OspA的突變片段以及其相關(guān)方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽、一種編碼所述多肽的核酸、一種包含所述多肽和/或所述核酸的藥物組合物(具體地在治療或預(yù)防疏螺旋體感染的方法中用作藥劑)、一種治療或預(yù)防疏螺旋體感染的方法以及一種免疫受試者的方法。
【專利說明】OspA的突變片段以及其相關(guān)方法和用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療疏螺旋體（Borrelia)感染的組合物和方法。具體地 說，本發(fā)明涉及一種包含外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽、一種編碼所述多肽的核 酸、一種包含所述多肽和/或所述核酸的藥物組合物（具體地適于在治療或預(yù)防疏螺旋體 感染的方法中用作藥劑）、一種治療或預(yù)防疏螺旋體感染的方法以及一種免疫受試者的方 法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在歐洲和北美，萊姆疏螺旋體病或萊姆病是最常報(bào)道的蜱傳疾病。所述疾病是由 蟲媒傳播的革蘭氏陰性樣螺旋體廣義伯氏疏螺旋體（B.burgdorferis. 1.)引起，并且是可 涉及多種器官或組織，導(dǎo)致皮膚、心臟、肌肉骨骼和神經(jīng)學(xué)病癥的感染。在大多數(shù)國家，萊姆 疏螺旋體病不是應(yīng)具報(bào)疾病并且沒有關(guān)于年發(fā)病率的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)可用。在美國，致病物為狹 義伯氏疏螺旋體（B.burgdorferis.s)并且萊姆疏螺旋體病定位于東北部、大西洋中部和 中北上部各州。在2010年，美國疾病控制與預(yù)防中心（⑶C)報(bào)道了總計(jì)約30, 000例萊姆 疏螺旋體病。在歐洲，阿氏疏螺旋體（B.afzelii)和伽氏疏螺旋體（B.garinii)為萊姆疏 螺旋體病的主要致病物，而且狹義伯氏疏螺旋體和巴伐利亞疏螺旋體（B.bavariensis)根 據(jù)地理位置在較低程度上促成萊姆疏螺旋體病。萊姆疏螺旋體病的患病率在不同歐洲國家 變化相當(dāng)大，并且從西到東患病率總體逐漸增加。在多數(shù)歐洲國家，報(bào)道的萊姆疏螺旋體病 病例數(shù)目自20世紀(jì)90年代早期開始逐漸增加（例如，捷克共和國、愛沙尼亞、立陶宛；參見 LymeborreliosisinEurope，2006年WHO報(bào)道），并且病例的地理分布也有所擴(kuò)大。
[0004] 疏螺旋體屬于螺旋體科家族，所述螺旋體科家族細(xì)分為醫(yī)學(xué)上重要的密螺旋體 (Treponema)屬、鉤端螺旋體（Leptospira)屬和疏螺旋體屬。廣義伯氏疏螺旋體為約 10-20ym長和0. 2-0. 5ym寬的螺旋狀、運(yùn)動(dòng)活潑的革蘭氏陰性菌，它在微量需氧的條件下 生長。螺旋體細(xì)胞壁由細(xì)胞質(zhì)膜組成，所述細(xì)胞質(zhì)膜由肽聚糖和若干鞭毛圍繞并且接著由 松散結(jié)合的外膜圍繞。
[0005] 萊姆疏螺旋體病通常分階段地發(fā)生，各階段的特征為出現(xiàn)緩解和惡化的不同臨床 表現(xiàn)。階段1，早期感染，由皮膚的局部感染組成；數(shù)天或數(shù)周后為階段2,播散性感染；數(shù)月 至數(shù)年后為階段3,持續(xù)性感染。然而，感染為可變的；一些患者僅患有皮膚的局部感染，而 其他患者僅顯示疾病后期表現(xiàn)，如關(guān)節(jié)炎。萊姆疏螺旋體病的不同臨床癥狀也是由不同的 廣義伯氏疏螺旋物種感染引起。狹義伯氏疏螺旋體更經(jīng)常地引起關(guān)節(jié)表現(xiàn)（關(guān)節(jié)炎）和心 臟問題，阿氏疏螺旋體主要引起皮膚癥狀（游走性紅斑EM和慢性萎縮性肢皮炎ACA)，而伽 氏疏螺旋體牽涉大部分萊姆神經(jīng)疏螺旋體病病例。
[0006] 局部感染-感染的階段1的最常見癥狀為游走性紅斑，這出現(xiàn)于70% -80%的受 感染人群中。這種皮膚損害之后通常為流感樣癥狀，如肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭疼和發(fā)熱。這些非 特異性癥狀出現(xiàn)于50%的患有游走性紅斑的患者中。
[0007] 播散性感染-在階段2期間，細(xì)菌從感染部位移動(dòng)到血流中，到達(dá)遠(yuǎn)端組織和器 官。在此階段出現(xiàn)的神經(jīng)學(xué)、心血管和關(guān)節(jié)炎癥狀包括腦膜炎、顱神經(jīng)病變和間歇性發(fā)炎性 關(guān)節(jié)炎。
[0008] 持續(xù)性感染-感染的階段3為慢性的并且發(fā)生于蜱叮咬之后數(shù)月至數(shù)年間。在北 美最常見的癥狀為由狹義伯氏疏螺旋體感染所引起的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。伽氏疏螺旋體引起的 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)性感染在階段3期間導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)癥狀，并且阿氏疏螺旋體引 起的皮膚的持續(xù)性感染導(dǎo)致慢性萎縮性肢皮炎。
