專利名稱：一種黃芪及其偽品的ssr分子標記鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種鑒別中藥材及其偽品的方法，更確切地說是鑒別黃芪及其偽品的一種方法，涉及SSR分子標記法。
背景技術(shù)：
黃芪是常用傳統(tǒng)大宗中藥材，我國對黃芪的需求量呈逐年上升趨勢，而近幾年由于黃芪產(chǎn)地實行退耕還林、封山育林、保護生態(tài)環(huán)境，嚴禁采挖野生黃芪等政策，導致資源更加匱乏。這種供需缺口致使黃芪價格穩(wěn)步上揚，不斷高漲的利潤吸引了許多不法分子，現(xiàn)在市面上對黃芪作偽十分猖獗，常見偽品包括蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。市面上出現(xiàn)的這些偽品均是取它們的根，干燥后作為黃芪出售，這些偽品嚴重危害到消費者健康。目前，現(xiàn)有的黃芪的鑒定鑒別方法有性狀鑒定，顯微鑒定，理化鑒定，這些鑒別方法各有其局限性。性狀鑒別法需要多年的中藥經(jīng)驗，而培養(yǎng)一位有豐富經(jīng)驗的中藥師，其花費不菲，而且對于粉末型藥劑，其鑒定鑒別的準確性也將大打折扣；顯微鑒定同樣存在上述的需要豐富經(jīng)驗的問題，而且可能還需要借助掃描電鏡，無疑提高了成本；至于理化和色譜分析，是現(xiàn)行中藥鑒別中用的最多的一種手段。但是，他們的共同局限就是，它們都是以藥材的藥用成分為對象，而一般藥材的藥用成分基本上都是初期代謝物或次生代謝物，藥材在不同的發(fā)育階段或不同的器官有不同的表達量，導致一種藥材可能因為處在不同的階段或不同的器官產(chǎn)生不同的結(jié)果，這就可能導致一種藥材出現(xiàn)多重標準。所以對中藥材的鑒別急需一種操作簡便，成本低廉的方法。分子標記法就是一種比較好的選擇。這些分子標記法依賴的是中藥材的遺傳物質(zhì)，受影響的因素相對較少，而且不需要太昂貴的儀器，成本也相對降低。
但是現(xiàn)在各種分子標記法都有一定的缺陷RFLP，這種方法要經(jīng)過Southern雜交，操作復雜，工作量大，最重要的是它一般選用單拷貝探針，標記數(shù)量相對較少，多態(tài)性較低，DNA的用量多，相對要求DNA較完整，而且使酶切反應(yīng)，要求DNA純度也較高，中藥材由于DNA降解，所能提取到的量也不多，伴隨的次生代謝物質(zhì)也不易除凈，所以這種方法不可取。
RAPD，降解了的模板DNA在擴增時對模板濃度很敏感，即不同的濃度會出現(xiàn)不同的擴增式樣。而且，這種方法在擴增反應(yīng)時要求模板盡量少含雜質(zhì)，對于植物材料多糖與多酚等次生物質(zhì)必須盡可能的去除。最重要的是，RAPD使用低溫復性，通常為36℃(溫度在36℃以下，小于1℃的變化就會得到完全不同的擴增樣式)，特異性低，引物與模板間有較高的錯配率，而且重復性低，即便同一實驗室也不易重復，不同的實驗室間更是缺乏可比性。
AFLP，程序復雜，其實驗程序比RAPD和SSR復雜得多，操作比較麻煩。而且AFLP的第一步就是制備高分子量的基因組DNA，然后酶切。對中藥而言，這和RFLP一樣不可取。
DNA測序，測序成本較高，實驗操作復雜，任何少量的DNA污染(如空氣中的花粉、孢子和細菌，操作人員的頭屑等)都會造成假陽性擴增，致使測序的片段來自DNA污染物，出現(xiàn)鑒定錯誤。因此這種方法對人員素質(zhì)、儀器設(shè)備及經(jīng)費的要求都較高。
相對而言，SSR分子標記法操作簡單，多態(tài)性豐富，重復性較好。但是它最大的不便就是其兩端引物序列的設(shè)計。因為SSR序列兩端序列的相對保守和單拷貝性，這種技術(shù)要在了解物種的基因背景并設(shè)計出相應(yīng)的引物時應(yīng)用，目前由于對黃芪的分子信息知之甚少，國內(nèi)外還沒有采用SSR方法對黃芪進行標記和鑒別報道。
本發(fā)明克服了已往黃芪偽品鑒別技術(shù)的缺陷，首先提取黃芪DNA，并參照同科植物大豆的SSR引物設(shè)計了對黃芪進行SSR標記的引物，實現(xiàn)了對黃芪及其偽品的鑒別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種采用分子標記法中的SSR標記法對黃芪及其偽品進行鑒別的方法。
本發(fā)明采用的SSR分子標記法鑒別黃芪及其偽品，該方法包括下列步驟黃芪及其偽品總DNA的提?。籗SR位點兩側(cè)引物的篩選和引物濃度的優(yōu)化；PCR擴增；PCR產(chǎn)物電泳及染色；SSR指紋圖譜結(jié)果分析及判定。
首先采用CTAB法提取黃芪及其偽品的總DNA，黃芪材料可以是干的或新鮮黃芪的任一部分或黃芪粉末。CTAB法可以是CTAB高鹽法，CTAB低pH法，或是SDS-CTAB法(田新莉等，石河子大學學報，5(2)95-98；禹山林等，花生學報，31(3)20-23，2002)；其次，篩選合適的SSR引物及其對應(yīng)的濃度。本發(fā)明的引物設(shè)計參照了大豆分子標記中所采用的引物(Akkayad，etal.，Crop Sci.351439-1445，1995)，這些引物可以在其兩端添加不定數(shù)的保護堿基，酶切位點或適當?shù)慕宇^而對后續(xù)的擴增結(jié)果并不產(chǎn)生影響(《基因工程原理》，吳乃虎著，P99107)。同領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)專業(yè)知識可以選用本發(fā)明任一引物對或是它們的組合，還可以在合成引物時使引物帶上標記如熒光標記、同位素標記等；引物濃度，本發(fā)明采用的是50μl反應(yīng)體系，5’引物0.30μM～0.45μM，3’引物0.30μM～0.45μM，反應(yīng)體系擴大或縮小，引物可隨之增多或減少。然后再根據(jù)已公知的技術(shù)，對所提取的DNA進行PCR擴增(《分子克隆實驗指南》)，PCR擴增產(chǎn)物的電泳可以采用瓊脂糖凝膠法、變性或非變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳(《分子克隆實驗指南》)。一般地，優(yōu)選分辨率高的聚丙烯酰胺凝膠電泳。染色方法可以是溴化乙啶(EB)、銀染、熒光技術(shù)或同位素法，優(yōu)選銀染法，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能夠理解的。
最后，SSR指紋圖結(jié)果分析及判定可以采用軟件進行分析，也可以目測進行相似度的分析，最后再利用軟件進行聚類分析。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法，所有試劑包括本發(fā)明CTAB法所用試劑；所篩選的引物，其它PCR反應(yīng)中所需用的酶或試劑，實現(xiàn)本發(fā)明所必需的其它酶或試劑或材料，可以液體形式或凍干粉劑裝入一個或多個可以接受的容器內(nèi)制備成試劑盒，用于鑒別黃芪及其偽品。
具體實施例方式實施例一、CTAB提取干黃芪及其偽品(蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒)的總DNA(1)新鮮葉片加入液氮迅速研磨粉碎，干材料則在此前先用粉碎器粉碎，并取粉末。
(2)每管加入預(yù)熱65℃的CTAB提取緩沖液(pH7.8)700mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，1％CTAB，1％巰基乙醇，混勻，65℃溫浴約30-60鐘。
(3)取出，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘。
(4)取上清10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，留上清。
(5)加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻，10000轉(zhuǎn)，10分鐘。
(6)上清中加入0.1體積2M的醋酸銨，充分混勻，加入2倍體積冰冷的無水乙醇，充分混勻，4℃或-20℃放置20分鐘，沉淀DNA。
(7)10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取沉淀。
(8)70％乙醇洗三次，滅菌雙蒸水溶解。
(9)加入RNaseA，使終濃度達到20μg/ml，37℃溫育30分鐘。
(10)加入等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻，離心，12000轉(zhuǎn)，10分鐘。
(11)取上清，加入0.6倍異丙醇，4℃或-20℃放置20分鐘，沉淀DNA。
(12)重復第8步，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例二、PCR擴增引物序列

