專利名稱：：與腫瘤轉移相關蛋白prl-3特異性結合的12肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及利用噬菌體展示文庫技術篩選能與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的多肽的方法，具體地說，是應用隨機12肽噬菌體展示文庫篩選與PRL-3特異性結合的噬菌體，得到能夠影響PRL-3磷酸酶活性的12肽序列。
背景技術：
：從原位生長的腫瘤到轉移的腫瘤這個轉變，即腫瘤轉移，是腫瘤發(fā)生過程中最危險的變化。它包含許多為完成腫瘤轉移而進行的一系列復雜事件[RidleyA.轉移的分子開關.Nature,406:466-467，2000]。近來，Zeng和他的同事發(fā)現(xiàn)中國倉鼠卵巢細胞穩(wěn)定地表達PRL-3，顯示出增強的活動性，入侵活性和誘導裸鼠轉移腫瘤形成。這些發(fā)現(xiàn)為將PRL-3作為腫瘤轉移的早期診斷和藥物開發(fā)的新靶點提供了依據(jù)，因為現(xiàn)在幾乎沒有腫瘤轉移的治療耙點?，F(xiàn)有噬菌體展示技術是對純化了的蛋白進行篩選，得到與該蛋白特異結合的寡肽或抗體。在此基礎上我們運用噬菌體展示技術對細胞表面抗原進行篩選，通過這種方法可以得到對細胞表面特異結合的寡肽分子。我們的方案克服了以往細胞篩選中的一些問題，主要是細胞表面成分復雜而且未知，細胞篩選的非特異性較大，背景值高，而且轉移與非轉移腫瘤細胞間細胞表面差異小。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是應用噬菌體展示文庫技術對PRL-3進行篩選，以獲得能與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽。因為有許多證據(jù)表明PRL-3與腫瘤轉移相關，所以它是潛在的腫瘤轉移早期診斷和藥物開發(fā)的新靶點。本發(fā)明應用12肽噬菌體展示文庫對PRL-3進行了4輪篩選，獲得了能與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，其氨基酸序列如下Gln-Tyr—Thr-Trp"Ile—Phe—Pro~Pro—Met-Gly—Tyr-Gln。本發(fā)明獲得的12肽能夠與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合，并且能夠影響PRL-3的磷酸酶活性。與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異結合的12肽的篩選和鑒定包括如下步驟第一、經(jīng)過對人再生肝臟磷酸酶一3(PRL-3)進行四輪篩選，獲得能與PRL-3選擇性結合的重組噬菌體；第二、上步得到的重組噬菌體對PRL-3結合能力的測定；第三、從上步得到的噬菌體庫中分離制備單克隆噬菌體；第四、上步得到的單克隆噬菌體基因組單鏈DNA的提取和獲得寡肽序列；第五、上步得到的單克隆噬菌體對PRL-3進行ELISA測定；第六、磷酸酶活性實驗證明第四步得到的12肽對PRL-3磷酸酶活性的影響。本發(fā)明所述的與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，可應用于制備檢測腫瘤轉移的藥物。以及作為藥物開發(fā)的新靶點，應用于制備抑制腫瘤轉移的藥物中。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的12肽能夠特異性的與PRL-3結合，并能夠影響PRL-3磷酸酶的活性，對PRL-3在腫瘤轉移中的作用的研究以及耙向藥物的設計與研發(fā)具有很高的應用價值。圖1是噬菌體展示各輪PRL-3特異性結合的噬菌體數(shù)，以空孔作為對照；圖2是經(jīng)過四輪篩選得到的噬菌體以及原噬菌體庫與PRL-3及對照結合能力的比較；圖3是15個噬菌體單克隆分別與PRL-3以及固定了his標簽的GFP作ELISA檢觀!l;圖4是證明篩選所得12肽對腫瘤轉移相關蛋白PRL-3磷酸酶活性的影響，圖A是加入不同量12肽-GST后PRL-3磷酸酶活性的變化；圖B是加入不同量GST后PRL-3活性的變化。具體實施例方式實施例1:經(jīng)過四輪篩選獲得能與PRL-3特異性結合的重組噬菌體1.第一輪篩選與洗脫①.