[0009] 在一些危險(xiǎn)群體如農(nóng)民、林業(yè)工人、徒步旅行者、跑步者或度假者中，如同在15歲 以下的兒童和39歲與59歲之間的成人中一樣，血清陽性率和疾病發(fā)病率增加，其中沒有性 別偏好。萊姆疏螺旋體病的這種增加的發(fā)病率與森林棲息地以及社會因素的改變有關(guān)。環(huán) 境改變?nèi)缟制瑪嗷褜?dǎo)致嚙齒動(dòng)物捕食者如狐貍和猛禽類急劇減少，這進(jìn)而導(dǎo)致老鼠數(shù) 量增加，之后導(dǎo)致蜱數(shù)量增加。最近，不均衡的重新造林已增加鹿的數(shù)量并因此增加蜱的數(shù) 量。郊區(qū)擴(kuò)張和用于娛樂如露營和徒步旅行的林地區(qū)域使用的增加使人們與更大數(shù)目的疏 螺旋體屬蜱載體更深入地接觸。所有這些因素共同導(dǎo)致疏螺旋體的更廣泛分布和萊姆疏螺 旋體病的更高發(fā)病率。
[0010] 抗微生物劑為治療疏螺旋體感染的基本方法。所使用的抗生素取決于疾病的階 段、癥狀和患者對藥物的過敏性?？股丿煶痰拈L度也取決于疾病的階段和癥狀的嚴(yán)重性。 早期萊姆疏螺旋體病通常用口服四環(huán)素如多西環(huán)素和半合成青霉素如阿莫西林或青霉素V 來治療。關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)學(xué)病癥用高劑量靜脈內(nèi)青霉素G或頭孢曲松治療。高至30 %的萊姆 疏螺旋體病患者不展示疏螺旋體感染的早期特征癥狀，這使得診斷和治療均成問題?？股?素療程可為較長的（長至數(shù)月）并且有時(shí)為無效的，并且因此在疏螺旋體領(lǐng)域，特別是在晚 期疾病期間很有爭議。即使在有效治療疏螺旋體的情況下，患者也可在數(shù)年過后患有衰弱 疲勞、疼痛或神經(jīng)癥狀，這些稱為治療后萊姆病癥狀。通常，抗生素的使用可產(chǎn)生不希望的 后果，如靶微生物發(fā)展出抗性。最終，抗生素療法可有效地治愈萊姆疏螺旋體病，但沒有對 之后的感染提供保護(hù)。
[0011] 單價(jià)血清型I-OspA-基疫苗（LYMErix?)在美國得到批準(zhǔn)并且在市場上銷售，用于 預(yù)防由狹義伯氏疏螺旋體引起的萊姆病。然而，在歐洲和其它地方的不同血清型中的OspA 序列的異質(zhì)性妨礙了利用來自僅一種血清型的基于OspA的疫苗進(jìn)行有效保護(hù)。
[0012] 包含來自一種OspA血清型的近端部分連同來自另一種OspA血清型的遠(yuǎn)端部分的 嵌合OspA分子在保留這兩種親本多肽的抗原特征的同時(shí)，可用于預(yù)防和治療萊姆病或萊 姆疏螺旋體病（W02011/143617,TO2011/143623)。
[0013] 目前，在市場上沒有用于萊姆疏螺旋體病的預(yù)防性藥劑，并且因此在本領(lǐng)域中需 要開發(fā)可提供針對存在于美國、歐洲和其它地方的疏螺旋體的有效保護(hù)的這種藥劑，特別 是需要開發(fā)可提供同時(shí)針對若干種疏螺旋體血清型的有效保護(hù)的藥劑。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明涉及一種包含疏螺旋體外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽、一種編碼 所述多肽的核酸、一種包含此類核酸分子的載體以及一種包含此類載體的宿主細(xì)胞。此外， 本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生此類多肽的方法和一種用于產(chǎn)生表達(dá)此類多肽的細(xì)胞的方法。另 夕卜，本發(fā)明提供特異性結(jié)合此類多肽的抗體；產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤細(xì)胞；用于產(chǎn)生此類 抗體的方法；包含此類多肽、核酸分子、載體或抗體的藥物組合物；此類多肽、核酸分子、載 體或抗體用于制備藥劑或藥物組合物（具體地用作疫苗或用于治療或預(yù)防疏螺旋體感染 的方法）的用途；用于診斷感染的方法和用于治療或預(yù)防疏螺旋體感染的方法以及免疫受 試者的方法。
[0016] 開發(fā)用于預(yù)防萊姆疏螺旋體病的亞單位疫苗的努力大部分集中于使用疏螺旋體 外表面蛋白A(OspA)作為抗原。OspA蛋白僅在處于蜱載體腸內(nèi)時(shí)由疏螺旋體表達(dá)。因此， 通過疫苗接種產(chǎn)生的OspA抗體在體內(nèi)不會對抗感染，而是在蜱攝食血液時(shí)進(jìn)入其腸內(nèi)。在 腸內(nèi)，抗體中和螺旋體并且阻斷細(xì)菌從蜱的中腸迀移到唾液腺，即阻斷疏螺旋體進(jìn)入脊椎 動(dòng)物宿主所通過的路線。因此，OspA-特異性抗體防止疏螺旋體從蜱載體傳遞到人宿主中。