擴增體系50μl體系模板DNA 150ng1.5mM MgCl21×PCR buffer150μM dNTPs 2.5U Taq DNA聚合酶引物序號15’引物0.45μM3’引物0.45μM
引物序號25’引物0.30μM3’引物0.30μM引物序號35’引物0.30μM3’引物0.30μM引物序號45’引物0.45μM3’引物0.45μM引物序號55’引物0.40μM3’引物0.40μM引物序號65’引物0.35μM3’引物0.35μM引物序號75’引物0.40μM3’引物0.40μM引物序號85’引物0.45μM3’引物0.45μM引物序號95’引物0.35μM3’引物0.35μM引物序號105’引物0.30μM 3’引物0.30μM擴增程序95℃ 5min或10min33個循環(huán)變性 92℃ 60s，復性 47℃ 60s，延伸 68℃ 60s4℃ 1min擴增產(chǎn)物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，結(jié)果如附圖1～7。
其中引物3、4、5、9未能成功擴增；而引物1、2、6、7、8、10成功擴增。故而本發(fā)明選用1、2、6、7、8、10這6對引物。
實施例三、SSR對黃芪及其偽品鑒定結(jié)果電泳結(jié)果用生物學軟件Orthogonality-Experiment Assistant(版本2.0)轉(zhuǎn)化為電泳條帶模式圖(附圖8～13)。以有條帶的位點計為1，無條帶位點處計為0，并從中扣除陰性對照中的結(jié)果。并根據(jù)下面的公式分別對每對引物計算各個材料之間的相似指數(shù)SxySxy＝2×Nxy/Nx+NyNx是材料X的等位基因數(shù)，Ny是材料X的等位基因數(shù)，Nxy是指X和Y共有的等位基因數(shù)。
根據(jù)下列公式計算PIC值(polymorphism index content)PIC=1-Σn=1ifi2]]>fi是第i個等位基因的頻率。
表一、引物1在八種材料間相似性系數(shù)S

