專利名稱：基因突變類型及基因測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到基因及其檢測(cè)方法，特別涉及伴皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebral autosomaldominant arteriopathy with subcortical infarcts andleukoencephalopathy CADASIL)基因突變類型及突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，尤其涉及對(duì)中國(guó)人CADASIL病的基因突變類型及突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病及多發(fā)病，是目前人類疾病的三大死亡原因之一，存活者中50％～70％病人遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重殘疾，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。近年來，腦卒中發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)，遺傳因素在腦卒中的作用越來越受到人們的重視，CADASIL作為中、青年腦梗死的病因之一，逐漸成為人們研究的重點(diǎn)。其臨床特點(diǎn)為中年起病，具有家族遺傳性，反復(fù)缺血發(fā)作，認(rèn)知功能障礙，偏頭痛發(fā)作。
Notch3單基因突變是CADASIL的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。診斷的主要手段為基因突變檢測(cè)和皮膚肌肉組織活檢。目前，全世界已經(jīng)有超過400個(gè)相關(guān)CADASIL家系報(bào)道。曾有報(bào)道，CADASIL在英國(guó)發(fā)病率至少為十萬分之一。CADASIL作為中風(fēng)、癡呆、偏頭痛、癲癇的病因，越來越受到人們的重視，但多數(shù)報(bào)道為白種人，黃色人種的相關(guān)報(bào)道較少，中國(guó)在2000年報(bào)道了首例家系。
1993年，Tournier-Lasserve等人通過對(duì)兩個(gè)無關(guān)聯(lián)家庭的基因連鎖分析的方法，將疾病的致病基因定位于19號(hào)常染色體，1996年Joutel A等人將致病基因進(jìn)一步定位為Notch3(Joutel A，et al，Notch3 Mutations in CADASIL，a Hereditary Adult-onset ConditionCausing Stroke and Dementia.Nature 383707-710，1996)，并進(jìn)一步證實(shí)Notch3基因的表達(dá)高度局限于血管平滑肌細(xì)胞，Notch3屬于高度保守的Notch/LIN-12受體家族，編碼含有2321氨基酸的跨膜受體蛋白，它包括細(xì)胞外包含34個(gè)表皮樣生長(zhǎng)因子重復(fù)序列(epidermal growth factor like repeats，EGF-like repeats)，富含3個(gè)半胱氨酸Notch/LIN-12的重復(fù)序列，跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)含有6個(gè)錨蛋白的重復(fù)序列。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外區(qū)EGF-like重復(fù)序列與相關(guān)配體結(jié)合有關(guān)。EGF-like重復(fù)序列中包含40-50個(gè)氨基酸，并大量存在于細(xì)胞外蛋白的不同功能區(qū)，每個(gè)EGF序列包含6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，并形成3個(gè)二硫鍵，研究者認(rèn)為二硫鍵對(duì)于蛋白穩(wěn)定及蛋白與蛋白的相互作用起著非常重要的作用，Notch3突變導(dǎo)致奇數(shù)半胱氨酸殘基的產(chǎn)生，推測(cè)破壞了規(guī)范的二硫鍵的配對(duì)。CADASIL患者Notch細(xì)胞外區(qū)不能與細(xì)胞外肽結(jié)合的結(jié)果，造成細(xì)胞外區(qū)不能被正常的重?cái)z取入細(xì)胞內(nèi)，引起異常堆積。MarieMagdeleine Ruchoux等人使用SM22α增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)(Marie MagdeleineRuchoux，et.al，Transgenic Mice Expressing Mutant Notch3 DevelopVascular Alterations Characteristic of Cerebral Autosomal DominantArteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy.Am.J.Pathol.162329-342，2003.)，在鼠血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)全長(zhǎng)帶有Arg90Cys突變體的人類Notch3基因，從而建立了CADASIL轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型，并發(fā)現(xiàn)了Notch3受體的堆積，再一次證實(shí)了Notch3基因的缺陷是CADASIL疾病的分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)。
Notch3包含33個(gè)外顯子，目前發(fā)現(xiàn)的所有突變均存在于EGF-like重復(fù)序列中，主要的突變類型包括錯(cuò)意突變、缺失突變及RNA剪切缺陷。任何一種突變類型均導(dǎo)致Notch的EGF重復(fù)序列中的半胱氨酸殘基數(shù)目的改變，引起半胱氨酸數(shù)量的奇數(shù)化，奇數(shù)半胱氨酸的不恰當(dāng)配對(duì)或與其他蛋白的交叉聯(lián)系，可導(dǎo)致在Notch3受體細(xì)胞外主要組成部分的EGF重復(fù)區(qū)域內(nèi)形成異常蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。研究表明，Notch3的N末端與Notch家族的其他同源蛋白相比較缺乏保守性，是突變好發(fā)部位(Joutel A，Tournier-Lasserve E.Molecular Basis and Physiopathogenic Mechanisms of CADASILAModel of Small Vessel Diseases of the Brain.J Soc Biol 196(1)109-15，2002)。Joutel研究發(fā)現(xiàn)在編碼前5個(gè)EGF-like重復(fù)序列的exon3和exon4中存在叢集性突變，據(jù)統(tǒng)計(jì)可占到所有突變的65％，Dong Yanbin等人研究發(fā)現(xiàn)在exon3、exon4、exon5和exon6中存在的突變占所有突變的90％，所以對(duì)于基因突變的檢測(cè)策略，研究者建議先檢測(cè)上述4個(gè)外顯子，如未發(fā)現(xiàn)突變，再檢測(cè)剩余的編碼EGF-like重復(fù)序列的外顯子，直至找到致病性突變，盡管如此，仍有6％-10％的突變無法檢測(cè)到。