[0017] 來自狹義伯氏疏螺旋體菌株ZS7的脂化形式的OspA與氫氧化鋁一起由 SmithKlineBeecham(現(xiàn)在為GlaxoSmithKline(GSK))商業(yè)開發(fā)為針對疏螺旋體的疫苗 (LYMErix?)用于美國市場。在一年時(shí)間段內(nèi)需要三個(gè)劑量的LYMErix?以用于最佳保護(hù)。 在前兩個(gè)劑量之后，針對萊姆疏螺旋體病的疫苗效力為49%，并且在第三個(gè)劑量之后為 76%。然而，在LYMErix?商業(yè)可用之后不久，它就在2002年退出了市場。引用的原因?yàn)橐?苗實(shí)際應(yīng)用的問題，例如需要每年或每隔一年加強(qiáng)注射，以及這種預(yù)防方法與早期感染的 抗生素治療相比成本相對較高。此外，一個(gè)問題在于LYMErix?可由于與人蛋白的序列同源 性而在群體亞組中引發(fā)自體免疫反應(yīng)，盡管這并未得到證明。此外，這種疫苗并未提供針對 臨床上重要的疏螺旋體物種的交叉保護(hù)。
[0018] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種用于預(yù)防萊姆疏螺旋體病 的改進(jìn)的疫苗。優(yōu)選地，所述疫苗為容易生產(chǎn)的同時(shí)為保護(hù)性的、安全的且比現(xiàn)有療法更有 效的和/或提供針對多于一種疏螺旋體物種的保護(hù)。
[0019] 本發(fā)明的根本問題通過包含外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽得以解決，其 中所述突變片段由疏螺旋體OspA蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域組成并且與對應(yīng)的野生型片段的不 同之處至少在于至少一個(gè)二硫鍵的引入。
[0020] 意外的是，發(fā)現(xiàn)在突變片段中引入至少一個(gè)二硫鍵相對于包含野生型OspA片段 的多肽而言增加了包含突變OspA片段的多肽的保護(hù)能力，如體內(nèi)感染模型所示的。如實(shí)施 例所示出的，在阿氏疏螺旋體OspAC-末端片段中引入至少一個(gè)二硫鍵相對于沒有二硫鍵 的野生型OspA片段而言增加了其保護(hù)能力。表2和表3所提供的數(shù)據(jù)表明了具有引入的 二硫鍵的突變片段（"S2D1-5"）與野生型OspA片段（"S2D0"）相比的保護(hù)能力，因?yàn)榕c 野生型OspA片段相比，在用突變OspA片段免疫之后更少的動(dòng)物受到感染。一些測試的突 變OspA片段提供與通過陽性對照抗原非脂化全長OspA蛋白所傳達(dá)的保護(hù)比得上的保護(hù)。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種包含外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽， 其中所述突變片段由疏螺旋體OspA的C-末端結(jié)構(gòu)域組成并且與對應(yīng)的野生型片段不同之 處至少在于至少一個(gè)二硫鍵的引入。
[0023] 術(shù)語廣義伯氏疏螺旋體涵蓋至少13種疏螺旋體物種（表A-1)。這些物種出現(xiàn) 于不同的地理區(qū)域，并且以涉及蓖子硬蜱（Ixodesricinus)復(fù)合物（也稱為全溝硬蜱 (Ixodespersulcatus)復(fù)合物）的蜱的地方性動(dòng)物病周期生活在自然界中并且生活在廣 泛范圍的動(dòng)物宿主中。四種疏螺旋體物種為大部分人體感染的原因：狹義伯氏疏螺旋體、 阿氏疏螺旋體、巴伐利亞疏螺旋體和伽氏疏螺旋體。三種其它物種盧西塔尼亞疏螺旋體 (B.Iusitaniae)、比塞蒂疏螺旋體（B.bissettii)和斯柏曼疏螺旋體（B.spielmanii)偶爾 在人體中檢測到，但是它們在萊姆疏螺旋體病中的作用目前還不確定。仍在報(bào)道新的疏螺 旋體物種。
[0024] 表A-L
[0025]
【權(quán)利要求】
1. 一種包含外表面蛋白A(OspA)的突變片段的多肽，其中所述突變OspA片段 a) 由疏螺旋體的OspA蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域組成；并且 b) 與對應(yīng)野生型OspA片段序列的不同之處至少在于至少一個(gè)二硫鍵的引入。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述突變OspA片段與安慰劑對照相比具有至少 50%的在疏螺旋體針攻擊方法中的保護(hù)能力方面的差異（Ape)。
3. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其中當(dāng)在疏螺旋體針攻擊方法中進(jìn)行測量時(shí)，在所述突 變OspA片段中所述至少一個(gè)二硫鍵的所述引入使包含所述突變OspA片段的所述多肽的保 護(hù)能力相對于包含沒有二硫鍵的相應(yīng)OspA片段的多肽增加了 10%，更優(yōu)選增加了 20%，更 優(yōu)選增加了 30 %，更優(yōu)選增加了 40 %，更優(yōu)選增加了 50 %，更優(yōu)選增加了 60 %，更優(yōu)選增加 了 70%，更優(yōu)選增加了 80%，甚至更優(yōu)選增加了 90%。