表二、引物2在八種材料間相似性系數(shù)S

表三、引物6在八種材料間相似性系數(shù)S

表四、引物7在八種材料間相似性系數(shù)S

表五、引物8在八種材料間相似性系數(shù)S

表六、引物10在八種材料間相似性系數(shù)S

以上結(jié)果說明，對于黃芪，本發(fā)明所選用的10對大豆SSR引物，引物3、4、5、9這四對引物沒有擴增產(chǎn)物；而引物1、2、6、7、8、10獲得了擴增產(chǎn)物，意想不到的是其中1、2、7、10獲得了清晰明顯且離散度高的條帶，使得黃芪同其它偽品的鑒別十分容易，甚至單獨選用引物1或7或10就足可以將黃芪同其偽品區(qū)分開來。
本發(fā)明中所選用的這些引物，PCR擴增條件采用了同一條件，顯而易見，這些引物如果以任一組合用于同一反應(yīng)體系中，可以預(yù)見這樣完全可用于黃芪同其偽品的鑒別。
此外，同領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)專業(yè)知識可以在這些引物的兩端添加不定數(shù)的保護堿基，酶切位點或適當?shù)慕宇^而對后續(xù)的擴增結(jié)果并不產(chǎn)生影響；還可以在合成引物時使引物帶上標記如熒光標記、同位素標記等。
表七、6對引物的PIC值