目前對(duì)于未知基因突變的篩查技術(shù)包括直接測(cè)序(directsequence，DS)、蛋白截?cái)鄬?shí)驗(yàn)(protein truncation test，PTT)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、異源雙鏈分析、限制性內(nèi)切酶法及變性梯度凝膠電泳(denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)等。但是，這些技術(shù)均存在一定的局限性，如廣泛應(yīng)用的SSCP方法雖然簡(jiǎn)單，但敏感性較低，檢測(cè)成功率只有60％-90％。通過病理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒物質(zhì)(granular osmiophilic material，GOM)沉積是CADASIL疾病診斷的另一個(gè)重要手段(Mayer M，Straube A，Bruening R，et alMuscleand Skin Biopsies Are a Sensitive Diagnostic Tool in the Diagnosis ofCADASIL.J.Neurol.246526-532，1999)，但是有創(chuàng)檢查被人們接受的程度低，并且病理改變?cè)诩膊〉闹衅诓懦霈F(xiàn)，CADASIL動(dòng)脈病的顯著性特征，即在腦和周圍動(dòng)脈的GOM沉積及Notch3受體堆積的表現(xiàn)晚于患者動(dòng)脈平滑肌內(nèi)膜的損害，因此，對(duì)于CADASIL動(dòng)脈病的早期診斷無價(jià)值。
變性高效液相色譜分析(denaturing high-performance liquidchromatography DHPLC)是一種新近發(fā)展起來的對(duì)突變DNA進(jìn)行檢測(cè)的方法，這種方法的原理是通過離子對(duì)轉(zhuǎn)換階段液體層析法，把雜合二倍體從純合二倍體DNA分子中分離出來，DHPLC已被報(bào)道是一種高度靈敏或特異的檢測(cè)基因突變的手段，Joutel等人使用DHPLC對(duì)5個(gè)被懷疑為CADASIL的患者進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了新的突變，但以往使用SSCP與異源雙鏈分析均未發(fā)現(xiàn)致病性突變。
所有基因組DNA的單拷貝，均可通過PCR反應(yīng)大量擴(kuò)增，雜合子個(gè)體的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生雜合二倍體，它與純合子個(gè)體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配的純合二倍體的解鏈特征不同，在部分加熱變性的條件下，通過雜合二倍體與純合二倍體在柱中的保留時(shí)間(retention time)差異，而發(fā)現(xiàn)DNA的突變，即所述DNA通過疏水作用與柱子結(jié)合的能力隨溫度的升高而變化，在乙腈梯度增加時(shí)，DNA將從柱子中被洗脫出來，雜合二倍體將先于純合二倍體被洗脫出來，據(jù)此可用于檢測(cè)反向柱中單個(gè)堿基置換、插入或缺失雜合二倍體的片段。在絕大多數(shù)情況下，雜合二倍體的存在表現(xiàn)為峰數(shù)目的變化，由野生型的單峰變?yōu)?、3或4個(gè)峰，不過大多數(shù)變異呈雙峰。
目前，共發(fā)現(xiàn)Notch3基因突變52種，其中錯(cuò)意突變49種，小片段缺失2種，RNA剪切位點(diǎn)突變1種。多數(shù)為白種人CADASIL家系報(bào)道及相關(guān)缺陷基因突變位點(diǎn)報(bào)道，亞洲人種相關(guān)報(bào)道較少，而相應(yīng)的基因檢測(cè)的手段多為直接測(cè)序或限制性內(nèi)切酶檢測(cè)。
中國(guó)在2000年才報(bào)道了首例CADASIL家系，目前對(duì)于中國(guó)人CADASIL病僅有一例家系研究，缺乏對(duì)多個(gè)中國(guó)CADASIL家系患者的分子生物學(xué)方面的研究。
由于CADASIL病是一種家系遺傳病，提供一種針對(duì)CADASIL進(jìn)行早期基因測(cè)序的方法有利于臨床前期患者的發(fā)現(xiàn)，并且有利于發(fā)現(xiàn)新的CADASIL基因突變類型，有助于對(duì)CADASIL患者，尤其是針對(duì)中國(guó)人CADASIL患者的自然病程的了解和觀察，為藥物治療，基因治療爭(zhēng)取時(shí)間。同時(shí)，可以對(duì)中國(guó)人CADASIL患者婚育提供指導(dǎo)，并可以早期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，做到優(yōu)生優(yōu)育，降低此類遺傳性疾病的發(fā)生率。為此，需要提供一種對(duì)CADASIL進(jìn)行早期基因研究的方法，尤其需要提供一種針對(duì)中國(guó)人CADASIL進(jìn)行早期基因研究的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明目的之一在于提供一種CADASIL的基因突變類型，其特征在于，在CADASIL基因的Notch3的外顯子Exon3或Exon4至少之一中發(fā)生基因突變。
該CADASIL的基因突變類型為，在Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC；在Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門GC；在Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門GT；在Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC；在Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門GC；在Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門GC。
本發(fā)明特別提供了幾種新的CADASIL的基因突變類型。本發(fā)明新的CADASIL的基因突變類型分別為在外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC，在外顯子Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC，在外顯子Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門GC，以及在外顯子Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門GC；上述新的CADASIL的基因突變類型的DNA基因樣本選自中國(guó)人CADASIL先證者或其親屬。
本發(fā)明提供的新的CADASIL的基因突變類型分別為(1)外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC，使密碼子134的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)槔野彼?Tyr)，(2)外顯子Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC，使密碼子117的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榫彼?Arg)，(3)外顯子Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門GC，使密碼子169的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，以及(4)外顯子Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門GC，使密碼子169的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，上述的基因突變引起半胱氨酸數(shù)量的奇數(shù)化，奇數(shù)半胱氨酸的不恰當(dāng)配對(duì)或與其他蛋白的交叉聯(lián)系，可導(dǎo)致在Notch3受體細(xì)胞外主要組成部分的EGF重復(fù)區(qū)域內(nèi)形成異常蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供的上述類型的中國(guó)人CADASIL的基因突變類型在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于其他人種均沒有報(bào)道，是全新的CADASIL的基因突變類型。
