含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B；試劑A含有NaCl 200～350mmol/L，三羥甲基氨基甲烷50～100mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二鈉50～100mmol/L；試劑B含有濃度為5～10％的十二烷基磺酸鈉水溶液；(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑C和反應(yīng)引物試劑D和E； 試劑C包括10×反應(yīng)緩沖液5μL、500～1000μmol L-1的dNTPs(四種脫氧核苷酸等濃度的混合物)、1～5mmol L-1的MgCl2，1～2個(gè)單位的熱聚合酶和適量的滅菌超純水；試劑D包括引物Vvg1和Vvg2，濃度均為5～20μmol L-1，Vvg1特指(5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’)；Vvg2特指(5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’)；試劑E包括引物Vvg3，其濃度為10～30μmol L-1，Vvg3特指(5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’)；(3)電泳和顯色試劑，包括試劑F、試劑G、試劑H和試劑I；試劑F為20-50倍電泳緩沖液，含三羥基甲基氨基甲烷--醋酸和乙二胺四乙酸二鈉，濃度分別為0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；試劑G含0.1～0.5g瓊脂糖；試劑HNucleic acid ClearDNA stain試劑I標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000。
2.一種使用權(quán)利要求1中的試劑盒檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法，包括下列步驟1)、樣品處理取0.5～5克樣品，用50～1000μL試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻，1000～3000g離心3～10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，8000～15000g離心3～10分鐘，棄上清；2)、DNA提取用50～150μL試劑A再次懸浮沉淀，并加入5～10μL試劑B，混勻，室溫放置5分鐘以上，沸水浴中保溫10～30分鐘；8000～15000g離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)管，并加入上清2/3體積的異丙醇；混勻后室溫放置10分鐘，8000～15000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于10～50μL滅菌雙蒸水，即制成了DNA提取液；3)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增取0.5～2μL DNA提取液和40～45μL試劑C、1～2μL試劑D混合；在熱循環(huán)儀上按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增首先以94℃預(yù)變性1～4min；接著以92～95℃變性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，共擴(kuò)增5～15個(gè)循環(huán)；加入1～2μL試劑E，以92～95℃變性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，再擴(kuò)增20～40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5～10min，4℃保存；4)、電泳和顯色檢測(cè)將試劑F稀釋成1倍的電泳緩沖液，取10～40mL的1倍電泳緩沖液和試劑G充分混勻后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平電泳槽制膠，凝固后加入適量的1倍電泳緩沖液，使液面高于膠面0.5～2mm左右；取5～20μL擴(kuò)增后的樣品與0.8～4μL試劑H在保鮮膜上混合，靜置5～10min以上，將此混合樣品加于上述膠孔中，同時(shí)，在另一膠孔中加入1～5μL的試劑I；50～100V電泳20～30min；紫外光下檢測(cè)，如果同時(shí)有一條700核苷酸對(duì)和一條350的核苷酸對(duì)條帶，說(shuō)明樣品已被創(chuàng)傷弧菌感染或污染；如果樣品中只有一條350核苷酸對(duì)條帶，則需要用引物Vvg1和Vvg3做另一擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，如果樣品中能產(chǎn)生一條700核苷酸對(duì)的條帶，同樣說(shuō)明樣品有創(chuàng)傷弧菌感染或污染；反之則沒(méi)有。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法，其特征在于所述樣品為1～5ml水樣樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的一管法半巢式PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。試劑盒包括(1)DNA提取試劑含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B；(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑C和反應(yīng)引物試劑D和E，試劑D中的特異引物Vvg1為5′－CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC－3′，Vvg2為5′－GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT－3′，試劑E中的特異引物Vvg3為5′－AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT－3′；(3)電泳和顯色試劑，包括試劑F、試劑G、試劑H和試劑I。檢測(cè)方法包括(1)樣品處理；(2)DNA提??；(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增；(4)電泳和顯色檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)速度快，特異性強(qiáng)、靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101082063SQ200710100758
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者謝珍玉, 周永燦, 馮永勤 申請(qǐng)人:海南大學(xué) 被以下專利引用 (1),