專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)慰箊ub4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞的分離純化及體外培養(yǎng)的新方法，該方法應(yīng)用一種新制備的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUB4，通過(guò)免疫分選的方法有效地從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增、誘導(dǎo)多向分化。
背景技術(shù)：
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，是組織工程和再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞。在國(guó)內(nèi)外有大量骨髓MSCs基礎(chǔ)及臨床研究的報(bào)道，其在干細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用中有廣闊的前景。
正常人骨髓中MSCs的含量很低，約104～105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中含有一個(gè)MSCs，為得到足夠數(shù)量MSCs應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究，需要有效地分離、純化、體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs。目前常用的從骨髓中分離MSCs的方案主要有三種①根據(jù)骨髓MSCs的底物黏附特性來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的貼壁篩選法；②根據(jù)MSCs與其他細(xì)胞的密度不同來(lái)分離的密度梯度離心法；③根據(jù)細(xì)胞表面的一些特殊標(biāo)記，用各種單克隆抗體進(jìn)行免疫分選，如正向免疫分選、負(fù)向免疫分選、以及聯(lián)合分選。通過(guò)傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)的方法獲得的原代人骨髓MSCs耗時(shí)長(zhǎng)、細(xì)胞的異質(zhì)性大，這使MSCs的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的推廣受到限制。以細(xì)胞特異性表面分子為標(biāo)記通過(guò)免疫分選的方法，可有效地富集骨髓中含量極少的MSCs，提高原代培養(yǎng)所得MSCs純度。
以往人骨髓MSCs公認(rèn)的表型特征不表達(dá)造血細(xì)胞的表面抗原，CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A(Glycophorin A)、T或B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志均為陰性；相對(duì)特異的表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。正向免疫分選的免疫標(biāo)記多為SH2、STRO-1、低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(low-affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)SH2是以人骨髓MSCs免疫小鼠獲得的單克隆抗體，研究證實(shí)SH2識(shí)別CD105分子，同時(shí)也CD105表達(dá)于骨髓單核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、部分淋巴細(xì)胞；STRO-1是以骨髓CD34+細(xì)胞免疫小鼠獲得的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞新的單克隆抗體，但是通過(guò)STRO-1分選的骨髓細(xì)胞中含有大量的有核紅細(xì)胞和一小部分B淋巴細(xì)胞；LNGFR表達(dá)于大部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞，但LNGFR并非骨髓MSCs特異性標(biāo)記，其表達(dá)于人體多種器官的血管外膜，在骨髓單個(gè)核細(xì)胞中LNGFR+細(xì)胞約為2.3％。骨髓單個(gè)核細(xì)胞中MSCs含量極低，通過(guò)負(fù)向免疫分選可以有效地提高分選后細(xì)胞中MSCs的含量，有研究者以CD45和Glycophorin A為標(biāo)記篩選獲得的CD45-Glycophorin A-細(xì)胞群成份復(fù)雜，仍需進(jìn)一步純化。因此，上述免疫標(biāo)記均難以成為直接分選人骨髓MSCs的理想標(biāo)記。
迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究者一直通過(guò)多個(gè)表面分子聯(lián)合標(biāo)記，并結(jié)合細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能的特性來(lái)鑒定人骨髓MSCs，MSCs單一的特異性表面分子仍在探尋中，這給MSCs的分離、純化的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。深入研究人骨髓MSCs的表型特征，將有助于有效地分離純化人骨髓MSCs并進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增，以促進(jìn)其在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。采用雜交瘤技術(shù)研究制備的新的抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB4，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色檢測(cè)證實(shí)ZUB4與人骨髓MSCs結(jié)合的陽(yáng)性率約為95％～99％，傳代培養(yǎng)的MSCs穩(wěn)定表達(dá)ZUB4抗原；ZUB4與人骨髓來(lái)源的細(xì)胞系無(wú)交叉反應(yīng)；除骨髓組織外，ZUB4與人間充質(zhì)組織和非間充質(zhì)組織均無(wú)交叉反應(yīng)。ZUB4是針對(duì)人骨髓MSCs的新的特異性單克隆抗體，與人骨髓MSCs反應(yīng)具有高度的特異性和敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的方法，是通過(guò)人骨髓MSCs原代細(xì)胞的分離純化及體外培養(yǎng)的新方法，ZUB4抗原穩(wěn)定表達(dá)于人骨髓MSC原代細(xì)胞及體外傳代培養(yǎng)的早期、晚期MSCs，是人骨髓MSCs一種新的理想的標(biāo)記。