在本發(fā)明中還提供了另外兩種中國(guó)人CADASIL的基因突變類型為第二種為外顯子Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門GC，使密碼子141的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)；或第三種為外顯子Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門GT，使密碼子90的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，上述兩種基因突變類型在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)外國(guó)人CADASIL的基因研究中已有報(bào)道。
利用本發(fā)明的CADASIL基因突變類型，可以檢測(cè)中國(guó)人CADASIL家系的未發(fā)病人員在相關(guān)位點(diǎn)是否已發(fā)生基因突變，有利于臨床前期患者的發(fā)現(xiàn)，有助于對(duì)中國(guó)人CADASIL患者的自然病程的了解和觀察，為藥物治療，基因治療爭(zhēng)取時(shí)間。同時(shí)對(duì)于中國(guó)人CADASIL患者的婚育提供指導(dǎo)，并可以早期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，做到優(yōu)生優(yōu)育，降低此類遺傳性疾病的發(fā)生率。
本發(fā)明另一目的在于提供一種檢測(cè)CADASIL基因突變位點(diǎn)的方法，尤其提供一種利用DHPLC用于CADASIL病的基因測(cè)序方法，更進(jìn)一步提供一種利用DHPLC用于中國(guó)人CADASIL的基因測(cè)序的方法，包括以下步驟步驟1提取DNA樣本；步驟2根據(jù)Notch3基因細(xì)胞外34個(gè)EGF-like重復(fù)序列的22個(gè)外顯子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；步驟3選擇10個(gè)熱點(diǎn)突變的外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23進(jìn)行該外顯子的PCR擴(kuò)增；步驟4運(yùn)用DHPLC技術(shù)對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸分析；步驟5對(duì)DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，對(duì)重新PCR擴(kuò)增的原液進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型，明確基因突變類型或基因多態(tài)類型；步驟6對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行剩余的12個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，對(duì)DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行基因測(cè)序。
該方法還可以在該利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序方法中包括對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行含量及純度測(cè)定；或進(jìn)一步包括對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行純化。
該方法還可以在該DHPLC方法中包括對(duì)外顯子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22或Exon23選擇各自合適的DNA解鏈的柱溫及合適的Buffer A與Buffer B的比例；更進(jìn)一步在該DHPLC方法中對(duì)外顯子Exon3選擇合適的DNA解鏈柱溫為66℃，Buffer A與Buffer B的比例為Buffer A為49％及BufferB為51％；或?qū)ν怙@子Exon4選擇合適的DNA解鏈柱溫為66℃，BufferA與Buffer B的比例為BufferA為43％及Buffer B為57％。
采用本發(fā)明的利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序方法，可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)CADASIL基因的突變位點(diǎn)。該方法適用于大樣本及多外顯子檢測(cè)，使用DHPLC對(duì)CADASIL進(jìn)行篩查加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度；自動(dòng)化程度高，提高檢測(cè)效率；靈敏度和特異度均較高，與直接測(cè)序結(jié)果相當(dāng)，尤其在變異等位基因頻率較低的情況下，DHPLC的檢出率更高，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。
利用本發(fā)明提供的利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序方法，可以用來發(fā)現(xiàn)新的CADASIL的基因突變類型，為CADASIL的早期診斷提供依據(jù)。
本發(fā)明通過利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序方法，對(duì)中國(guó)CADASIL家系中先證病人的一級(jí)親屬進(jìn)行相同位點(diǎn)基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了兩名來自不同家系的臨床前期的CADASIL患者，目前兩名患者均無卒中樣發(fā)作，神經(jīng)系統(tǒng)查體無陽性定位體征，智能評(píng)定均正常，但其中一例頭顱核磁檢查已出現(xiàn)多發(fā)皮層下梗塞。
利用本發(fā)明提供的利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序方法，有助于我們對(duì)中國(guó)人CADASIL臨床前期患者的發(fā)現(xiàn)，有助于對(duì)前期患者的自然病程的了解和觀察，為藥物治療，基因治療爭(zhēng)取時(shí)間。同時(shí)，對(duì)于CADASIL患者婚育提供指導(dǎo)，可早期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，做到優(yōu)生優(yōu)育，降低此類疾病的發(fā)生率。


圖1為利用DHPLC用于CADASIL的基因測(cè)序的技術(shù)路線。
圖2為家系1的CADASIL患者及其家系成員。
圖3為家系2的CADASIL患者及其家系成員。
圖4為家系3的CADASIL患者及其家系成員。
圖5、圖6分別為外顯子Exon3的致病性基因突變類型的DHPLC檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的基因測(cè)序結(jié)果。
圖7、圖8，圖9、圖10，圖41、圖42，圖43、圖44及圖45、圖46分別為外顯子Exon4的基因突變類型的DHPLC檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的基因測(cè)序結(jié)果。
圖11至圖40分別為15種多態(tài)類型的DHPLC檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
圖1所示為本發(fā)明對(duì)臨床診斷為CADASIL先證病人及部分家系成員進(jìn)行基因研究的技術(shù)路線，本發(fā)明的檢測(cè)CADASIL基因突變類型及基因多態(tài)類型的方法包括以下步驟步驟1提取DNA樣本；步驟2根據(jù)Notch3基因細(xì)胞外34個(gè)EGF-like重復(fù)序列的22個(gè)外顯子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；步驟3選擇10個(gè)熱點(diǎn)突變的外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23進(jìn)行外顯子的PCR擴(kuò)增；步驟4運(yùn)用DHPLC技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸分析；步驟5對(duì)DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，對(duì)重新PCR擴(kuò)增的原液進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型，明確基因突變類型或基因多態(tài)類型；步驟6對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行所述剩余的12個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，直至找到致病性基因突變類型。