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述OspA可從選自由以下各項(xiàng)組成的組的疏螺 旋體物種中獲得：阿氏疏螺旋體，具體地菌株K78,0spA血清型2(SEQ ID N0:19);狹義伯氏 疏螺旋體，具體地菌株B31，0spA血清型1(SEQ ID N0:20);伽氏疏螺旋體，具體地菌株P(guān)Br， OspA血清型3 (SEQ ID NO :21);巴伐利亞疏螺旋體，具體地菌株P(guān)Bi，OspA血清型4 (SEQ ID N0:22);伽氏疏螺旋體，具體地菌株P(guān)Hei，0spA血清型5(SEQ ID N0:23);伽氏疏螺旋體，具 體地菌株DK29, OspA血清型6(SEQ ID N0:24);以及伽氏疏螺旋體，具體地菌株T25, OspA 血清型 7 (SEQ ID NO :25)。
5. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述至少一個(gè)二硫鍵處于以下位置之 間： a) 位置182+/-3中任一個(gè)與位置269+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置182與269之間 (一硫鍵類型1); b) 位置182+/-3中任一個(gè)與位置272+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置182與272之間 (一硫鍵類型2); c) 位置244+/-3中任一個(gè)與位置259+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置244與259之間 (一硫鍵類型3); d) 位置141+/-3中任一個(gè)與位置241+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置141與241之間 (一硫鍵類型4); e) 位置165+/-3中任一個(gè)與位置265+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置165與265之間 (二硫鍵類型5); f) 位置185+/-3中任一個(gè)與位置272+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置185與272之間 (一硫鍵類型6); g) 位置199+/-3中任一個(gè)與位置223+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置199與223之間 (二硫鍵類型7); h) 位置243+/-3中任一個(gè)與位置262+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置243與262之間 (一硫鍵類型8); i) 位置184+/-3中任一個(gè)與位置204+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置184與204之間 (二硫鍵類型9); j) 位置201+/-3中任一個(gè)與位置214+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置201與214之間 (一硫鍵類型10); k) 位置246+/-3中任一個(gè)與位置259+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置246與259之間 (二硫鍵類型11);和/或 l) 位置167+/-3中任一個(gè)與位置178+/-3中任一個(gè)之間，具體地位置167與178之間 (二硫鍵類型12) 所述位置為阿氏疏螺旋體，具體地阿氏疏螺旋體菌株K780spA血清型2的OspA的位 置，或者為來自除阿氏疏螺旋體菌株K78之外的疏螺旋體的OspA的同源氨基酸位置，所述 除阿氏疏螺旋體菌株K78之外的疏螺旋體具體為狹義伯氏疏螺旋體，具體地菌株B31，OspA 血清型1 ;伽氏疏螺旋體，具體地菌株P(guān)Br，OspA血清型3 ;巴伐利亞疏螺旋體，具體地菌株 PBi，OspA血清型4 ;伽氏疏螺旋體，具體地菌株P(guān)Hei，OspA血清型5 ;伽氏疏螺旋體，具體地 菌株DK29, OspA血清型6 ;或伽氏疏螺旋體，具體地菌株T25, OspA血清型7。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述突變OspA片段源于由SEQ ID NO: 34、SEQIDN0:35、SEQIDN0:179、SEQIDN0:180、SEQIDN0 :181、SEQIDN0:182#& SEQ ID NO :183組成的氨基酸序列組，并且與所述氨基酸序列的不同之處至少在于至少一 個(gè)二硫鍵的所述引入，具體地其中所述至少一個(gè)二硫鍵處于以下位置之間： a) 位置182與269之間（二硫鍵類型1); b) 位置182與272之間（二硫鍵類型2); c) 位置244與259之間（二硫鍵類型3); d) 位置141與241之間（二硫鍵類型4); e) 位置165與265之間（二硫鍵類型5); f) 位置185與272之間（二硫鍵類型6); g) 位置199與223之間（二硫鍵類型7); h) 位置243與262之間（二硫鍵類型8); i) 