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)人骨髓MSCs原代細(xì)胞的分離純化，即從骨髓懸液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞，用專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510061036.1所公開(kāi)的單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記，通過(guò)間接免疫磁珠分選系統(tǒng)正向分選獲得ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs，ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、呈梭形，在體外培養(yǎng)體系中培養(yǎng)5天左右細(xì)胞開(kāi)始明顯擴(kuò)增，擴(kuò)增傳代后細(xì)胞表型檢測(cè)顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽(yáng)性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)均為陰性，是均一的人骨髓MSCs。
所述方法中，是通過(guò)采集健康供者骨髓，肝素抗凝，F(xiàn)icoll-paque密度梯度離心分離獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510061036.1所公開(kāi)的單克隆抗體ZUB4，抗體亞型為IgG1，與骨髓單個(gè)核細(xì)胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，離心洗滌后通過(guò)免疫磁珠分選系統(tǒng)從骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs，分別將ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞和ZUB4抗原陰性細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后每隔3天換液1次。
所述方法中，ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后接種陽(yáng)性細(xì)胞的培養(yǎng)皿中細(xì)胞貼壁呈梭形，開(kāi)始明顯擴(kuò)增，培養(yǎng)18～22天貼壁細(xì)胞80％～90％融合，細(xì)胞形態(tài)均一，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀；分選獲得的ZUB4抗原陰性細(xì)胞，培養(yǎng)5天后見(jiàn)大量的圓形懸浮細(xì)胞，其中有極少量細(xì)胞貼壁呈梭形細(xì)胞，培養(yǎng)20天后仍見(jiàn)圓形細(xì)胞，少量貼壁的細(xì)胞較寬大，形態(tài)不均一，排列無(wú)規(guī)則。
本發(fā)明方法獲得的ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs具有較好的生長(zhǎng)活性及增殖潛能，且細(xì)胞傳代過(guò)程中ZUB4抗原穩(wěn)定表達(dá)，并可在體外定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果在于(1)以單一的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記，通過(guò)正向免疫分選可以直接、快速地從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離純化原代MSCs，縮短了原代細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，提高了人骨髓MSCs的分離培養(yǎng)的效率，有效地改善了采用傳統(tǒng)的貼壁篩選法培養(yǎng)原代MSCs耗時(shí)長(zhǎng)、細(xì)胞異質(zhì)性大的缺陷，并保持原代MSCs的生物學(xué)特性，為研究和應(yīng)用骨髓原代MSCs提供了一個(gè)有效的方法。
(2)MSCs在骨髓中的含量極低，以ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選可以獲得純度較高的原代MSCs，且具有較高的增殖和多向分化潛能，可在體外傳代擴(kuò)增，并可定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞，有助于人骨髓MSCs在組織工程、再生醫(yī)學(xué)中的推廣應(yīng)用。
(3)ZUB4是一種新研制開(kāi)發(fā)的抗人骨髓MSCs單克隆抗體，以單一的ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選可以獲得表型均一的MSCs，單克隆抗體ZUB4相應(yīng)的膜表面抗原在人骨髓MSCs體外培養(yǎng)傳代擴(kuò)增過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)，為研究該表面分子在MSCs增殖及分化過(guò)程中的生物學(xué)意義并進(jìn)一步完善對(duì)MSCs特性的認(rèn)識(shí)提供了平臺(tái)。


圖1是以抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
圖2是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增第一代和第五代的生長(zhǎng)曲線。
圖3是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR及ZUB4抗原表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析圖。
圖4是誘導(dǎo)成骨分化后Von Kossa法染色圖。
圖5是誘導(dǎo)脂肪分化后油紅O染色圖。
圖6是向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1單克隆抗體ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓MSCs采集健康供者骨髓，肝素抗凝，F(xiàn)icoll-paque(比重1.077)密度梯度離心分離獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510061036.1所公開(kāi)的單克隆抗體ZUB4(抗體亞型為IgG1)與骨髓單個(gè)核細(xì)胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗(Miltenyi Biotec Inc.)孵育，離心洗滌后通過(guò)免疫磁珠分選系統(tǒng)從骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs，分別將ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后每隔3天換液1次。
