專利名稱：濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種應(yīng)用快速納米PCR方法檢測濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的方法。

背景技術(shù)：
我國是目前世界上果汁的最大生產(chǎn)國之一，濃縮果汁每天都有大量出口。然而，果汁中存在的一種新型污染菌——耐熱嗜酸菌在國外時有報道。耐熱耐酸菌學(xué)名酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，是一種嗜熱、嗜酸、好氧的桿菌。它的芽孢能經(jīng)受果汁加工中的巴氏殺菌而存活。由于巴氏滅菌不能除去此菌以及原料果清洗不足等，耐熱耐酸菌在濃縮果汁生產(chǎn)中被帶到最終產(chǎn)品中。在濃縮果汁中該菌雖然不繁殖代謝、不產(chǎn)生危害，但一旦稀釋成低濃度的商品果汁時，在常溫下即代謝產(chǎn)生一種不愉快風味的化合物——2，6-二溴苯酚，即使有萬億分之一濃度就會使果汁口感風味變差，甚至產(chǎn)生濁度升高乃至在包裝物底部形成白色沉淀的危害。因此，國際貿(mào)易中對果汁中耐熱嗜酸菌的含量有嚴格要求。
目前國內(nèi)對濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的檢測方法采用的是傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)的方法。這些傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)檢測法耗時長，一般需要3天甚至一星期才能出檢測報告，無法及時反饋至生產(chǎn)線，從而成為濃縮果汁安全質(zhì)量控制的難題，嚴重制約了我國濃縮果汁的出口。因此，建立濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的快速檢測方法，已成為當務(wù)之急。
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的基因擴增技術(shù)，該技術(shù)由K.Mullis于1985年發(fā)明，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導(dǎo)下，在很短的時間里就能在一個試管內(nèi)實現(xiàn)只有在生物體細胞分裂增殖時才出現(xiàn)的基因的大量復(fù)制，一般來說，在數(shù)小時內(nèi)就可以將目的基因擴增至百萬倍。
近年來，納米技術(shù)與生物技術(shù)的結(jié)合越來越緊密，納米顆粒作為一種具有特殊物理和化學(xué)特性的納米材料，其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，該檢測方法可有效縮短濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的檢測時間，提高濃縮果汁中污染菌檢測的靈敏度，從而解決制約我國濃縮果汁的出口的檢測難題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 一種濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于檢測濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的方法步驟是 (1).從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌； (2).耐熱嗜酸菌全基因組的提?。? (3).依賴納米銀的快速PCR體系的配置； (4).快速PCR條件的設(shè)定與運行； (5).PCR產(chǎn)物檢測。
而且，從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌的方法是取濃縮果汁100ml用無菌水稀釋10倍，稀釋果汁于80℃水浴熱休克10min，再用冷水冷卻至室溫后用0.45μm無菌濾膜抽濾，抽濾后濾膜用無菌醫(yī)用鑷子取下放入裝25ml液體培養(yǎng)基的小三角瓶中搖床培養(yǎng)6小時后備用。
而且，耐熱嗜酸菌全基因組的提取方法是用15ml的錐形離心管5000rpm離心10min，棄上清，細菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，渦旋振蕩混勻，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室溫12000g/min離心10min，上清作為DNA模板。
而且，依賴納米銀的快速PCR體系的配置是(體積) ddH2O 6μl 10×Buffer(KOD-Dash DNA聚合酶的Buffer) 1.5μl dNTP(2.5mM)1.2μl Mg2+(25mM )0.5μl P1(2μM) 1.5μl P2(2μM) 1.5μl 模板DNA2μl KOD-Dash DNA聚合酶(2.5U/μl) 0.25μl 無色納米銀膠體(8μg/μl) 0.6μl。
而且，快速PCR條件的設(shè)定與運行方式是 按以下循環(huán)條件在快速PCR儀上進行PCR循環(huán) 預(yù)變性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
而且，PCR產(chǎn)物的檢測方法是電泳檢測采用1％瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液染色，然后用紫外分光透射儀觀察即可判定在濃縮果汁中是否含有耐熱耐酸菌。
而且，所述的液體培養(yǎng)基制備方法為(重量比)將酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐溫-80 0.1％采用250g/L無菌蘋果酸調(diào)其pH值為3.7，在培養(yǎng)溫度為43℃、搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘即可。
