專利名稱：一種組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及將來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞在體外分別向脂肪和向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞與生物材料相結(jié)合，共同構(gòu)建組織工程脂肪組織的方法，利用此方法可制備用于彌補(bǔ)軟組織缺陷、創(chuàng)傷組織修復(fù)以及正常組織的填充塑型物。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織最新公布數(shù)據(jù)表明，過(guò)去20年間，世界乳腺癌的發(fā)病率幾乎翻了一番，目前全球約有100萬(wàn)乳腺癌患者。乳腺癌已經(jīng)繼皮肽癌之后成為女性的頭號(hào)健康殺手。在中國(guó)，女性乳腺癌發(fā)病率也在逐漸上升，目前已從1999年的十萬(wàn)分之十七增加到2004年的十萬(wàn)分之五十二，上升超過(guò)三倍。其中發(fā)病率最高是北京、上海、廣州、深圳等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的大城市，而且呈現(xiàn)生活水平越高發(fā)病率越高的趨勢(shì)，發(fā)病年齡也由中老年婦女向青年女性擴(kuò)展。在美國(guó)，每3位女性癌癥患者中就有一例是乳腺癌患者。乳腺癌的治療往往需要切除女性的整個(gè)乳房，這給女性精神上帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)和痛苦，嚴(yán)重影響了女性患者后期的生活質(zhì)量，故乳腺根除的同時(shí)都伴有乳腺的重建。每年美國(guó)女性乳腺根除重建手術(shù)約有8萬(wàn)多例，并且逐年遞增。此外，每年對(duì)胸部進(jìn)行美容做乳房增大手術(shù)(隆胸)的女性也多達(dá)24萬(wàn)人。
無(wú)論是乳房的重建還是乳房的增大都與軟組織的缺損修復(fù)有關(guān)。軟組織的缺損修復(fù)主要是組織形態(tài)和外表輪廓的維護(hù)與修復(fù)，目前臨床采用的方法主要為異體、自體組織移植以及假體的填充。組織移植是從異體或自體其他部位獲取組織塊移植到缺損組織，它實(shí)際上是一種以創(chuàng)傷修復(fù)另一種創(chuàng)傷的方法，具有很大的風(fēng)險(xiǎn)性，往往伴有多種不良反應(yīng)和并發(fā)癥。各種假體的填充植入也常常會(huì)引起組織紅腫、疼痛、膠囊假體填充液滲漏、囊外包膜纖維化攣縮以及免疫功能障礙多種炎癥反應(yīng)和不良現(xiàn)象。
隨著20世紀(jì)90年代組織工程學(xué)概念的提出和不斷發(fā)展，目前人們把軟組織缺損修復(fù)的目光投向脂肪組織工程。即將適當(dāng)?shù)姆N子細(xì)胞與生物支架材料相結(jié)合，在一定的微環(huán)境下，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成一定量的脂肪細(xì)胞和組織，再移植到患者體內(nèi)填充修復(fù)缺損的組織。其中種子細(xì)胞是工程化首要關(guān)鍵因素。
最初人們利用吸脂術(shù)提取出來(lái)的脂肪顆粒細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)移植，但沒(méi)有取得理想的效果。植入的脂肪細(xì)胞多數(shù)很快壞死、液化和吸收(Ellenbogen R.1990)。這是由于成熟的脂肪細(xì)胞胞漿中80％～90％是由脂滴組成，容易受機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞活性的喪失。此外，成熟的脂肪細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，不能夠在體內(nèi)有效的增殖發(fā)育。
近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人體組織內(nèi)具有一類能夠不斷自我更新和增殖，具有多向分化潛能的細(xì)胞群體——干細(xì)胞。它能夠在體外培養(yǎng)、增殖并且分化成不同的組織細(xì)胞。有證據(jù)表明(Zuk P.A，2001)分離自經(jīng)膠原酶處理后的脂肪組織的基質(zhì)-血管部分含有大量的前脂肪細(xì)胞，或傾向于分化為脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞。這些細(xì)胞能以較低的頻率自發(fā)地分化為脂肪細(xì)胞，在脂肪促進(jìn)劑(如地塞米松，IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)等)的作用下，可提高這些細(xì)胞的分化效率。他們很容易從脂肪組織獲取，能夠在體外大規(guī)模培養(yǎng)和擴(kuò)增，性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械抵抗力強(qiáng)。它們?cè)隗w外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境或體內(nèi)固有的微環(huán)境下能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪和血管內(nèi)皮等組織。研究表明，在體外脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠種植在適當(dāng)?shù)纳镏Ъ懿牧仙线M(jìn)行生長(zhǎng)和增殖，在一定的誘導(dǎo)條件下也能夠分化成為脂肪組織(Zuk P.A，2001)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(Planat-Benard，2004)。