位置184與204之間（二硫鍵類型9); j) 位置201與214之間（二硫鍵類型10); k) 位置246與259之間（二硫鍵類型11);和/或 l) 位置167與178之間（二硫鍵類型12)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽， a) 其中所述多肽為脂化的或者其中所述多肽包含脂化信號，優(yōu)選疏螺旋體外表面蛋白 (〇sp)的脂化信號，更優(yōu)選MKKYLLGIGLILALIA(SEQ ID N0:14)或MRLLIGFALALALIG(SEQ ID 勵(lì)：15)，最優(yōu)選大腸桿菌來源的1--脂化信號]\0^1'1(1^11^￥11^3111^6(5￡〇10勵(lì)：16) ;和 /或 b) 其中所述多肽不包含氨基酸序列GYVLEGTLTAE(SEQ ID N0:17)，特別地說其中所述 氨基酸序列GYVLEGTLTAE(SEQ ID N0:17)由來自除狹義伯氏疏螺旋體菌株B31之外的疏螺 旋體物種的同源序列置換，優(yōu)選由NFTLEGKVAND(SEQ ID NO :18)置換；和/或 c) 其中所述多肽包含接頭肽，它前面是作為脂化位點(diǎn)的N-末端半胱氨酸殘基，優(yōu)選 CSS 或 CKQN(SEQ ID N0:211);和 / 或 d) 其中二硫鍵的所述引入是通過引入一個(gè)半胱氨酸從而與OspA片段的非突變部分的 半胱氨酸形成所述二硫鍵來實(shí)現(xiàn)；和/或 e) 其中二硫鍵的所述引入是通過引入兩個(gè)半胱氨酸從而形成所述二硫鍵來實(shí)現(xiàn)；和/ 或 f) 其中二硫鍵的所述引入是通過引入一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸，具體地通過氨基酸添加或 優(yōu)選取代來實(shí)現(xiàn)；和/或 g) 其中所述突變OspA片段與所述對應(yīng)野生型OspA片段的不同之處僅在于至少一個(gè)二 硫鍵的所述引入，具體地僅在于一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)二硫鍵的引入；和/或 h) 其中OspA蛋白的所述C-末端結(jié)構(gòu)域包含所述OspA蛋白的140與152個(gè)之間的最 C-末端連續(xù)氨基酸；和/或 i) 其中所述多肽不包含OspA的N-末端0 -折疊。
8. 如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽，其包含如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的 至少兩個(gè)突變OspA片段。
9. 如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的異二聚 體或者由其組成：Lip-S1D4-S2D4(SEQ ID N0:185)、Lip-SlDl-S2Dl(SEQ ID N0:186)、 Lip-S3D4-S4D4(SEQ ID N0:187)、Lip-S3Dl-S4Dl(SEQ ID N0:188)、Lip-S5D4-S6D4(SEQ ID N0:189)、Lip-S5Dl-S6Dl(SEQ ID N0:190)、Lip-S2D4-S 1D4(SEQ ID N0:191)、Lip-S2Dl-S 1D1(SEQ ID NO ：192),Lip-S4D4-S3D4(SEQ ID NO ：193),Lip-S4Dl-S3Dl(SEQ ID N0：194), Lip-S6D4-S5D4(SEQ ID N0:195)、Lip-S6Dl-S5Dl(SEQ ID N0:196)、Lip-SlD4-S2Dl(SEQ ID NO :197)、Lip-S1D1-S2D4(SEQ ID NO :198)、S3D4-S4D1(SEQ ID NO :199)、S3D1-S4D4(SEQ ID NO ：200),S5D4-S6D1(SEQ ID NO ：201).S5D1-S6D4(SEQ ID NO ：202).S2D4-S1D1(SEQ ID NO ：203), S2D1-S1D4(SEQ ID NO ：204), S4D4-S3D1 (SEQ ID NO ：205), S4D1-S3D4 (SEQ ID N0:206)、S6D4-S5D1(SEQ ID N0:207)以及 Lip-S6D1-S5D4(SEQ ID N0:208)。
10. 如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的異二聚 體或者由其組成：Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID N0:186)、Lip-S4Dl-S3Dl(SEQ ID N0:194)以及 Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO :190)。