而且，PCR技術(shù)擴增的引物序列為 上游序列P 1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC 下游序列 P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是 1.本發(fā)明做為納米技術(shù)與生物技術(shù)結(jié)合的新成果，與已有方法相比，它展現(xiàn)了納米膠體銀在PCR反應(yīng)中的新功效。本檢測方法采用可提高PCR效率的KOD-Dash DNA聚合酶，然后加入納米膠體銀，并且使用SpeedCycler(快速PCR儀)，可以極大地提高果汁中耐熱耐酸菌檢測的靈敏度，能夠在僅有2pgDNA模板的PCR體系中很較好的擴增出目的片斷，并且通過了測序鑒定。
2.本發(fā)明整個PCR檢測過程僅需40分鐘(常規(guī)PCR需時2小時)，比常規(guī)PCR時間縮短3倍多，極大地節(jié)省了該菌檢測的時間。
3.本發(fā)明不僅可以大大提高果汁中污染菌檢測的靈敏度，而且極大地縮短了檢測的時間，從而解決制約我國濃縮果汁的出口的檢測難題，為我國果汁的出口提供了保障。
4.本發(fā)明可直接應(yīng)用于濃縮果汁工業(yè)化生產(chǎn)中對耐熱嗜酸菌的有效監(jiān)控，這對提高果汁質(zhì)量與安全水平、擴大出口貿(mào)易產(chǎn)生巨大的直接經(jīng)濟效益，并具有重要的社會意義。



圖1為本發(fā)明在耐熱耐酸菌基因組DNA模板濃度為2pg時嘗試在快速PCR體系中加入不同納米材料的擴增結(jié)果電泳圖。
由該電泳圖可以看出采用KOD-Dash DNA聚合酶，加入納米銀，并且使用SpeedCycler(快速PCR儀)，可以極大地提高蘋果汁中耐熱耐酸菌檢測的靈敏度，能夠在僅有2pgDNA模板的PCR體系中很較好的擴增出目的片段。
下表為在圖1中加入不同納米材料的對比電泳圖。
0.空白對照 1.納米Au(5nm) 2.納米Au(10nm) 3.單壁納米碳管(10mg/mL) 4.多壁納米碳管(10mg/mL) 5.納米碳粉(10mg/mL) 6.納米Pt(0.14μg/μL) 7.納米Ag-Pt(0.3μg/μL) 8.納米Ag-Cu(0.3μg/μL) 9.納米Rhenium(4μg/μL) 10.納米Tantalum(2.4μg/μL) 11.納米ruthenium(4μg/μL) 12.納米Ag粉(1μg/μL) 13.有色納米銀(0.24μg/μL) 14.無色納米銀(8μg/μL) MDL2000Marker 以上14種物質(zhì)(購買自Sigma)均在15μL的快速PCR體系中加0.6μL
具體實施例方式 本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述，但本實施例所敘述的技術(shù)內(nèi)容是說明性的，而不是限定性的，不應(yīng)依此來局限本發(fā)明的保護范圍。
本濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法的步驟是 (1).從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌； (2).耐熱嗜酸菌全基因組的提?。? (3).依賴納米銀的快速PCR體系的配置； (4).快速PCR條件的設(shè)定與運行； (5).PCR產(chǎn)物檢測。
本發(fā)明中所涉及的PCR技術(shù)擴增的引物序列為 上游序列P1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC 下游序列P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
實施例1 濃縮蘋果汁中耐熱耐酸菌的快速PCR檢測 1.從濃縮蘋果汁中分離耐熱嗜酸菌 取濃縮蘋果汁100ml用無菌水稀釋10倍，稀釋果汁于80℃水浴熱休克10min，再用冷水冷卻至室溫后用0.45μm無菌濾膜抽濾，抽濾后濾膜用無菌醫(yī)用鑷子取下放入裝25ml液體培養(yǎng)基的小三角瓶中搖床培養(yǎng)6小時后備用。
該液體培養(yǎng)基制備方法為(重量比)將酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐溫-80 0.1％采用250g/L無菌蘋果酸調(diào)其pH值為3.7，在培養(yǎng)溫度為43℃、搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘即可。
2.耐熱嗜酸菌全基因組的提取 用15ml的錐形離心管5000rpm離心10min，棄上清，細菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，渦旋振蕩混勻，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室溫12000g/min離心10min，上清作為DNA模板。
3.依賴納米銀的快速PCR體系的配置 向快速PCR小板中加入下表的各種物質(zhì)； 4.快速PCR條件的設(shè)定與運行 預(yù)變性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
5.PCR產(chǎn)物的檢測 (1).制備1％濃度的瓊脂糖凝膠 (2).吸取5μl的PCR產(chǎn)物上電泳槽點樣，同時點上5μl的DL2000Marker作為參照。
(3).加上4V/cm的電壓進行電泳。
(4).待指示劑到合適位置時，取出膠板于凝膠成象系統(tǒng)下觀察并照相記錄。
若PCR產(chǎn)物在541bp處出現(xiàn)目的條帶，則說明該濃縮蘋果汁中含有耐熱耐酸菌，反之則沒有。