用NaHC03溶液稀釋蛋白為100嗎/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。加10(VL該溶液到96孔板的一個空中，4。C過夜固定。②.加1504新鮮配制的含2%奶的PBS(MPBS)溶液到固定了蛋白的孔中，封閉未結合蛋白的部分。室溫搖擺平臺放置l小時。③.與此同時，將噬菌體(1011pfti)加到100nLMPBS中，加到一個空孔中，室溫搖擺平臺放置1小時，目的是將可以與ELISA板結合的噬菌體吸收掉。.倒掉蛋白和MPBS混合溶液，用200|xLPBST(pH7.4)洗5遍，注意每次都不要讓孔干了。最后一次洗完后，將先前與板吸收過的噬菌體和MPBS的混合溶液轉移到這個孔中。室溫搖擺平臺放置2小時。⑤.倒掉噬菌體和MPBS混合溶液，用200pLPBST洗5遍，再用200pLPBS洗5遍。.加100(jL0.1MHC1洗脫結合的噬菌體，室溫搖擺平臺放置IO分鐘，立即轉移到小離心管中，并用Tris-HClbuffer中和到pH為7—8。4'C保存直到測定噬菌體濃度或擴增。⑦.對照按相同方法操作，只是不固定蛋白。得到洗脫下的噬菌體并測定濃度。2.擴增，第二輪及之后幾輪篩選與洗脫①.保留20-50pL噬菌體洗脫液用于測濃度，將剩余的噬菌體全部擴增產(chǎn)生用于下一輪篩選的噬菌體。將對數(shù)期的K12接到LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)到OD600為0.5，將lmL轉接到含有30mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，同時將要擴增的噬菌體加入，37。C搖床培養(yǎng)4一5小時。②.轉移培養(yǎng)物到離心管中，4°C，10000rpm離心IO分鐘。將80%的上清吸到新的離心管中，力Q1/6體積的PEG溶液中，4'C沉淀2—4小時，最好過夜。③.4'C，10000rpm離心30分鐘，緩慢倒出上清，再小心的將管壁上的液體離心下來，用微量移液器小心吸棄。④.用200^LPBS重懸沉淀，轉移懸液到0.5mL離心管中，4'C，10000rpm離心5分鐘。⑤.上清轉移到新的0.5mL離心管中，這就是擴增了的噬菌體。4'C保存用于測濃度和下一輪篩選。.固定ELISA板的另一個孔，按第一輪的方法做第二輪及之后幾輪。噬菌體的加入量要保持與第一輪一致。3.噬菌體滴度的測定的具體實施①.K12接種到5mLLB培養(yǎng)基中，37'C搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600大約0.5)。②.融化上層膠，每個要測濃度的噬菌體稀釋液一管，45'C平衡，準備好使用。③.每個要測濃度的噬菌體稀釋液還要預先37'C與預溫塊LB平板(涂有IPTG和X-gal)，準備好使用。④.稀釋噬菌體懸液。稀釋比例如下對于擴增的噬菌體液，準備1和10"稀釋度。對于洗脫下來的噬菌體液，第一輪按102和103稀釋，以后每多一輪就增加IO倍稀釋度。.將培養(yǎng)到對數(shù)中期的K12菌液接200pL到0.5mL離心管中，每個要測濃度的噬菌體稀釋液一管?！?將噬菌體稀釋液加入到K12菌液中，室溫放置l一5分鐘。⑦.轉移噬菌體感染的K12到先前45。C平衡的上層膠中，迅速搖動，立即倒入預溫的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均勻鋪平。⑧.冷卻5分鐘，反轉平板，37'C培養(yǎng)過夜。計數(shù)器統(tǒng)計平板上的噬菌斑數(shù)量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算噬菌體的濃度。結果進行4輪富集篩選，每輪從PRL-3上洗脫下來的噬菌體量在總體上逐漸升高，與對照孔比較實現(xiàn)了特異性的富集(見表1)。表1中四輪的噬菌體數(shù)用圖1表示。圖1中縱坐標用對數(shù)值表示，橫坐標代表輪數(shù)。黑色柱代表對PRL-3的篩選結果；白色柱代表對空孔的篩選結果。表l篩選對PRL-3特異性結合的噬菌體<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>a.從第二輪開始加強了洗脫強度，目的是篩選到特異性強的12肽。因此會出現(xiàn)洗脫量/加入量減小的現(xiàn)象。b.第四輪洗脫下的噬菌體量與第三輪一樣說明已經(jīng)達到最大程度結合。實施例2:篩選到的噬菌體對PRL-3及對照結合能力的測定①.