11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多肽 a) 其中所述至少兩個(gè)突變OspA片段的兩個(gè)突變OspA片段通過接頭連接，具體地其中 所述接頭包含 GTSDKNNGSGSKEKNKDGKY S(SEQ ID N0:184);和 / 或 b) 其中所述多肽的總大小為至多500個(gè)氨基酸，所述多肽包含如權(quán)利要求1至7中任 一項(xiàng)所述的兩個(gè)不同的突變OspA片段；和/或 c) 其中所述多肽包含接頭肽，它前面是作為脂化位點(diǎn)的N-末端半胱氨酸殘基，優(yōu)選 CSS 或 CKQN(SEQ ID N0:211);和 / 或 d) 其中所述多肽包含（i)如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的兩個(gè)不同的突變OspA片 段；（ii)由氨基酸序列 GTSDKNNGSGSKEKNKD GKYS(SEQ ID NO :184)組成的接頭；以及（iii) 任選的作為脂化位點(diǎn)的N-末端半胱氨酸殘基，優(yōu)選CSS ;和/或 e) 其中所述多肽包含（i)如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的兩個(gè)不同的突變OspA片 段；（ii)由至多 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11個(gè)氨基酸，優(yōu)選至多10、9、 8、7或6個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至多5、4、3、2或1個(gè)氨基酸組成的片段的N-末端延伸，其中所述 N-末端延伸直接位于所述相應(yīng)疏螺旋體OspA中的所述片段的N-末端；以及（iii)任選的 N-末端半胱氨酸或N-末端CSS肽或CKQN肽（SEQ ID N0:211)。
12. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的多肽，其包含選自下組的多肽或者由其組成： 具有SEQ ID NO :185至208的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何功能變體，其優(yōu)選與所 述序列SEQ ID NO : 185至208中任一個(gè)具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少 90%，最優(yōu)選至少95%的序列同一*性。
13. -種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽的核酸。
14. 一種包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸分子的載體。
15. -種包含如權(quán)利要求13所述的核酸或如權(quán)利要求14所述的載體的宿主細(xì)胞，其中 所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌。
16. -種用于產(chǎn)生表達(dá)如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽的細(xì)胞的方法，其包括 用如權(quán)利要求14所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞。
17. -種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，其包括表達(dá)根據(jù) 權(quán)利要求13所述的核酸。
18. -種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，其特征在于以下 步驟： a) 將編碼所述多肽的載體引入到宿主細(xì)胞中； b) 使所述宿主細(xì)胞在允許所述多肽表達(dá)的條件下生長； c) 使所述宿主細(xì)胞均質(zhì)化；以及 d) 使所述宿主細(xì)胞均漿經(jīng)受純化步驟。
19. 一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽和/或根據(jù)權(quán) 利要求13所述的核酸中的至少一種以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。 20?-種藥物組合物，其包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID N0:186)、Lip-S4Dl-S3Dl(SEQ ID N0:194)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID N0:190)以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。 21?-種藥物組合物，其包含 Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID N0:186)和 Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO :190)以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。 22?