實施例2 1.從濃縮橘子汁中分離耐熱嗜酸菌 取濃縮橘子汁100ml用無菌水稀釋10倍，稀釋果汁于80℃水浴熱休克10min，再用冷水冷卻至室溫后用0.45μm無菌濾膜抽濾，抽濾后濾膜用無菌醫(yī)用鑷子取下放入裝25ml培養(yǎng)液的小三角瓶中搖床培養(yǎng)6小時后備用。(液體培養(yǎng)基組成為酵母浸粉0.25％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.1％，吐溫-80 0.1％，用250g/L無菌蘋果酸調(diào)其pH值為3.7。) 2.耐熱嗜酸菌全基因組的提取 用15ml的錐形離心管5000rpm離心10min，棄上清，細菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，渦旋振蕩混勻，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室溫12000g/min離心10min，上清作為DNA模板。
3.依賴納米銀的快速PCR體系的配置 向快速PCR小板中加入下表的各種物質(zhì)； 4.快速PCR條件的設(shè)定與運行 預(yù)變性 95℃2min
完全延伸74℃2min 5.PCR產(chǎn)物的檢測 (1).制備1％濃度的瓊脂糖凝膠 (2).吸取5μl的PCR產(chǎn)物上電泳槽點樣，同時點上5μl的DL2000Marker作為參照。
(3).加上4V/cm的電壓進行電泳。
(4).待指示劑到合適位置時，取出膠板于凝膠成象系統(tǒng)下觀察并照相記錄。
若PCR產(chǎn)物在541bp處出現(xiàn)目的條帶，則說明該濃縮蘋果汁中含有耐熱耐酸菌，反之則沒有。
權(quán)利要求
1.一種濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于檢測濃縮果汁中耐熱嗜酸菌的方法步驟是
(1).從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌；
(2).耐熱嗜酸菌全基因組的提??；
(3).依賴納米銀的快速PCR體系的配置；
(4).快速PCR條件的設(shè)定與運行；
(5).PCR產(chǎn)物檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌的方法是取濃縮果汁100ml用無菌水稀釋10倍，稀釋果汁于80℃水浴熱休克10min，再用冷水冷卻至室溫后用0.45μm無菌濾膜抽濾，抽濾后濾膜用無菌醫(yī)用鑷子取下放入裝25ml液體培養(yǎng)基的小三角瓶中搖床培養(yǎng)6小時后備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
耐熱嗜酸菌全基因組的提取方法是用15ml的錐形離心管5000rpm離心10min，棄上清，細菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，渦旋振蕩混勻，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室溫12000g/min離心10min，上清作為DNA模板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
依賴納米銀的快速PCR體系的配置是(體積)
ddH2O 6μl
10×Buffer(KOD-Dash DNA聚合酶的Buffer) 1.5μl
dNTP(2.5mM) 1.2μl
Mg2+(25mM) 0.5μl
P1(2μM)1.5μl
P2(2μM)1.5μl
模板DNA 2μl
KOD-Dash DNA聚合酶(2.5U/μl)0.25μl
無色納米銀膠體(8μg/μl)0.6μl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
快速PCR條件的設(shè)定與運行方式是
按以下循環(huán)條件在快速PCR儀上進行PCR循環(huán)
預(yù)變性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
PCR產(chǎn)物的檢測方法是電泳檢測采用1％瓊脂糖凝膠，跑膠后用EB液染色，然后用紫外分光透射儀觀察即可判定在濃縮果汁中是否含有耐熱耐酸菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基制備方法為(重量比)將酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐溫-80 0.1％采用250g/L無菌蘋果酸調(diào)其pH值為3.7，在培養(yǎng)溫度為43℃、搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其特征在于
PCR技術(shù)擴增的引物序列為
上游序列P1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC
下游序列P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種濃縮果汁中耐熱耐酸菌的快速納米PCR檢測方法，其方法是(1)從濃縮果汁中分離耐熱嗜酸菌；(2)耐熱嗜酸菌全基因組的提?。?3)依賴納米銀的快速PCR體系的配置；(4)快速PCR條件的設(shè)定與運行；(5)PCR產(chǎn)物檢測。采用本發(fā)明檢測方法，其總檢測時間約為7.5個小時，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)檢測法相比在時間上大大縮短。本發(fā)明可直接應(yīng)用于濃縮果汁工業(yè)化生產(chǎn)中對耐熱嗜酸菌的有效監(jiān)控，這對提高果汁質(zhì)量與安全水平、擴大出口貿(mào)易產(chǎn)生巨大的直接經(jīng)濟效益，并具有重要的社會意義。
文檔編號C12Q1/04GK101096707SQ200710057800
公開日2008年1月2日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者張治洲, 沈涔超, 劉常金 申請人:天津科技大學(xué)