用NaHC03溶液稀釋蛋白為100pg/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。加lOOpL該溶液到96孔板的兩個孔中，4t:過夜固定。同時按照同樣的方法將BSA加入另兩個孔作對照。②.加150pL新鮮配制的含2%奶的PBS(MPBS)溶液到固定了蛋白的孔中，封閉未結合蛋白的部分。室溫搖擺平臺放置l小時。③.倒掉蛋白和MPBS混合溶液，用200nLPBST(pH7.4)洗5遍，注意每次都不要讓孔干了。最后一次洗完后，將101()特異性噬菌體溶液以及文庫噬菌體分別加入到兩個孔中。同時室溫搖擺平臺放置2小時。.倒掉噬菌體和MPBS混合溶液，用200pLPBST洗5遍，再用200fxLPBS洗5遍。.加100pL0.1MHCl洗脫結合的噬菌體，室溫搖擺平臺放置IO分鐘，立即轉移到小離心管中，并用Tris-HClbuffer中和到pH為7—8。4T保存直到測定噬菌體濃度。.測定洗脫下的噬菌體濃度。結果第四輪得到的特異性噬菌體庫與PRL-3結合能力較原始噬菌體庫提高了近100倍，第四輪得到的特異性噬菌體庫與PRL-3結合能力是其與BSA結合能力的100倍，即第四輪得到的噬菌體庫能夠特異性與PRL-3結合(見圖2)。圖2中縱坐標是洗脫下噬菌體的對數(shù)值，1代表文庫噬菌體，2代表篩選到的特異性噬菌體，黑色柱代表對PRL-3的篩選結果，白色柱代表對對照的篩選結果。實施例3:單克隆的噬菌體的分離制備1.特異性結合的噬菌體克隆的確定①.在所篩選的噬菌體量長到一定程度而不再增加時，就可以在長有噬菌斑的平板上挑取單克隆鑒定了。挑15個單克隆對于鑒定就足夠了。②.用滅菌的牙簽或槍頭挑取一個藍色噬菌斑，并轉到一個含5mLLB培養(yǎng)基的試管中。③.37'C搖床培養(yǎng)4一5小時。④.轉移培養(yǎng)物到7mL離心管中，10000rpm離心10分鐘。.將80%的上清吸到新的離心管中，力卩1/6體積的PEG溶液，4t:沉淀2—4小時。⑥.4。C，10000rpm離心30分鐘，緩慢倒出上清，用微量移液器小心將殘留的液體吸棄。⑦.用200(aLPBS重懸沉淀，轉移懸液到0.5mL離心管中，4°C，10000rpm離心5分鐘。⑧.上清轉移到新的0.5mL離心管中，這就是所挑取的噬菌體單克隆。4'C保存用于測濃度，如果要長期保存，加50%甘油，凍于一20'C。2.通過ELISA檢測挑取的單克隆①.用NaHC03溶液稀釋蛋白為100(Lig/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。對于每個單克隆要固定至少兩個孔，一個孔固定所篩的蛋白，另一個孔以Ws-GFP作對照，以排除與his結合的可能。每孔加10(VL，4'C過夜固定。②.每孔加100pL濃度10mg/mL的BSA封閉未結合蛋白的部分，室溫搖擺平臺放置1小時。③.根據(jù)所測的噬菌體單克隆濃度，將一定量的噬菌體單克隆用PBST稀釋，每孔加100)aL，使噬菌體加入量在109—101()。室溫搖擺平臺放置2小時。④.每個孔用20(VLPBST洗5次，每次在搖擺平臺上放置5分鐘。⑤.抗體按1:5000用PBST稀釋，每孔加100pL，室溫搖擺平臺放置1小時。⑥.每個孔用PBST洗5次。⑦.按60pLTMB(10mg/mL溶于DMSO)加到12mLCritate-Ac中，再加入3pL&02配制底物，每孔加100pL顯色。⑧.90s后加lOO(aL1MH2S04終止反應。⑨.用酶標儀在OD45Q下測定吸光值。結果15個單克隆都表現(xiàn)出對PRL-3的高結合性，見圖3。圖3中橫坐標表示不同的噬菌體單克隆，縱坐標表示平均凈吸光值；黑色柱表示PRL-3孔的平均凈吸光值；白色柱表示GFP孔的平均凈吸光值。圖3中每個噬菌體單克隆均與PRL-3及GFP結合。洗滌后，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)Ml3抗體及其底物TMB對每個孔進行ELISA反應，并檢測OD450。對每個克隆進行了兩組檢測，圖中數(shù)據(jù)為兩組檢測的平均值。實施例4:噬菌體基因組單鏈DNA的提取和12肽序列的獲得①.將所挑取的15個單克隆噬菌體進行擴增。②.取60pL擴增后的單克隆噬菌體溶液，加入20pLPEG溶液，置于4'C冰箱內沉淀過夜。③.10000rpm離心IO分鐘，棄上清并倒扣離心管，使液體流盡。④.