可選的，在步驟4或步驟6中的DHPLC檢測(cè)過程中，通過改變DHPLC檢測(cè)的柱溫，對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行重復(fù)的DHPLC檢測(cè)，直至找到致病性DNA突變類型或排除致病性DNA突變類型。
可選的，在步驟1進(jìn)行DNA提取過程中，對(duì)提取的DNA進(jìn)行含量及純度的測(cè)定。
可選的，在步驟1進(jìn)行DNA提取過程中，對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。
本發(fā)明首先選取兩組人群為研究對(duì)象，一組為CADASIL患者及其家系成員，另一組為正常對(duì)照組，無神經(jīng)系統(tǒng)變性病、精神病、無腦血管病高危因素及家族史。本發(fā)明利用DHPLC通過對(duì)上述兩組人群的Notch3基因進(jìn)行檢測(cè)，確定中國(guó)人CADASIL家系患者Notch3基因的突變類型，并確定中國(guó)CADASIL患者的突變熱點(diǎn)區(qū)，同時(shí)提供一種用于中國(guó)人伴皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(CADASIL)的利用DHPLC的基因測(cè)序方法。
為了便于理解，下面的實(shí)施例對(duì)CADAIL的DHPLC的基因測(cè)序方法及基因突變類型及多態(tài)類型進(jìn)行了具體描述，應(yīng)該注意到它不是對(duì)發(fā)明的限制。
實(shí)施例1本發(fā)明的研究對(duì)象包括兩組人群，分別為1.CADASIL患者CADASIL患者及其家系成員來自于如圖2至圖4所示的CADASIL家系，臨床診斷為CADASIL，既往無高血壓、糖尿病、淀粉樣變性疾病。CADASIL患者的臨床資料如表1所示
表1CADASIL患者的臨床資料

注N正常；ND未做檢查；病理-未見GOM沉積；病理+可見GOM沉積；影像學(xué)-無皮層下白質(zhì)梗塞；影像學(xué)+可見多皮層下白質(zhì)梗塞；基因檢測(cè)-無致病性突變；基因檢測(cè)+發(fā)現(xiàn)致病性突變。
2.正常對(duì)照組50例健康對(duì)照組均來自于健康查體者，無神經(jīng)系統(tǒng)變性病、精神病、無腦血管病高危因素及家族史，年齡為56-72歲，平均為63±8.2歲，其中男性32例，女性28例。
利用DHPLC的基因測(cè)序方法對(duì)上述兩組人群的Notch3基因進(jìn)行檢測(cè)，確定中國(guó)人CADASIL家系患者Notch3基因的突變類型，并確定中國(guó)CADASIL患者的突變熱點(diǎn)區(qū)。
下面詳細(xì)說明各個(gè)步驟的具體內(nèi)容步驟1DNA樣本的提取。DNA樣本的提取采用現(xiàn)有技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，采用《分子克隆》第二版(J.薩姆布魯克等，1999年，科學(xué)出版社，北京)從血液白細(xì)胞中提取DNA的方法提取DNA。本發(fā)明中可選的可以包括對(duì)上述提取的DNA的含量及純度進(jìn)行測(cè)定，可選的還可以包括對(duì)上述DNA的純化。
步驟2根據(jù)Notch3基因細(xì)胞外34個(gè)EGF-like重復(fù)序列的22個(gè)外顯子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23的外顯子區(qū)基因組序列設(shè)計(jì)引物。本發(fā)明的方法是對(duì)于已知基因序列的檢測(cè)方法，該基因的突變位點(diǎn)可以是現(xiàn)有的，也可以是本發(fā)明提供的，本發(fā)明提供的這些中國(guó)人CADASIL基因突變的位點(diǎn)是本申請(qǐng)的發(fā)明人首次披露的。
步驟3選擇10個(gè)熱點(diǎn)突變的外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23進(jìn)行外顯子的PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的PCR擴(kuò)增的方法采用傳統(tǒng)方法，采用PCR產(chǎn)物電泳的方法評(píng)價(jià)PCR擴(kuò)增是否成功，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法確定最終擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)于PCR擴(kuò)增成功的樣本，進(jìn)行以下步驟步驟4運(yùn)用DHPLC技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸分析；步驟5對(duì)DHPLC檢測(cè)陽性(出現(xiàn)雜合的異常多峰)的樣本進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，對(duì)重新PCR擴(kuò)增的原液進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型，明確基因突變類型或基因多態(tài)類型；
步驟6對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行剩余的12個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增并對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，直至找到致病性基因突變類型。
可選的，在步驟4或步驟6中的DHPLC檢測(cè)過程中，改變DHPLC檢測(cè)的柱溫，對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行重復(fù)的DHPLC檢測(cè)，直至找到致病性DNA突變類型或排除致病性DNA突變類型。
步驟7(可選的)可以同時(shí)收集該CADASIL患者的臨床、影像及病理資料并與其基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。
其中在步驟4與6中進(jìn)行了DNA的DHPLC檢測(cè)，在DHPLC檢測(cè)中，合適柱溫的選擇是檢測(cè)基因突變類型的關(guān)鍵。
本發(fā)明還提供了中國(guó)人CADASIL的基因突變類型，該CADASIL基因突變類型至少存在于Notch3的外顯子Exon3或外顯子Exon4之一發(fā)生基因突變。
本發(fā)明的中國(guó)人CADASIL的基因突變類型分別為(1)Notch3的外顯子Exon4中的密碼子134的 突變?yōu)?使密碼子134的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)槔野彼?Tyr)；(2)外顯子Exon4中的密碼子117的 突變?yōu)?使密碼子117的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榫彼?Arg)；(3)外顯子Exon4中的密碼子169的 突變?yōu)?使密碼子169的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)；以及(4)外顯子Exon4中的密碼子182的 突變?yōu)?使密碼子169的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)。上述的基因突變引起半胱氨酸數(shù)量的奇數(shù)化，奇數(shù)半胱氨酸的不恰當(dāng)配對(duì)或與其他蛋白的交叉聯(lián)系，可導(dǎo)致在Notch3受體細(xì)胞外主要組成部分的EGF重復(fù)區(qū)域內(nèi)形成異常蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。上述基因突變類型在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于其他人種的CADASIL基因研究中沒有報(bào)道，為新的CADASIL基因突變類型。上述新的基因突變類型的DHPLC檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的基因測(cè)序結(jié)果分別示于圖7、圖8，圖41、圖42，圖43、圖44及圖45、圖46中。