PIC值反映了某一對引物的區(qū)分能力。以上所分析的6對引物中引物1、6、7、10的PIC值較高，但引物6的離散度差，故而1、7、10為優(yōu)選的引物對。


附圖1陰性對照是指在擴增管中分別加入這8種模板DNA，未加引物，其余的程序均與正常PCR擴增一致。設(shè)置陰性對照的目的在于扣除模板DNA的存在對于產(chǎn)物判斷的影響。圖中1～8分別是黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖2為引物1在八種材料中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～9分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。9是陰性對照，即是在擴增管中不加入模板DNA，其余的處理則和對應(yīng)的樣品管一致。
附圖3為引物2在八種植物中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～9分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。9是陰性對照，即是在擴增管中不加入模板DNA，其余的處理則和對應(yīng)的樣品管一致。
附圖4為引物6在八種植物中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖5為引物7在八種植物中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～9分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。9是陰性對照，即是在擴增管中不加入模板DNA，其余的處理則和對應(yīng)的樣品管一致。
附圖6為引物8在八種植物中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～9分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。9是陰性對照，即是在擴增管中不加入模板DNA，其余的處理則和對應(yīng)的樣品管一致。
附圖7為引物10在八種植物中的擴增結(jié)果。圖中從左至右0～9分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。9是陰性對照，即是在擴增管中不加入模板DNA，其余的處理則和對應(yīng)的樣品管一致。
附圖8為引物1擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖9為引物2擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖10為引物6擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖11為引物7擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖12為引物8擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
附圖13為引物10擴增結(jié)果模式圖。圖中從左至右0～8分別是DNA marker，黃芪，蜀葵，陸地棉，紫苜蓿，圓葉錦葵，白草木樨，冬葵，錦雞兒。
權(quán)利要求
1.一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于該鑒別方法采用簡單重復序列(SSR)標記法，該方法包括下列步驟黃芪及其偽品總DNA的提?。籗SR位點兩側(cè)引物的篩選；PCR擴增；PCR產(chǎn)物電泳及染色；SSR指紋圖譜結(jié)果分析及判定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于黃芪及其偽品總DNA可以從干的或新鮮黃芪及其偽品材料中提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于黃芪材料可以是黃芪的任一部分或黃芪粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于篩選的PCR擴增的引物，篩選自大豆的SSR兩翼序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選自大豆的SSR兩翼序列的引物可以是下述任一引物對，或其組合，這些引物的兩端可以添加不定數(shù)的保護堿基，酶切位點或接頭
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選自大豆的SSR兩翼序列的引物可以在合成時使引物帶上熒光標記或是同位素標記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于PCR產(chǎn)物電泳方法可以是瓊脂糖凝膠法、變性或非變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于染色方法可以是溴化乙啶(EB)、銀染、熒光技術(shù)或同位素法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的染色方法，其特征在于該染色方法優(yōu)選銀染法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪及其偽品的鑒別方法，其特征在于SSR指紋圖譜結(jié)果分析及判定可以采用軟件進行分析，也可以目測。
11.一種黃芪及其偽品的檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中含有液體或凍干狀態(tài)的引物，該引物篩選自大豆的SSR兩翼序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種黃芪及其偽品的檢測試劑盒，其特征在于引物可以是下述任一引物對，或其組合，這些引物的兩端可以添加不定數(shù)的保護堿基，酶切位點或接頭
13.根據(jù)權(quán)利要求11和12所述的一種黃芪及其偽品的檢測試劑盒，其特征在于引物可以帶熒光標記或是同位素標記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有效地鑒別黃芪的方法，即采用分子標記法中的SSR標記法對黃芪及常見偽品進行鑒別。本發(fā)明主要是提取黃芪及其偽品總DNA，從大豆的10對引物中，篩選出6對引物用于擴增，從而將SSR方法有效地用于鑒別黃芪及其偽品。
文檔編號C12Q1/68GK1965886SQ200510200699
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者李紅玉, 劉艷麗, 支德娟 申請人:蘭州大學