一種分子標記輔助選育綠豆抗豆象品種的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種分子標記輔助選育綠豆抗豆象品種的方法， 特別涉及一種用于檢測綠豆對豆象抗性的引物對，以及其在分子標記輔助選育綠豆抗豆象 品種中的應用。
【背景技術】
[0002] 綠豆（Vignaradiata)是一種豆科、蝶形花亞科SE豆屬植物，中國是綠豆的發(fā)源 地之一，擁有類型繁多的綠豆品種資源。中國、緬甸等國是主要的綠豆出口國。由于其生 育期短、適應性廣，且具有較好的固氮能力，因此是種植業(yè)資源合理配置、倒茬輪作、間作套 種、減災救災不可缺少的糧食作物及貧困地區(qū)農民致富的重要經濟作物；同時綠豆富含蛋 白質、維生素、多種礦物質及人體必需的氨基酸，還具有清熱解毒、降血壓和膽固醇、防止動 脈粥樣硬化等功效，具有較高的營養(yǎng)保健和經濟價值，在國際市場上備受青睞。近年來，國 際市場對綠豆的需求量和全世界綠豆的生產量均有所增加，目前中國的綠豆年出口量在 20-30萬噸，出口價格一般400-500美元。綠豆的社會經濟價值不容忽視。
[0003] 然而，豆象是危害綠豆最嚴重的倉儲害蟲，豆象分布范圍廣，在任何種植和儲藏 食用豆的地方都可發(fā)生綠豆象危害。在一個生活周期內，因綠豆象危害一般損失產量 30% -56%，可導致整倉綠豆被破壞。在我國，綠豆象每年可繁殖4-11代，除危害綠豆外， 還可危害小豆、豇豆、豌豆、蠶豆、菜豆、扁豆等。國內外對綠豆豆象的研究還相當滯后，雖然 國內外已進行了多年的抗豆象研究，但抗豆象相關基因方面的研究進展緩慢。首要原因是 綠豆尚無全基因組序列信息，SSR分子標記匱乏，基本都使用RFLP、RAH)和AFLP標記，這些 標記存在一定的局限性，如RFLP標記所需DNA量大，操作繁瑣、周期長、成本高、成功率低、 有放射性污染等弊端。RAH)標記不能鑒別雜合子和純合子，還存在穩(wěn)定性和重復性差等缺 點。AFLP標記技術難度大，費用高。這些標記限制了對綠豆抗豆象的分子研究，這與十年前 水稻基因的遺傳研究很相似。但自從完成水稻全基因組測序后，開發(fā)了大量的SSR，STS和 SNP等標記，特別是SSR標記的使用極大地促進了水稻基因的圖位克隆研究。SSR標記具有 重復性好、多態(tài)性高、共顯性遺傳、遍布整個基因組等優(yōu)點，使得SSR標記成為廣泛使用的 分子標記。
[0004] 隨著第二代測序技術的迅猛發(fā)展，其高通量、快速、低成本的特點成為越來越多的 生物學研究者在解決生物學問題時的首選，尤其在轉錄組測序方面更顯示出極大的潛力。 轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必然紐帶，同時相對于真核生物全基因組測序 來說，轉錄組測序得到的序列不含有內含子及其它非編碼序列，因此轉錄組測序有著無可 比擬的高性價比優(yōu)勢。通過綠豆轉錄組測序來開發(fā)SSR標記是一種簡單高效的途徑，這些 新的EST-SSR分子標記對綠豆的分子遺傳研究提供了有利的條件。
[0005] 從20世紀80年代開始，日本、泰國、澳大利亞等國家的食用豆類遺傳育種學家致 力于抗豆象的研究。國內的抗豆象資源較為稀缺，目前為止，報道的高抗豆象綠豆資源主要 有來自于非洲馬達加斯加野生種TC1966和來自于澳大利亞野生種ACC41。TC1966被廣泛 應用于綠豆遺傳育種研究。
[0006] 目前，生產上防治豆象危害的主要方法為磷化鋁熏蒸法，這不僅增加了食用豆生 產的成本，而且容易導致農藥殘留，造成環(huán)境污染，影響食用者身體健康。因此研究開發(fā)抗 豆象基因緊密連鎖標記，克隆抗豆象基因，應用分子標記輔助選擇育種技術培育抗豆象綠 豆新品種，是防治豆象危害最為經濟且環(huán)保的方法，對于減輕豆象危害，保障我國綠豆安全 生產具有非常重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對綠豆常規(guī)抗豆象育種方法只能依靠收獲后進行抗豆象鑒定 所帶來的周期長、操作繁瑣以及耗時費力等缺點，提供一種省時、省力、準確、快捷的分子標 記輔助選育綠豆抗豆象品種的選育方法，具體涉及了一種用于檢測綠豆對對象抗性的引物 對及其應用。
[0008] 本發(fā)明所提供的用于檢測綠豆對豆象抗性的引物對，具體為由序列表中序列1所 示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0009] 所述引物對中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨包裝，也可以混合包裝。如果混 合包裝，兩條單鏈DNA分子的摩爾比可為1:1。
[0010] 所述引物對在檢測綠豆對豆象抗性中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011] 本發(fā)明還提供了 一種用于檢測綠豆對豆象抗性的試劑盒。