內(nèi)皮細(xì)胞不但能夠促進(jìn)脂肪組織的發(fā)育(Hutley L.J，2001；Aokis，2003)，也是形成毛細(xì)血管壁的主要細(xì)胞，能夠促進(jìn)微血管網(wǎng)絡(luò)的生成，從而營(yíng)養(yǎng)脂肪組織(Neels J.G，2004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了使來(lái)源于脂肪組織的干細(xì)胞分化為具有脂肪細(xì)胞和血管內(nèi)皮性質(zhì)之細(xì)胞的方法和組合物，與適當(dāng)?shù)纳锘钚圆牧辖Y(jié)合后，用于移植到患者軟組織缺損部位，發(fā)揮修復(fù)矯正受治療者軟組織的作用。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(1)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的分離培養(yǎng)1)人類脂肪組織可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缡中g(shù)或脂肪抽吸術(shù)而獲得。脂肪抽吸術(shù)是目前應(yīng)用最為普遍的方法，因此脂肪抽吸物是本發(fā)明細(xì)胞的一個(gè)特別優(yōu)選來(lái)源。
2)獲取的脂肪組織以生理學(xué)相容性溶液諸如磷酸緩沖液沖洗，隨后在脂肪組織中加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和紅細(xì)胞等。
3)用蛋白水解酶(例如膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等)水解方法解離組織，此類酶可減弱或破壞細(xì)胞間的結(jié)合，從脂肪結(jié)締組織基質(zhì)中釋放出游離的脂肪細(xì)胞。由于成熟脂肪細(xì)胞的密度較低，通常浮在等滲緩沖溶液的上層，脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞將沉淀到溶液下層，而中間層則包括結(jié)締組織基質(zhì)和脂肪細(xì)胞聚集體。
4)使用平衡密度離心方法分離得到富含脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群體的部分(下層)。
5)用磷酸緩沖液懸浮沉淀的細(xì)胞，通過(guò)加入高張鹽溶液保溫及加入紅細(xì)胞裂解液等方法破壞并除去殘留的紅細(xì)胞。懸浮的細(xì)胞可經(jīng)過(guò)一次或連續(xù)多次(2～3次)的洗滌，再離心和重懸浮以獲得更高的純度。或者，這些細(xì)胞可通過(guò)使用流式細(xì)胞儀分選或根據(jù)細(xì)胞的大小和基粒的有無(wú)進(jìn)行分離，干細(xì)胞較小并相對(duì)無(wú)基粒。
6)最終的分離和重懸浮之后，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以增加干細(xì)胞的數(shù)量。常用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，馬血清等)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)或者D/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)傳代的細(xì)胞形態(tài)如附圖1所示。
(2)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，離心。以PBS洗滌細(xì)胞2～3次后，用1ml PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，按5×105個(gè)細(xì)胞/管將細(xì)胞平均分至多個(gè)EP管中，分別將PE或FITC標(biāo)記的多個(gè)抗體進(jìn)行組合，加入各管中，室溫下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
(3)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的成脂肪誘導(dǎo)分化1)將擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞應(yīng)用誘導(dǎo)分化的限定培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
2)誘導(dǎo)脂肪組織發(fā)生的培養(yǎng)基可以是含有糖皮質(zhì)激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類似物)以及其他一些物質(zhì)。例如一種誘導(dǎo)方案是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
(4)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)分化1)將脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞使用誘導(dǎo)分化的限定培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
2)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮組織發(fā)生的培養(yǎng)基可以是含2～8％胎牛血清的低糖DMEM或者D/F12，其中加入2～10ng/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、2～10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素、地塞米松、牛血清白蛋白(BSA)、一些氨基酸(如鳥氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺)以及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳)等。