-種藥物組合物，其包含 Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID N0:186)和 Lip-S4D1-S3D1(SEQ ID NO :194)以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。 23?-種藥物組合物，其包含 Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO :194)和 Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO :190)以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19至23中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的賦形 劑包括L-甲硫氨酸。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其還包含來自疏螺旋體或除疏 螺旋體之外的病原體的至少一種另外的抗原。
26. 如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述另外的抗原來自蜱傳病原體。
27. 如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中所述蜱傳病原體選自包括以下各項(xiàng)的組： 赫姆斯疏螺旋體、扁虱疏螺旋體、達(dá)氏疏螺旋體、宮本疏螺旋體、特里蜱疏螺旋體、立氏立克 次體、澳洲立克次體、康諾爾立克次體、瑞士立克次體、帕氏立克次體、土拉弗朗西斯菌、嗜 吞噬細(xì)胞無形體、腺熱埃立希體、查菲埃立克體、伯納特氏立克次氏體以及孤星疏螺旋體、 蜱傳腦炎病毒（TBEV)、科羅拉多蜱傳熱病毒（CTFV)、克里米亞-剛果出血熱病毒（CCHFV)、 庫阿撒魯爾森林病毒（KFDV)、波瓦森病毒、哈特蘭病毒、鄂木斯克出血熱病毒（0HFV)以及 巴貝西蟲某種。
28. 如權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述至少一種另外的抗原包 含在第二疫苗組合物中。
29. 如權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中所述第二疫苗組合物優(yōu)選為蜱傳腦炎疫 苗、日本腦炎疫苗或落基山斑瘆熱疫苗。
30. 根據(jù)權(quán)利要求19至29中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于其還包含優(yōu)選地選 自由以下各項(xiàng)組成的組的免疫刺激物質(zhì)：聚陽離子聚合物，特別地聚陽離子肽；免疫刺激 寡脫氧核苷酸（ODN)，特別地寡（dIdC)13(SEQ ID NO:32);含有至少兩個(gè)LysLeuLys基序的 肽，特別地肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:33);神經(jīng)活性化合物，特別地人生長激素；氫氧化 鋁或磷酸鋁、弗氏完全或不完全佐劑或其組合。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述免疫刺激物質(zhì)為聚陽離子聚合物和 免疫刺激脫氧核苷酸的組合或者為含有至少兩個(gè)LysLeuLys基序的肽和免疫刺激脫氧核 苷酸的組合，優(yōu)選為 KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:33)和寡（dIdC)13(SEQ ID NO:32)的組合。
32. 如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述聚陽離子肽為聚精氨酸。
33. 如權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物為疫苗。
34. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽或如權(quán)利要求19至33中任一項(xiàng)所述的藥 物組合物，其用作藥劑，具體地用作疫苗。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)所 述的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防疏螺旋體感染，具體地狹義伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋 體、阿氏疏螺旋體、安德森疏螺旋體、巴伐利亞疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體、法雷斯疏螺旋 體、盧西塔尼亞疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、日本疏螺旋體、坦尼基疏螺旋體、土德疏螺旋體 或西尼伽疏螺旋體感染，優(yōu)選狹義伯氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或伽氏疏螺旋體感染的方 法。