在本發(fā)明中還提供了中國(guó)人CADASIL的基因突變類型為Notch3的外顯子Exon4中的密碼子141的 突變?yōu)?使密碼子141的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)；或外顯子Exon3中的密碼子90的 突變?yōu)?使密碼子90的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，上述兩種基因突變類型在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于其他人種的CADASIL基因研究中已經(jīng)有報(bào)道，上述兩種基因突變類型的DHPLC檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的基因測(cè)序結(jié)果分別示于圖5、圖5和圖9、圖10中。
本申請(qǐng)的發(fā)明人提供了中國(guó)人CADASIL基因在上述位點(diǎn)的基因突變類型，并且這些基因突變類型與中國(guó)人CADASIL密切相關(guān)。利用正常的CADASIL基因，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用定點(diǎn)突變技術(shù)，可以獲得上述在特定位點(diǎn)發(fā)生突變的全基因序列。由于“定點(diǎn)突變”方法是現(xiàn)有的，這里不再贅述。請(qǐng)參見《分子克隆》第三版(中文版)，下冊(cè)，p1105頁(yè)，“大引物PCR定點(diǎn)誘變”。
本發(fā)明的DHPLC檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)上述已知基因的突變位點(diǎn)，該方法也可以用于對(duì)CADASIL基因的未知突變進(jìn)行檢測(cè)，該方法還可以用于對(duì)CADASIL基因的多態(tài)類型進(jìn)行檢測(cè)，只是引物的設(shè)計(jì)會(huì)有所不同。本發(fā)明的檢測(cè)方法的具體步驟如下步驟1提取DNA樣本標(biāo)本采集與處理對(duì)被檢測(cè)者采取肘靜脈血10ml(枸櫞酸鈉抗凝)，4℃保存，兩周內(nèi)用以下方法提取DNA備用。
DNA提取采用《分子克隆》第二版從血液白細(xì)胞中提取DNA的方法提取DNA，具體步驟如下1)肘靜脈血10ml，加入裝有1.75ml酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)的試管中混勻；2)將試管放置高速離心機(jī)中，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后棄去血漿；3)試管內(nèi)加入兩倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻靜置20分鐘后將試管放置高速離心機(jī)中，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后棄去上清液；4)重復(fù)第三步2次；5)加入白細(xì)胞裂解液3ml、SDS 200μl、蛋白酶K200μl，55℃過夜；6)加入飽和NaCl 1ml，混勻后置高速離心機(jī)中，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后，取出上清液；7)加入兩倍體積的無水乙醇，輕搖數(shù)次后可見DNA析出，吸出DNA；8)75％乙醇清洗人重組DNA兩次后，放置烘箱中烘烤30分鐘；9)加500μl去離子水，將DNA充分溶解；10)加入500μl酚氯仿，混勻后放置高速離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分，15分鐘后吸出上清液，加入2倍體積無水乙醇，輕搖后吸出DNA；
11)加入TE 500μl充分溶解后放置-80℃保存。
12)DNA濃度測(cè)定取15μl DNA樣本加1485μl三蒸水，充分混勻后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)分別為260nm、280nm、330nm時(shí)的OD值，計(jì)為OD260、OD280、OD330，根據(jù)下面的計(jì)算公式計(jì)算DNA濃度及純度。
DNA濃度＝(OD260-OD330)×50μg/ml×稀釋倍數(shù)(100)式1DNA純度＝(OD260-OD330)/(OD280-OD330) 式2若DNA純度＜1.6，表明有殘存酚或蛋白質(zhì)含量太高，再用酚/氯仿抽提純化。若DNA純度＞2.0，表明混有核苷酸或RNA，可用RNA酶對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理。本發(fā)明中對(duì)部分DNA樣本進(jìn)行了純化處理，所述純化處理不是必須的。
13)DNA的純化(可選的)加20μl蛋白酶K(10mg/ml)于DNA溶液中，42℃水浴震蕩4小時(shí)，加等體積酚混勻5分鐘，于12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清液加等體積酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提5分鐘，12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸取上清液加等體積氯仿-異戊醇(24∶1)抽提5分鐘，12,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸取上清液于另一離心管中，加1/12體積3M的乙酸鈉及2倍體積的冰凍無水乙醇混勻。用吸管將白色絮狀DNA吸入1.5ml Eppendorf管內(nèi)，70％乙醇洗滌2次，10,000轉(zhuǎn)/分離心30秒，棄去上清液，于室溫使沉淀的DNA干燥，加適當(dāng)體積的TE(pH7.6)重新溶解DNA。采取紫外分光光度法測(cè)定吸光度(A)值利用D260值與D330值將DNA稀釋至0.5μg/ml。
步驟2引物設(shè)計(jì)對(duì)于Notch3基因的第3、4、18、20外顯子的引物來自文獻(xiàn)報(bào)道，其余第2、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、22、23外顯子引物使用DNASTAR及OLIGO軟件自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上述外顯子的上游引物P-F與下游引物P-R的序列如下所示，其中P-F為上游引物、P-R為下游引物，對(duì)于不同的外顯子的具體引物設(shè)計(jì)如下Exon2上游引物P-F5’CCAATGGGGAAACACGAGAGGTT3’；下游引物P-R5’ACTGACCACACCCCCGACTA 3’；Exon3上游引物P-F5’TGTGCTGCCCAACCAAGCCA 3’；下游引物P-R5’ACTGACCACACCCCCGACTA 3；Exon4上游引物P-F5’TAGTCGGGGGTGTGGTCAGT 3’；下游引物P-R5’CCTCTGACTCTCCTGAGTAG 3’；Exon5上游引物P-F5’CAGCCACCTGGCGCATGTCCA 3’；下游引物P-R5’CCTCCTGGTGAGTGAGCCCTACTC 3’；Exon6上游引物P-F5’TGGATGGCGTCA ACACCTAT 3’；下游引物P-R5’CAGACTTCTTATTTGCCCTCAC 3’；Exon7上游引物P-F5’CAACGACAAAACAATACTCAAGGG3’；下游引物P-R5’ACAGCGAGGTCCAGTGTAGC 3’；Exon8上游引物P-F5’CAGGATGTGGACGAGTGCTCTA 3’；下游引物P-R5’TCCAGGCTTCAGTCTCTAAGGG 3’；Exon9上游引物P-F5’ACCCCGTTCACACCATAGG 3’；下游引物P-R5’TGTAAGTTATCCGCTAACGTGGTT 3’；Exon10上游引物P-F5’GCTGGAGAGGGGTGTACTGC 3’；下游引物P-R5’GCCTCCTGATTCTTGTCGG 3’；