(5)構(gòu)建含有誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的工程化的脂肪組織1)將第3～8代大規(guī)模生產(chǎn)的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，滴加種植在適當(dāng)?shù)摹⒖山到獾摹?×2cm2大小的長(zhǎng)方形狀的PLGA生物活性支架材料上。將細(xì)胞材料復(fù)合體放入負(fù)壓容器中，負(fù)壓處理，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面。再加含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)。換成成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～21天。
2)同時(shí)將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中向成脂肪組織細(xì)胞誘導(dǎo)，在顯微鏡下觀察有脂質(zhì)小泡存在，判定已出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化趨勢(shì)后，將細(xì)胞消化處理制成細(xì)胞懸液，滴加種植在有血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的支持材料的另一面，將細(xì)胞材料復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％ CO2，飽和濕度下孵育1～2小時(shí)，使細(xì)胞粘附到材料上面，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液。
3)繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)后換成成脂誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)3～5天，隨后換成含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3～5天后即可用于體內(nèi)填充植入。
應(yīng)用本發(fā)明方法所獲得的含有脂肪干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的細(xì)胞群體可和任何可植入結(jié)構(gòu)如經(jīng)過(guò)塑型的生物降解型高分子材料如膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA等相結(jié)合后一起植入。植入結(jié)構(gòu)的性質(zhì)將根據(jù)實(shí)際用途而不同。植入結(jié)構(gòu)可以包括成熟組織，也可以包括未成熟組織或不同組織及其支持材料。例如，植入結(jié)構(gòu)可以包括正在經(jīng)歷分化的應(yīng)用本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞群體，單一或以組合方式種植在適當(dāng)大小和維度的生物降解型高分子材料上。從而應(yīng)用于制備彌補(bǔ)軟組織缺陷和創(chuàng)傷組織修復(fù)的填充塑型物以及制備用于美容的正常組織填充塑型物。
本發(fā)明是將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞在體外分別向脂肪和向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后再與適當(dāng)?shù)?、可降解的、塑成一定形狀的生物活性支架材料結(jié)合起來(lái)，共同移植到受體部位，重新生成新的脂肪組織。不僅可以用于一些組織的填充、修復(fù)還可以用于乳腺的重建、增大、矯正和美容。例如，頭面部與頸部腫瘤的切除、各種復(fù)合型創(chuàng)傷、先天性畸形的填充修復(fù)以及臉頰、嘴唇等部位的美容和皺紋去除。因此，市場(chǎng)價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1第二代脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100倍)。
圖2脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的流式分析(1)FITC陰性對(duì)照；(2)CD90表達(dá)陽(yáng)性；(3)CD45表達(dá)陰性；(4)CD44表達(dá)陰性；(5)CD71表達(dá)陽(yáng)性；(6)CD16表達(dá)陰性；(7)CD30表達(dá)陰性；(8)PE陰性對(duì)照；(9)CD34表達(dá)陰性；(10)CD29表達(dá)陽(yáng)性；(11)CD3表達(dá)陰性；(12)CD11b表達(dá)陰性；(13)CD133表達(dá)陰性；(14)CD19表達(dá)陰性。
圖3脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的向脂肪細(xì)胞分化a成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，細(xì)胞內(nèi)充滿脂質(zhì)的液泡呈油紅O染色陽(yáng)性；b成脂誘導(dǎo)一周的細(xì)胞中充滿脂質(zhì)的小滴(×100倍)；c成脂誘導(dǎo)二周細(xì)胞充滿脂質(zhì)的小滴(×200倍)。
圖4脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化及免疫熒光檢測(cè)。