36. -種治療或預(yù)防有需要的受試者中的疏螺旋體感染的方法，其包括向所述受試者 施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求19至32中 任一項(xiàng)所述的藥物組合物的步驟；或者一種免疫有需要的受試者的方法，其包括向所述受 試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求18至33 中任一項(xiàng)所述的藥物組合物的步驟。
37. -種抗體或至少其有效部分，其選擇性地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變OspA片 段，但并不結(jié)合所述對應(yīng)的野生型OspA片段。
38. 如權(quán)利要求37所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述突變OspA片段的所述二硫鍵。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述有效部分包含F(xiàn)ab片段、 F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37至40中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體。
42. 根據(jù)權(quán)利要求37至41中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為人源化抗體。
43. -種雜交瘤細(xì)胞系，其產(chǎn)生如權(quán)利要求37至42中任一項(xiàng)所述的抗體。
44. 一種用于產(chǎn)生如權(quán)利要求37至43中任一項(xiàng)所述的抗體的方法，其特征在于以下步 驟： a)通過向非人動(dòng)物施用如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽來起始所述動(dòng)物中的 免疫反應(yīng)； b) 從所述動(dòng)物中取出含有抗體的體液；以及 c) 通過使所述含有抗體的體液經(jīng)受另外的純化步驟來產(chǎn)生所述抗體。
45. -種用于產(chǎn)生如權(quán)利要求37至43中任一項(xiàng)所述的抗體的方法，其特征在于以下步 驟： a) 通過向非人動(dòng)物施用如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽來起始所述動(dòng)物中的 免疫反應(yīng)； b) 從所述動(dòng)物中取出脾或脾細(xì)胞； c) 產(chǎn)生所述脾或脾細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞； d) 選擇并克隆對所述多肽特異的雜交瘤細(xì)胞； e) 通過培養(yǎng)所述克隆的雜交瘤細(xì)胞來產(chǎn)生所述抗體；以及 f) 任選地進(jìn)行另外的純化步驟。
46. -種用于使動(dòng)物或人對疏螺旋體生物體引起的感染免疫的方法，其包括以下步驟： 向所述動(dòng)物或人施用有效量的如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽、或如權(quán)利要求13 所述的核酸分子、或如權(quán)利要求14所述的載體或如權(quán)利要求19至33中任一項(xiàng)所述的藥物 組合物，其中所述有效量適合于在所述動(dòng)物或人中引發(fā)免疫反應(yīng)。
47. -種用于在動(dòng)物或人中刺激針對疏螺旋體生物體的免疫反應(yīng)的方法，其包括以下 步驟：向所述動(dòng)物或人施用有效量的如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽、或如權(quán)利要 求13所述的核酸分子、或如權(quán)利要求14所述的載體或如權(quán)利要求19至33中任一項(xiàng)所述 的藥物組合物，其中所述有效量適合于在所述動(dòng)物或人中刺激所述免疫反應(yīng)。
48. 如權(quán)利要求46或47所述的方法，其中所述疏螺旋體生物體選自包括以下各項(xiàng)的 組：伯氏疏螺旋體，具體地狹義伯氏疏螺旋體；伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、安德森疏螺 旋體、巴伐利亞疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體、法雷斯疏螺旋體、盧西塔尼亞疏螺旋體、斯柏曼 疏螺旋體、日本疏螺旋體、坦尼基疏螺旋體、土德疏螺旋體或西尼伽疏螺旋體，優(yōu)選狹義伯 氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或伽氏疏螺旋體。
【文檔編號】A61K39/02GK104487084SQ201380035702
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】帕爾·科姆斯泰特, 烏爾班·倫德貝格, 安德烈亞斯·邁因克, 馬庫斯·漢納, 沃爾夫?qū)な胬? 本亞明·維策爾, 克里斯托夫·賴尼施, 布里吉特·格羅曼, 羅伯特·施勒格爾 申請人:瓦爾尼瓦奧地利有限責(zé)任公司