Exon11上游引物P-F5’CGCCTCCTGACAGCTTGATG 3’；下游引物P-R5’CGTCAATGTTCACTTCGCAGTT 3’；Exon12上游引物P-F5’GTTTGGGAATGGTGCATCTAGTG3’；下游引物P-R5’CGAAACAACCTTATGCCAATG 3’；Exon13上游引物P-F5’CACAAGAGCTGATGCGTTATGA 3’；下游引物P-R5’CTGGGACTCACAGGCGTCT 3’；Exon14上游引物P-F5’GTCCCCACCTTGATACCCAC 3’；下游引物P-R5’CAGTCACGGCATCTGCTATG 3’；Exon15上游引物P-F5’TCCTCTACTCTCTCCTCCCGCTAT3’；下游引物P-R5’GACCCACACAGGCTGCATATC 3’；Exon16上游引物P-F5’CAAAATGCCCAGACACGA 3’；下游引物P-R5’GGCTTGCACAAGAAGTCACT 3’；Exon17上游引物P-F5’TTCTCAATCCAAGGCATATCCC 3’；下游引物P-R5’GAGGACTCCCCCAAGTCGTT 3’；Exon18上游引物P-F5’GATCCTCCCTCCCACTCCTT 3’；下游引物P-R5’AGGTCCCCAGTAACTCCA 3’；Exon19上游引物P-F5’GGCACCCCCATTCGGCTCACAC 3’；下游引物P-R5’CCAAGTCGGGGCACAGTTTCTCC 3’；Exon20上游引物P-F5’TGTTCCTGTGCCACTCTCCT 3’；下游引物P-R5’ACCTCCTCTTCCCTCTCCT 3’；
Exon21上游引物P-F5’TGGGGGAAGAAACGAGGGGTGGTC3’；下游引物P-R5’TGTGCTGGGGTTCTTTGCGTCTTC 3’；Exon22上游引物P-F5’CCCTCTTGACCACCCCTCGTTT 3’；下游引物P-R5’GAGCGGGAGCATGTAGATCAG 3’；Exon23上游引物P-F5’AGACGCCACGCCCCTACTACTCCA3；下游引物P-R5’CCCGCCTGTCATTCCCCCATTGTG 3’。
這里設(shè)計(jì)的引物可用于對(duì)上述CADASIL的已知基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。對(duì)于其它未知的CADASIL基因突變類型，也可以采用本發(fā)明的方法和上述引物進(jìn)行檢測(cè)。
步驟3進(jìn)行PCR擴(kuò)增1)選擇10個(gè)熱點(diǎn)突變的外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23進(jìn)行外顯子的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)a)PCR擴(kuò)增體系總反應(yīng)體積為約25μl(20μl去離子水、2.5μl的15mM的Mg2+Buffer、2μl的2.5mM dNTP、0.5μl的引物F、0.5μl的引物R、0.5μl的模板DNA及0.3μl的Taq酶)；b)PCR反應(yīng)的試劑H2O使用法國(guó)Millipore公司的純水機(jī)制作的電阻為18.2兆歐的去離子水；dNTP由上海博亞生物技術(shù)有限公司提供。濃度10mmol/μl，使用時(shí)稀釋為2.5mmol/μl；
Taq酶由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院提供5IU/μl；Mg2+Buffer由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院提供，鎂離子濃度為15mmol/μl。
c)PCR反應(yīng)條件其中各外顯子PCR擴(kuò)增的熱循環(huán)條件如下i.95℃預(yù)變性5min；ii.95℃，30sec，[Exon2(60℃，45sec)；Exon3(57℃，45sec)；Exon4(58℃，45sec)；Exon5～Exon22(60℃，45sec)；Exon23(59℃，45sec)]，72℃，70sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
iii.引物序列見前述。
2)凝膠電泳上述PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR產(chǎn)物加入0.5μl上樣緩沖液，進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，電泳電壓130mV，30分鐘后在紫外分析儀(美國(guó)KODAK 120凝膠成像分析系統(tǒng))上檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。如為相應(yīng)長(zhǎng)度的單一PCR擴(kuò)增條帶，即認(rèn)為擴(kuò)增成功，待DHPLC檢測(cè)。含外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23的PCR擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度分別為224bp、420bp、285bp、434bp、497bp、256bp、309bp、249bp、303bp及242bp。
步驟4進(jìn)行DHPLC檢測(cè)DHPLC所用設(shè)備及試劑儀器WAVETMDNA片段分析系統(tǒng)7200(美國(guó)Transgenomic公司)；試劑
Buffer A0.1TEAA(三乙胺醋酸鹽)溶液(50ml 2MTEAA+250μl乙腈定容至1L)；Buffer B0.1TEAA溶液(50ml 2M TEAA+250ml乙腈定容至1L)；Buffer C洗液(8％乙腈80ml乙腈定容至1L)；Buffer D貯藏液(75％乙腈750ml乙腈定容至1L)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp DNA ladder(100bp至600bp的標(biāo)記)，北京天為時(shí)代生物有限技術(shù)公司產(chǎn)品，參照片段為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp。
主要溶液的配置紅細(xì)胞裂解液氯化銨78g碳酸氫銨8gEDTA 18g溶解至1000ml蒸餾水中，pH調(diào)定至7.8，使用時(shí)稀釋10倍，4℃保存。
白細(xì)胞裂解液Tris-Cl10mmol/LEDTA 2mmol/LNaCl 400mmol/L；TE(10mM Tris+1mM EDTA)；
飽和NaCl 5M146.2g溶解至500ml蒸餾水中；6M凝膠加樣緩沖液 0.25％ 溴酚藍(lán)0.25％ 二甲苯青FF50％ 甘油水溶液；5M電泳緩沖液(TBE)Tris 30.25gEDTA-2Na 1.6g硼酸 13.35g。
CADASIL基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)1)DHPLC檢測(cè)以Exon3為例詳述DHPLC檢測(cè)的步驟a)95℃變性5min后以1℃/min速率緩慢降至65℃復(fù)性，然后在WAVEMAKER軟件推薦的對(duì)外顯子Exon3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA解鏈溶解溫度下，將2～3μl的Exon3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由一定比例的Buffer A及Buffer B組成的流動(dòng)相(Buffer A為49％及BufferB為51％)以一定速度帶至DNA分離柱進(jìn)行分離；b)(可選的)對(duì)在一定保留時(shí)間檢測(cè)為正?；蛞吧蛦畏宓脑揚(yáng)CR擴(kuò)增樣品，改變柱溫±1～3℃，優(yōu)選為2℃，即柱溫為66℃繼續(xù)上述操作，檢測(cè)是否出現(xiàn)了雜合的異常多峰；c)對(duì)出現(xiàn)了雜合的異常多峰進(jìn)行基因測(cè)序，對(duì)未出現(xiàn)雜合異常多峰的樣品繼續(xù)重復(fù)步驟b)的檢測(cè)，直至排除雜合的異常多峰。對(duì)含其他外顯子的DHPLC突變檢測(cè)的優(yōu)選條件如表2所示表2對(duì)Notch3基因的含不同外顯子的DHPLC突變檢測(cè)條件