a誘導(dǎo)分化7天后，細(xì)胞排列成條索狀，并形成血管腔樣結(jié)構(gòu)；b免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化細(xì)胞flt-1陽(yáng)性表達(dá)；c免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化后7天部分細(xì)胞CD31陽(yáng)性表達(dá)；d免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化后7天部分細(xì)胞CD34陽(yáng)性表達(dá)；e免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化后14天細(xì)胞vWF陽(yáng)性表達(dá)；f免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化后14天細(xì)胞flk-1陽(yáng)性表達(dá)。
圖5工程化脂肪組織NOD/SCID小鼠皮下移植及體內(nèi)免疫熒光檢測(cè)。
a；5周后小鼠腹部皮下形成的隆丘；b工程化組織塊上白色脂肪層的形成；c免疫熒光鑒定，NOD/SCID鼠體內(nèi)工程化脂肪組織人核蛋白陽(yáng)性表達(dá)；d免疫熒光鑒定，NOD/SCID鼠體內(nèi)工程化脂肪組織人CD34陽(yáng)性表達(dá)；e免疫熒光鑒定，NOD/SCID鼠體內(nèi)工程化脂肪組織人CD31陽(yáng)性表達(dá)；f免疫熒光鑒定，NOD/SCID鼠體內(nèi)工程化脂肪組織人vWF陽(yáng)性表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)擴(kuò)增用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)反復(fù)沖洗吸脂手術(shù)得到的吸出物，隨后在其中加入PBS，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和部分紅細(xì)胞等，然后加入濃度約為0.1％的膠原酶，輕輕攪拌下37℃消化45分鐘。1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀物，并將沉淀懸浮于紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl)中，室溫靜置10分鐘后，再次離心收集細(xì)胞。如此反復(fù)處理兩次，以盡可能地破碎并除去紅細(xì)胞。細(xì)胞懸液離心收集下層細(xì)胞沉淀物，然后使用溴酚蘭染料排除法檢測(cè)細(xì)胞的存活率并計(jì)數(shù)活細(xì)胞的比例。
存活細(xì)胞在含10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基中37℃、5％CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80％匯合時(shí)，傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞形成單層后用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化解離單層并收集游離的細(xì)胞，準(zhǔn)備用于分化培養(yǎng)基中進(jìn)行干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)。
實(shí)施例2脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，離心。以PBS洗滌細(xì)胞2次后，用1ml PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，按5×105個(gè)細(xì)胞/管將細(xì)胞平均分至多個(gè)EP管中，分別將PE或FITC標(biāo)記的多個(gè)抗體(CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19)進(jìn)行組合，加入各管中，室溫下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。結(jié)果顯示，脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，CD90、CD29和CD71表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明其是間質(zhì)來(lái)源的一類具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化及應(yīng)用使用含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％青霉素/鏈霉素，0.5mM IBMX的DMEM培養(yǎng)基在常規(guī)條件(37℃，5％CO2)下對(duì)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)7～15天后，取誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞克隆，甲醇固定2min，50％酒精漂洗，加入油紅O染料染色10min，50％酒精漂洗后，用水沖洗，蘇木精復(fù)染1min，鏡下觀察染色情況，呈油紅O染色陽(yáng)性，表明細(xì)胞內(nèi)有脂質(zhì)小泡存在，根據(jù)這一特征可判定干細(xì)胞已出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化的趨勢(shì)。將未分化的或部分向脂肪細(xì)胞分化的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞單獨(dú)注射或手術(shù)方式植入到接受治療的區(qū)域如臉頰、嘴唇等部位以除皺和/或美容。
