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一種高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法

文檔序號(hào):591677閱讀:617來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法。
背景技術(shù)
低聚木糖(Xylooligosaccharide)作為一種附加值高、市場(chǎng)前景看好的功能性食品添加劑,是目前國(guó)內(nèi)外競(jìng)相研究開(kāi)發(fā)的功能性低聚糖之一。低聚木糖也稱(chēng)木寡糖,由2~7個(gè)D-木糖以β-1,4-木糖苷鍵連接而成,部分還含有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等側(cè)鏈。它是從棉籽殼、玉米芯、甘蔗渣等天然食物纖維(半纖維素)中,采用木聚糖酶糖化分解制取的一種低聚糖。在日本,低聚木糖被認(rèn)為是最有前途的功能性低聚糖之一,已得到廣泛的應(yīng)用。
功能性低聚木糖除了具有低熱、穩(wěn)定、安全、無(wú)毒等良好的理化特性外,還能促進(jìn)腸內(nèi)有益菌繁殖、抑制有害菌生長(zhǎng)的獨(dú)特生理功能。雙歧桿菌是最具代表性的有益菌,該菌對(duì)維持人體健康具有重要作用,具體表現(xiàn)為(1)產(chǎn)生有機(jī)酸使腸道pH值下降,抑制病源菌的感染;(2)抑制腐敗細(xì)菌的發(fā)育,使腸內(nèi)腐敗物質(zhì)減少;(3)合成B族維生素,促進(jìn)腸道蠕動(dòng),防止便秘;(4)提高人體免疫力等。
對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖的研究發(fā)現(xiàn),酶法制備低聚木糖是解決規(guī)?;a(chǎn)的最可行的方法,但價(jià)格昂貴的木聚糖酶所引起的生產(chǎn)成本過(guò)高一直困擾著低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn),采用傳統(tǒng)的固定化酶方法,其固定化效率比較低,且由于底物的難溶性,固定化酶與底物接觸面積受影響,間接降低了酶的催化效率。可逆溶解性材料的出現(xiàn),能極大地促進(jìn)酶法制備低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn),以可逆溶解性材料固定化的木聚糖酶不僅能夠使反應(yīng)體系在均相的條件下進(jìn)行,增加了酶與底物的接觸面積,而且其固定化得率非常高。因此,以可逆溶解性材料為載體固定化木聚糖酶在工業(yè)上的應(yīng)用前景廣闊,但是以可逆溶解性材料為固定化木聚糖酶時(shí),調(diào)節(jié)pH值后,固定化酶在5000×g的離心力條件下不能完全分離,且固定化與底物的結(jié)合方式為非共價(jià)鍵的吸附方式,它們之間的結(jié)合不夠緊密,導(dǎo)致此固定化酶的重復(fù)利用率偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足而提供的一種高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法。
本發(fā)明的目的之一——高效木聚糖酶固定化方法是通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本高效木聚糖酶固定化方法包括以下工藝步驟按1mL的可逆溶解性材料與600~1000u木聚糖酶液的比例混合,在25℃下連續(xù)振搖1.5~3小時(shí),即制成固定化酶。
在本發(fā)明中,所述可逆溶解性材料為Eudragit L-100,是pH敏感型材料,濃度為0.5~1.5%;所述木聚糖酶為Novozymes公司的商業(yè)木聚糖酶,其處理后的酶活大約為2000~4000u/mL。
本發(fā)明的另一目的——提高以可逆溶解性材料的固定化木聚糖酶重復(fù)利用方法,即固定化木聚糖酶的回收利用方法,包括以下工藝步驟(1)固定化木聚糖酶與底物反應(yīng)后,加入凝聚劑,使其充分溶解;(2)用0.5mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)上述溶液pH值為3.8~4.2,并靜置25~40分鐘;(也可選用其他弱酸,弱酸的選擇以不能影響固定化酶的酶活為條件)(3)將步驟(2)中的溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;(4)將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,即完成一次固定化酶的回收。(緩沖液的選擇要求不能影響固定化酶和酶的酶活,并且能保護(hù)酶)上述凝聚劑為明礬,其添加量相對(duì)于反應(yīng)液為15~25mg/mL,加入凝聚劑明礬后,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止。
提高以可逆溶解性材料的固定化木聚糖酶重復(fù)利用具體操作過(guò)程是所述步驟(1)中根據(jù)反應(yīng)液的體積添加相對(duì)于總反應(yīng)液體積15~25mg/mL的明礬,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止;步驟(2)將上述液體中加入0.5mol/L的醋酸溶液,調(diào)節(jié)pH值至3.8~4.2,并靜置30分鐘;步驟(3)溶液在5000×g的離心力下離心半小時(shí),傾倒出上層清液,回收沉淀;步驟(4)將上述沉淀用pH值為4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,這就完成了一次固定化酶的回收。
本發(fā)明用于工業(yè)化酶法生產(chǎn)低聚木糖的優(yōu)點(diǎn)是高效的固定化效率,能有效地將酶固定化在載體上,其固定化得率達(dá)到90%~135%;固定化酶能與底物均相反應(yīng),提高了酶的效率;通過(guò)提高固定化酶重復(fù)利用的方法能顯著提高以可逆溶解性材料Eudragit L-100為載體的固定化木聚糖酶的重復(fù)利用效率;操作簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉,對(duì)儀器設(shè)備要求不高,能在較低的轉(zhuǎn)速下達(dá)到較好的固定化酶回收效率,每次固定化酶酶活回收,相比不采用該技術(shù)時(shí)提高了近30%;操作簡(jiǎn)單,能夠很方便地用于工業(yè)化生產(chǎn),能顯著降低回收成本,具有良好的工業(yè)前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1高效木聚糖酶固定化方法4mL的0.5%的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL2500u的Novozymes公司的商業(yè)木聚糖酶,在25℃下不停振搖2小時(shí),其固定化酶得率達(dá)到105%。(計(jì)算方法為固定化得率(%)=固定化酶活力/加入酶活力×100%)實(shí)施例2高效木聚糖酶固定化方法4mL的1%的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL4000u的Novozymes公司的商業(yè)木聚糖酶,在25℃下不停振搖1.5小時(shí),其固定化酶得率達(dá)到123%。