一般認(rèn)為當(dāng)雙鏈DNA在待測(cè)樣品中所占比例為70％-85％時(shí)，分離效果最好。一般情況下，大多數(shù)DHPLC基因突變檢測(cè)推薦在比WAVEMAKER軟件推薦的待測(cè)DNA片段的柱溫約低1℃的柱溫下進(jìn)行。
本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)于DHPLC檢測(cè)中柱溫的選擇，是根據(jù)所要檢測(cè)基因片段的范圍以及柱溫預(yù)測(cè)時(shí)提供的DNA解鏈的溶解曲線，針對(duì)不同基因片段大小及范圍進(jìn)行了相應(yīng)柱溫的選擇，尤其對(duì)于與野生型相一致的單峰出現(xiàn)時(shí)，進(jìn)行了多柱溫的調(diào)整，提高了CADASIL基因突變的檢出率，同時(shí)提供了DHPLC檢測(cè)中最佳的Buffer A與Buffer B的比例。
本發(fā)明在WAVEMAKER軟件推薦柱溫上下各浮動(dòng)1～3℃檢測(cè)突變，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)不同的陽性結(jié)果，如在進(jìn)行Exon11、Exon16、Exon4檢測(cè)時(shí)，使用WAVEMAKER軟件推薦柱溫進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述DHPLC峰型均為與野生型一致的單峰，更換柱溫后(對(duì)于Exon4為柱溫為66℃，且Buffer A為43％及Buffer B為57％；對(duì)于Exon11為柱溫64℃，且Buffer A為42％及Buffer B為58％；對(duì)于Exon16為柱溫為62℃，且Buffer A為42％及Buffer B為58％)，所述DHPLC檢測(cè)出現(xiàn)了雜合的異常雙峰。
同時(shí)本發(fā)明在進(jìn)行柱溫調(diào)整時(shí)，溫度調(diào)整優(yōu)選為2℃。柱溫變化為1℃時(shí)，所述DHPLC檢測(cè)圖形不會(huì)有明顯區(qū)別，柱溫變化為3℃時(shí)，溫度變化過大，易造成溫度過高，使DNA過度解鏈，形成無法判讀的峰型，故溫度調(diào)整以2℃最佳。
本發(fā)明針對(duì)含不同外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建立了適宜的篩查柱溫并提供了適宜的Buffer A與Buffer B的比例，如表2中所示，為相應(yīng)病例缺陷基因的DHPLC檢測(cè)提供了依據(jù)。
將DHPLC分析后的雜合的異常多峰進(jìn)行下一步驟。
步驟5基因測(cè)序?qū)λ鯠HPLC檢測(cè)陽性(出現(xiàn)雜合的異常多峰)的樣本進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，對(duì)重新PCR擴(kuò)增的原液進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型，明確基因突變類型或基因多態(tài)類型。
測(cè)序驗(yàn)證突變對(duì)每類雜合的異常多峰隨機(jī)取一樣品進(jìn)行雙向測(cè)序(利用美國(guó)ABI Prism 377自動(dòng)基因檢測(cè)儀)以驗(yàn)證其基因型。
步驟6剩余外顯子的PCR擴(kuò)增并進(jìn)行DHPLC檢測(cè)對(duì)DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行剩余的12個(gè)外顯子Exon2、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17及Exon22進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上述12個(gè)外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為314bp、431bp、439bp、270bp、218bp、337bp、483bp、416bp、458bp、468bp、406bp及367bp，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，直至找到致病性基因突變類型或排除致病性基因突變類型。
本發(fā)明的檢測(cè)CADASIL基因突變類型的方法將DHPLC方法與直接測(cè)序結(jié)合起來，首先運(yùn)用DHPLC方法對(duì)受檢驗(yàn)者進(jìn)行檢測(cè)，然后只對(duì)DHPLC陽性(有雜合的異常多峰)的樣本進(jìn)行基因測(cè)序，以最終確定致病性基因突變、多態(tài)及野生型基因序列的基因類型。這樣，就大大降低了檢測(cè)的成本，而且檢測(cè)的效率大為提高。
對(duì)圖5、圖7及圖9中經(jīng)DHPLC檢測(cè)為異常多峰的樣品進(jìn)行基因測(cè)序，從對(duì)應(yīng)的基因測(cè)序6、圖8及圖10發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于含外顯子Exon3或外顯子Exon4的不同密碼子的突變基因類型如下
對(duì)圖11、圖13、圖15、圖17、圖19、圖21、圖23、圖25、圖27、圖29、圖31、圖33、圖35、圖37及圖39中經(jīng)DHPLC檢測(cè)為異常單峰或多峰的樣品進(jìn)行基因測(cè)序，從對(duì)應(yīng)的基因測(cè)序12、圖14、圖16、圖18、圖20、圖22、圖24、圖26、圖28、圖30、圖32、圖34、圖36、圖38及圖40中發(fā)現(xiàn)了如下對(duì)應(yīng)不同外顯子的不同密碼子或內(nèi)含子的15種多態(tài)類型
通過上述DHPLC基因測(cè)序方法檢測(cè)到中國(guó)人CADASIL家系患者Notch3基因的幾種類型的致病性基因突變類型分別為外顯子Exon3的密碼子 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)；外顯子Exon4的密碼子134 突變?yōu)?使Cys(半胱氨酸)突變?yōu)門yr(酪氨酸)；外顯子Exon4的密碼子141 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)；外顯子Exon4的密碼子117 突變?yōu)?使Cys(半胱氨酸)突變?yōu)锳rg(精氨酸)；外顯子Exon4的密碼子169 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)；外顯子Exon4的密碼子182 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)。
上述幾種類型的基因突變分別造成膜外區(qū)第2、3 EGF-1ike區(qū)半胱氨酸數(shù)量的奇數(shù)化，為雜合錯(cuò)意突變，奇數(shù)半胱氨酸的不恰當(dāng)配對(duì)或與其他蛋白的交叉聯(lián)系，可導(dǎo)致在Notch3受體細(xì)胞外主要組成部分的EGF重復(fù)區(qū)域內(nèi)形成異常的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。上述幾種基因突變類型均未在100條正常對(duì)照的健康染色體中發(fā)現(xiàn)。
其中中國(guó)人CADASIL家系患者Notch3基因的突變類型Cys134Tyr[外顯子Exon4的密碼子134 突變?yōu)?使Cys(半胱氨酸)突變?yōu)門yr(酪氨酸)]；Cys117Arg[外顯子Exon4的密碼子117 突變?yōu)?使Cys(半胱氨酸)突變?yōu)锳rg(精氨酸)]；Arg169Cys[外顯子Exon4的密碼子169 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)]；以及Arg182Cys[外顯子Exon4的密碼子182 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)]目前在國(guó)內(nèi)外尚無人報(bào)道，為新的致病性DNA基因突變類型。