[0012] 本發(fā)明所提供的用于檢測綠豆對豆象抗性的試劑盒，具體可含有所述的引物對， 以及PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0013] 所述引物對的制備方法和所述試劑盒的制備方法也均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 本發(fā)明所提供的檢測綠豆對豆象抗性的方法，具體可包括如下步驟：
[0015] (al)以待測綠豆的基因組DNA為模板，以所述的引物對進行PCR擴增，獲得PCR產 物；
[0016] (a2)檢測步驟（al)所得PCR產物的大小，按照如下方法確定所述待測綠豆對豆象 的抗性：若所述PCR產物中含有大小為106bp的DNA片段，則所述待測綠豆為或候選為抗豆 象綠豆；若所述PCR產物中含有大小為120bp的DNA片段，則所述待測綠豆為或候選為感豆 象綠豆。
[0017] 在實際應用中，判斷PCR產物中是否含有目的DNA片段時，可通過將PCR產物進行 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（凝膠濃度具體可如8% )，看電泳圖譜上是否含有目的條帶： 電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產物中含有目的DNA片段。
[0018] 在所述方法中，所述大小為106bp的DNA片段為序列表中序列3所示DNA片段；所 述大小為120bp的DNA片段為序列表中序列4所示DNA片段。
[0019] 在實際應用中，判斷PCR產物中是否含有序列3或序列4所示DNA片段，可通過對 PCR產物進行核苷酸序列測定來判斷。
[0020] 在所述方法中，以所述引物對進行PCR擴增的退火溫度為50°C。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施例中，以所述引物對進行PCR擴增的程序具體為：95°C預變 性5min;95°C變性30s，50°C退火45s，72°C延伸30s，進行33個循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0022] 所述的引物對或所述試劑盒或所述方法在如下（I)-(IV)任一中的應用也屬于本 發(fā)明的保護范圍：
[0023] (I)篩選抗豆象綠豆品種；
[0024] (II)篩選感豆象綠豆品種；
[0025] (III)培育抗豆象綠豆品種；
[0026] (IV)培育感豆象綠豆品種。
[0027] 本發(fā)明的另外一個目的是提供一種培育抗豆象（或感豆象）綠豆品種的方法，包 括采用通過以上所述方法檢測得到的所述抗豆象（或感豆象）綠豆品種作為親本進行育種 的步驟。
[0028] 在本發(fā)明中，所述抗豆象或所述感豆象具體體現(xiàn)在種子被害率這一指標上。具體 而言，所述抗豆象綠豆為種子被害率在35%以下的綠豆；所述感豆象綠豆為種子被害率在 65%以上的綠豆。
[0029] 其中，所述種子被害率為受害種子粒數(shù)與每份材料鑒定的總粒數(shù)的比值。更加 具體的，所述種子被害率的測定方法參見"程須珍.綠豆抗豆象基因源發(fā)掘與創(chuàng)新利用研 究.中國農業(yè)科學院，2006年碩士論文"一文進行。
[0030] 在本發(fā)明中，所述豆象具體為綠豆象。
[0031] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述待測綠豆具體為由綠豆親本TC1966(抗豆象）和 綠豆親本VC1973A(感豆象）雜交產生的F2分離群體94個單株衍生的F2:3家系。
[0032] 本發(fā)明利用第二代高通量測序技術，對綠豆抗、感豆象近等基因系材料VC6089A 和VC1973A進行轉錄組測序，開發(fā)抗豆象相關的EST-SSR標記，并篩選出抗豆象親本TC1966 和感豆象親本材料VC1973A間的多態(tài)性標記，并對產生的F2分離群體94個單株進行驗證， 獲得了抗豆象基因連鎖標記（序列1和序列2組成的引物對）。實驗證明，本發(fā)明對由抗、 感豆象親本TC1966和VC1973A雜交產生的F2分離群體94個單株對綠豆象的分子檢測及抗 性統(tǒng)計實驗結果表明，采用本發(fā)明所提供的引物對（序列1和序列2)擴增出106bp目的條 帶（序列3)的綠豆全部表現(xiàn)出抗豆象；而采用本發(fā)明所提供的引物對（序列1和序列2) 擴增出120bp目的條帶（序列4)的綠豆全部表現(xiàn)出感豆象?？梢?，本發(fā)明所提供的檢測綠 豆對豆象抗性的方法可靠、簡便、實用，在綠豆種質資源評價和育種標記的輔助選擇中具有 重要應用前景，同時為培育對豆象高抗的綠豆品種提供了參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為實施例1中部分SSR重復基元類型和數(shù)量。
[0034] 圖2為實施例2中采用引物對A檢測抗豆象親本TC1966,感豆象親本VC1973A以 及它們雜交的F2分離群體DNA進行多態(tài)性驗證的結果。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如