培養(yǎng)5天后接種陽(yáng)性細(xì)胞的培養(yǎng)皿中細(xì)胞貼壁呈梭形，開(kāi)始明顯擴(kuò)增，培養(yǎng)20天左右貼壁細(xì)胞約80％融合，細(xì)胞形態(tài)均一，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀；分選獲得的陰性細(xì)胞，培養(yǎng)5天后見(jiàn)大量的圓形懸浮細(xì)胞，其中有極少量細(xì)胞貼壁呈梭形細(xì)胞，培養(yǎng)20天后仍見(jiàn)圓形細(xì)胞，少量貼壁的細(xì)胞較寬大，形態(tài)不均一，排列無(wú)規(guī)則，參見(jiàn)圖1，其中A、B分別為陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)8天、20天的形態(tài)學(xué)特征(×100)，C、D分別為陰性細(xì)胞養(yǎng)8天、20天的形態(tài)學(xué)特征(×100)。
通過(guò)正向免疫分選可以直接的從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離純化原代MSCs，有效地改善了采用傳統(tǒng)的貼壁篩選法培養(yǎng)原代MSCs耗時(shí)長(zhǎng)、細(xì)胞異質(zhì)性大的缺陷，同時(shí)為研究和應(yīng)用骨髓MSCs提供了一個(gè)有效的方法。
實(shí)施例2以ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞增殖能力分析取體外培養(yǎng)傳代的ZUB4陽(yáng)性的人骨髓MSCs第一代和第五代細(xì)胞，按2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8天，進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析。培養(yǎng)具有以下共性特征細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，10小時(shí)左右細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)重新變成梭形細(xì)胞；傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～36小時(shí)；傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)增殖期約為4～5天；對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束后進(jìn)入平臺(tái)期；第五代與第一代細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異，參見(jiàn)圖2。以ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞具有很好的增殖活性，在體外培養(yǎng)傳代過(guò)程中保持梭形的細(xì)胞形態(tài)。
實(shí)施例3以ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞表型特征取體外培養(yǎng)傳代的ZUB4陽(yáng)性的人骨髓MSCs第一代和第五代細(xì)胞，以CD14-FITC、CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC單克隆抗體為探針，用流式細(xì)胞儀分析MSCs表面分子的表達(dá)。結(jié)果顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽(yáng)性標(biāo)記出現(xiàn)單峰，造血細(xì)胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)均為陰性，參見(jiàn)圖3，圖3是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增至第五代的免疫表型分析。用ZUB4正向免疫分選后陽(yáng)性細(xì)胞表型特征為人骨髓MSCs的表型特征，經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增后第一代和第五代MSCs表面標(biāo)記表達(dá)無(wú)明顯差異(參見(jiàn)表1)，表明用ZUB4正向免疫分選后陽(yáng)性細(xì)胞為MSCs，是一均質(zhì)的細(xì)胞群。
表1 單克隆抗體ZUB4免疫磁珠法分選獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型(％)

實(shí)施例4
以ZUB4為標(biāo)記通過(guò)正向免疫分選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞多向分化潛能體外培養(yǎng)傳代細(xì)胞的ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs接近70％融合時(shí)，更換培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Stem Cell Technologies Inc.)、脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Stem Cell Technologies Inc.)、神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周左右，約50％細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由原來(lái)的紡錘型變?yōu)榱⒎叫突蚨嘟切?，并逐漸出現(xiàn)鈣化斑點(diǎn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，立方型或多角型細(xì)胞以及鈣化斑明顯增加，約15～21天細(xì)胞形成廣泛均一的礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)21天后，Von Kossa法染色，可以見(jiàn)到染成棕黑色的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積，結(jié)果參見(jiàn)圖4，是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng)，向成骨定向誘導(dǎo)分化，圖為誘導(dǎo)成骨分化后Von Kossa法染色(×100)。
經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變成圓形或多角性，細(xì)胞排列無(wú)序，2周左右可觀察到胞漿中出現(xiàn)高折光性的小脂滴，并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸聚集成大的脂滴。培養(yǎng)21天后，油紅O染色，脂滴為橙紅色，結(jié)果參見(jiàn)圖5，是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng)，向脂肪定向誘導(dǎo)分化后油紅O染色(×100)。