實(shí)施例3高效木聚糖酶固定化方法4mL的1%的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL3000u的Novozymes公司的商業(yè)木聚糖酶,在25℃下不停振搖3小時(shí),其固定化酶得率達(dá)到127%。
實(shí)施例4提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法步驟12mL固定化酶與20mL的底物反應(yīng)完畢后,加入0.3g的明礬,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止;步驟2將步驟1中的液體中加入0.5mol/L的醋酸溶液,調(diào)節(jié)pH值至3.8,并靜置25分鐘;步驟3溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;步驟4將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,這就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近29%。
實(shí)施例5提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法步驟12mL固定化酶與20mL的底物反應(yīng)完畢后加入0.4g的明礬,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止;步驟2將步驟1中的液體中加入0.5mol/L的醋酸溶液,調(diào)節(jié)pH值至3.8,并靜置25分鐘;步驟3溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;步驟4將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,這就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近26%。
實(shí)施例6提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法步驟12mL固定化酶與20mL的底物反應(yīng)完畢后加入0.3g的明礬,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止;步驟2將步驟1中的液體中加入0.5mol/L的醋酸溶液,調(diào)節(jié)pH值至4.0,并靜置40分鐘;步驟3溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;步驟4將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,這就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近27%。
實(shí)施例7提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法步驟12mL固定化酶與20mL的底物反應(yīng)完畢后加入0.5g的明礬,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止;步驟2將步驟1中的液體中加入0.5mol/L的醋酸溶液,調(diào)節(jié)pH值至4.2,并靜置25分鐘;步驟3溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;步驟4將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,這就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近26%。
權(quán)利要求
1.一種高效木聚糖酶固定化方法,其特征在于它包括以下工藝步驟按1mL的可逆溶解性材料與600~1000u木聚糖酶液的比例混合,在25℃下連續(xù)振搖1.5~3小時(shí),即制成固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效木聚糖酶固定化方法,其特征在于所述可逆溶解性材料為Eudragit L-100,是pH敏感型材料,濃度為0.5~1.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效木聚糖酶固定化方法,其特征在于所述木聚糖酶為Novozymes公司的商業(yè)木聚糖酶,其處理后的酶活大約為2000~4000u/mL。
4.一種提高權(quán)利要求1所述的固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法,其特征在于它包括以下工藝步驟(1)液態(tài)的固定化酶與底物反應(yīng)后,加入凝聚劑,使其充分溶解;(2)用0.5mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)上述溶液pH值為3.8~4.2,并靜置25~40分鐘;(3)將步驟(2)中的溶液在5000×g的離心力下離心30min,傾倒出上層清液,回收沉淀;(4)將上述沉淀用pH 4.0的醋酸緩沖液沖洗三次后,加入pH 5.8的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,即完成一次固定化酶的回收。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法,其特征在于所述凝聚劑為明礬,其添加量相對(duì)于反應(yīng)液為15~25mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法,其特征在于加入凝聚劑明礬后,振蕩混合均勻,直到明礬全部溶解為止。
全文摘要
一種高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重復(fù)利用效果的方法,其固定化方法為Eudragit L-100與木聚糖酶按一定比例混合,在25℃下連續(xù)振搖1.5~3小時(shí),即制成固定化酶。固定化酶與底物反應(yīng)完畢后,添加凝聚劑,再用醋酸調(diào)pH值到3.8~4.2,靜置25~40分鐘后,在5000×g的條件下離心30分鐘,即完成固定化酶的回收。本發(fā)明用于工業(yè)化酶法生產(chǎn)低聚木糖的優(yōu)點(diǎn)是高效的固定化效率,能有效地將酶固定化在載體上;固定化酶能與底物均相反應(yīng),提高了酶的效率;通過(guò)提高固定化酶重復(fù)利用的方法能顯著提高以可逆溶解性材料Eudragit L-100為載體的固定化木聚糖酶的重復(fù)利用效率。
文檔編號(hào)C12N9/24GK101037683SQ20071005397
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者丁長(zhǎng)河, 錢(qián)林, 李里特, 陳復(fù)生, 洪豐 申請(qǐng)人:河南工業(yè)大學(xué)
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