上述幾種基因突變類型均存在于Notch3的外顯子Exon3及Exon4中，為雜合錯(cuò)意突變，其中一種類型為高度保守的半胱氨酸被其他氨基酸替換，另外一種類型為半胱氨酸替代其他氨基酸，提示Notch3的外顯子Exon3及Exon4兩個(gè)位點(diǎn)同樣是中國(guó)CADASIL家系的熱點(diǎn)突變區(qū)。
基于上述結(jié)果，建議在對(duì)中國(guó)CADASIL患者進(jìn)行基因檢測(cè)時(shí)，同樣首先檢測(cè)Notch3的外顯子Exon3及Exon4兩個(gè)突變位點(diǎn)，如未發(fā)現(xiàn)致病性突變，再進(jìn)行其他的外顯子檢測(cè)。
CADASIL的整個(gè)病程是千變?nèi)f化的，即使在同一個(gè)家系，有的患者直至70歲才出現(xiàn)臨床癥狀，而另一些家庭成員在50歲時(shí)已存在嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，所以對(duì)于家庭成員的早期基因檢測(cè)，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)臨床前期的患者。
本發(fā)明通過利用DHPLC技術(shù)對(duì)中國(guó)CADASIL家系中先證者的一級(jí)親屬進(jìn)行相同位點(diǎn)的基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了兩名來自不同家系的臨床前期的CADASIL患者(其中一名患者是外顯子Exon3的密碼子 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)，來自于家系1，另一名患者是外顯子Exon4的密碼子141 突變?yōu)?使Arg(精氨酸)突變?yōu)镃ys(半胱氨酸)，來自于家系2，目前兩名患者均無卒中樣發(fā)作，神經(jīng)系統(tǒng)查體無陽性定位體征，智能評(píng)定均正常(但其中一例頭顱核磁檢查出現(xiàn)多發(fā)皮層下梗塞)。
臨床前期患者的發(fā)現(xiàn)有助于我們對(duì)中國(guó)人CADASIL患者的自然病程的了解和觀察，為藥物治療，基因治療爭(zhēng)取時(shí)間。同時(shí)，對(duì)于CADASIL患者婚育指導(dǎo)具有重要意義，可早期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，做到優(yōu)生優(yōu)育，并可降低此類疾病的發(fā)生率。
以上所述僅為本發(fā)明的典型實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種CADASIL基因突變類型，其特征在于，在CADASIL基因的Notch3的外顯子Exon3或Exon4至少之一中發(fā)生基因突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門GC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門GT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門GC。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因突變類型，其特征在于，在外顯子Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門GC。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的基因突變類型，其特征在于所述CADASIL基因樣本選自中國(guó)人CADASIL先證者或其親屬。
9.一種檢測(cè)CADASIL基因突變位點(diǎn)的方法，包括以下步驟步驟1提取DNA樣本；步驟2根據(jù)Notch3基因細(xì)胞外34個(gè)EGF-like重復(fù)序列的22個(gè)外顯子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；步驟3選擇10個(gè)熱點(diǎn)突變的外顯子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23進(jìn)行所述外顯子的PCR擴(kuò)增；步驟4運(yùn)用DHPLC技術(shù)對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸分析；步驟5對(duì)所述DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，對(duì)所述重新PCR擴(kuò)增的原液進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型，明確基因突變類型或基因多態(tài)類型；步驟6對(duì)所述DHPLC檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行所述剩余的12個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增并對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，對(duì)所述DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行基因測(cè)序。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外顯子Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門GC。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外顯子Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門GT。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)于Exon5設(shè)計(jì)上游引物P-F為5’CAGCCACCTGGCGCATGTCCA3’；下游引物P-R為5’CCTCCTGGTGAGTGAGCCCTACTC3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及與CADASIL相關(guān)的基因突變類型及其檢測(cè)方法，其中，幾種基因突變類型分別為在外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門AC；在Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門GC；在Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門GT；在Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC；在Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門GC；在Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門GC。該基因測(cè)序方法包括提取DNA樣本；對(duì)22個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物；選擇10個(gè)突變熱點(diǎn)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增；運(yùn)用DHPLC技術(shù)進(jìn)行核苷酸分析；對(duì)DHPLC陽性的樣本進(jìn)行基因測(cè)序，以確定其基因類型；對(duì)DHPLC陰性的樣本進(jìn)行其他外顯子PCR擴(kuò)增，進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，對(duì)DHPLC檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行基因測(cè)序。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1763196SQ20051009851
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日
發(fā)明者陳彪, 唐曉梅, 楊靜芳 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院