加入200(aL碘化物緩沖液，再加入500nL無水乙醇，室溫孵育10分鐘。⑤.10000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗沉淀。⑥.10000rpm離心10分鐘，棄上清，干燥，讓殘余液體蒸發(fā)完全。⑦.重懸沉淀于30pL去離子水中，該溶液即該單克隆噬菌體的基因組單鏈DNA。⑧.以—96gIII引物(5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，，NewEnglandBiolabs隨機十二肽噬菌體展示文庫產(chǎn)品)測序。測序結果用PrimePrimier軟件翻譯，得到多肽序列。序列如下Gin—Tyr—Thr—Trp~Ile—Phe-PrO"Pro—Met—Gly—Tyr—Gin實施例5:12肽對PRL-3磷酸酶活性的影響①.將測序得到的12肽構建到pGEX-4Tl載體中與GST融^"表達。②.純化出12肽-GST及GST(對照)。③.在以MUP為底物測定PRL-3磷酸酶活性的反應體系(15^gPRL-3與36pMMUP在25mMMOPS，pH7.0，37。C條件下)中分別加入7，14，21嗎的12肽-GST或GST，檢測12肽對PRL-3磷酸酶活性的影響。結果12肽-GST表現(xiàn)出對PRL-3磷酸酶活性的激活作用，而對照組GST對磷酸酶PRL-3活性沒有顯著影響。見圖4，圖中橫坐標為反應時間，縱坐標為底物MUP被PRL-3脫去磷酸基團形成MU后的紫外吸光值。A圖為加入不同量12肽-GST后PRL-3磷酸酶活性的變化；B圖為加入不同量GST后PRL-3活性的變化。序列表"10〉南開大學〈120〉與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽及其應用〈160〉1〈210〉1〈211〉12〈212〉PRT〈213〉噬菌體〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)...(12)〈223〉〈400〉1GinTyrThrT卬liePheProProMetGlyTyrGin1510權利要求1、一種與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，其氨基酸序列如下Gln-Tyr-Thr-Trp-Ile-Phe-Pro-Pro-Met-Gly-Tyr-Gln。2、權利要求l所述的與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，其特征在于，所述12肽的篩選和鑒定步驟如下第一、經(jīng)過對人再生肝臟磷酸酶一3(PRL-3)進行四輪篩選，獲得能與PRL-3選擇性結合的重組噬菌體；第二、上步得到的重組噬菌體對PRL-3結合能力的測定；第三、從上歩得到的噬菌體庫中分離制備單克隆噬菌體；第四、上步得到的單克隆噬菌體基因組單鏈DNA的提取和獲得寡肽序列；第五、上步得到的單克隆噬菌體對PRL-3進行ELISA測定；第六、磷酸酶活性實驗證明第四歩得到的12肽對PRL-3磷酸酶活性的影響。3、權利要求1所述的與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，在制備檢測腫瘤轉移藥物中的應用。4、權利要求1所述的與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽，作為藥物開發(fā)的新靶點在制備抑制腫瘤轉移藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及與腫瘤轉移相關蛋白PRL-3特異性結合的12肽序列。本發(fā)明應用噬菌體展示文庫，篩選能夠與人再生肝臟磷酸酶-3(PRL-3)特異性結合的12肽，該12肽具有與PRL-3特異性結合的特性，并且能夠影響PRL-3磷酸酶活性。因此，本發(fā)明提供的12肽對PRL-3在腫瘤轉移中的作用的研究以及靶向藥物的設計與研發(fā)具有很高的應用價值?？蓱糜谥苽錂z測腫瘤轉移的藥物。以及作為藥物開發(fā)的新靶點，應用于制備抑制腫瘤轉移的藥物中。文檔編號C12Q1/42GK101113164SQ20071005801公開日2008年1月30日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權日2007年7月12日發(fā)明者張宏愷,曹又佳,白云鵬申請人:南開大學