經(jīng)神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，更換含5mM硫代甘油的無(wú)血清LG-DMEM，在誘導(dǎo)后3～5小時(shí)中，大多數(shù)細(xì)胞可變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細(xì)胞，簡(jiǎn)單的雙級(jí)細(xì)胞和復(fù)雜的多級(jí)細(xì)胞均有出現(xiàn)，多個(gè)神經(jīng)元樣細(xì)胞突起可相互延伸并形成網(wǎng)狀。免疫組化染色分析，神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、神經(jīng)元標(biāo)志物NF-M表達(dá)陽(yáng)性、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)陰性，結(jié)果參見(jiàn)圖6，是以ZUB4為標(biāo)記的正向免疫分選后獲得的陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng)，向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，其中A、B、C、D分別為誘導(dǎo)神經(jīng)分化后用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、神經(jīng)元標(biāo)志物NF-M、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)(×100)。
綜上，以單一的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記，通過(guò)正向免疫分選獲得的ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓MSCs可在體外定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)從骨髓懸液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞，(2)用專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510061036.1所公開(kāi)的單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記，通過(guò)間接免疫磁珠分選系統(tǒng)正向分選獲得ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，(3)ZUB4抗原陽(yáng)性的細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中貼壁生長(zhǎng)、呈梭形，培養(yǎng)5天左右細(xì)胞開(kāi)始明顯擴(kuò)增，擴(kuò)增傳代后細(xì)胞表型檢測(cè)顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽(yáng)性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)均為陰性，是均一的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并可在體外定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟(1)是通過(guò)采集健康供者骨髓，肝素抗凝，F(xiàn)icoll-paque密度梯度離心分離獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟(2)是用專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510061036.1所公開(kāi)的單克隆抗體ZUB4，抗體亞型為IgG1，與骨髓單個(gè)核細(xì)胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，離心洗滌后通過(guò)免疫磁珠分選系統(tǒng)從骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別將ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞和ZUB4抗原陰性細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后每隔3天換液1次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟(3)分選獲得的ZUB4抗原陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)5天后培養(yǎng)皿中細(xì)胞貼壁呈梭形，開(kāi)始明顯擴(kuò)增，培養(yǎng)18～22天貼壁細(xì)胞80％～90％融合，細(xì)胞形態(tài)均一，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀；分選獲得的ZUB4抗原陰性細(xì)胞，培養(yǎng)5天后見(jiàn)大量的圓形懸浮細(xì)胞，其中有極少量細(xì)胞貼壁呈梭形細(xì)胞，培養(yǎng)20天后仍見(jiàn)圓形細(xì)胞，少量貼壁的細(xì)胞較寬大，形態(tài)不均一，排列無(wú)規(guī)則。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用單抗ZUB4免疫磁珠分選原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，是從骨髓懸液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞，用單克隆抗體ZUB4為標(biāo)記，通過(guò)間接免疫磁珠分選系統(tǒng)正向分選獲得ZUB4抗原陽(yáng)性的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明方法獲得的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較好的生長(zhǎng)活性及增殖潛能，且細(xì)胞傳代過(guò)程中ZUB4抗原穩(wěn)定表達(dá)，并可在體外定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。本發(fā)明提供的是一種較理想的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分選純化的方法，提高了原代間充質(zhì)干細(xì)胞的純度及分離培養(yǎng)的效率，有助于間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究及在臨床檢測(cè)和應(yīng)用中的推廣。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1850970SQ20061005076
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者黃河, 來(lái)曉瑜, 沈建根 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)