實(shí)施例4組織工程化脂肪細(xì)胞體外誘導(dǎo)及應(yīng)用將大規(guī)模擴(kuò)增的第3～8代脂肪來(lái)源的干細(xì)胞制成1～2×105/ml的細(xì)胞懸液，輕輕滴加種植在可降解的、1×2cm2大小的長(zhǎng)方形狀的PLGA生物活性支架材料上，生物活性支架材料表面可預(yù)先包被含有5ng/ml bFGF的0.5％的明膠，隨著明膠的降解，bFGF將會(huì)緩慢釋放，促使細(xì)胞以后在體內(nèi)微環(huán)境和誘導(dǎo)因子的雙重作用下誘導(dǎo)脂肪組織的生成。將細(xì)胞材料復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％CO2，飽和濕度下靜置6～10小時(shí)，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面。再加含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。換成成脂誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，如DMEM，其中含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％青霉素/鏈霉素，0.5mM IBMX。細(xì)胞與材料共培養(yǎng)7～14天后即可用于體內(nèi)填充植入。
實(shí)施例5脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化條件培養(yǎng)基為含2％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF、1×ITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白(BSA)2g/L、鳥氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及10-6微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳)等。將大規(guī)模擴(kuò)增的第3～8代脂肪來(lái)源的干細(xì)胞以條件培養(yǎng)基重懸，按2×104/cm2接種于預(yù)先鋪好Matrigel(1∶3比例稀釋)的培養(yǎng)板內(nèi)，每3天換液一次。誘導(dǎo)后7天顯微鏡下觀察，細(xì)胞排列成條索狀，并形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后7天、14天的細(xì)胞做成細(xì)胞爬片，PBS洗滌，4％的多聚甲醛室溫原位固定15分鐘，0.1％Triton和3％過(guò)氧化氫孵育透膜處理10min，蒸餾水沖洗，20％馬血清37℃孵育封閉15分鐘，分別加內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD31、Flk-1、vWF、Flt-1抗體工作液，濕盒中放4℃過(guò)夜后，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)CD34、CD31、flt-1、flk-1、vWF均為陽(yáng)性表達(dá)。
實(shí)施例6工程化脂肪組織的構(gòu)建1)用含10％FBS的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞，取第5代細(xì)胞制成1～2×105/ml的細(xì)胞懸液，輕輕滴加種植在適當(dāng)?shù)?、可降解的?×2cm2大小的長(zhǎng)方形狀的PLGA生物活性支架材料上。將細(xì)胞材料復(fù)合體放入負(fù)壓容器中，抽真空1分鐘后取出，于37℃，5％CO2，飽和濕度下靜置2～4小時(shí)，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面。再加含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)。換成實(shí)施例4中所述血管內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～21天，顯微鏡下觀察細(xì)胞排列成條索狀，形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔樣結(jié)構(gòu)周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細(xì)胞。
2)同時(shí)將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中向成脂肪組織細(xì)胞誘導(dǎo)，在顯微鏡下觀察有脂質(zhì)小泡存在，判定已出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化趨勢(shì)后，將細(xì)胞消化處理制成1～2×107/ml的細(xì)胞懸液，輕輕逐滴滴加種植在有血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的支持材料的另一面，將細(xì)胞材料復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％CO2，飽和濕度下孵育1～2小時(shí)，使細(xì)胞粘附到材料上面，繼續(xù)孵育1～2小時(shí)，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。
3)繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)后換成成脂誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)3～5天，隨后換成含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5天后即得到工程化的脂肪組織塊。
實(shí)施例7NOD/SCID小鼠皮下填充植入實(shí)驗(yàn)1)2％戊巴比妥鈉30～50mg/kg腹腔注射麻醉NOD/SCID小鼠，在其腹部皮膚切開一小口，直徑1.0cm，以供工程化組織塊移植。
2)取構(gòu)建好的工程化組織塊，填充植入皮下，用線縫合。5周后取標(biāo)本，冰凍切片，行免疫組織化學(xué)染色(抗人核蛋白抗體，CD34，CD31，vWF)。
3)結(jié)果顯示取材時(shí)，可見(jiàn)小鼠腹部皮膚愈合良好，手術(shù)部位形成一隆丘，表面光滑，有一定的彈性(圖5a)，手術(shù)切開后可見(jiàn)有白色脂肪層形成(圖5b)。免疫組化結(jié)果顯示，5周后工程化組織塊內(nèi)有大量人細(xì)胞增殖(圖5c)，其中很多細(xì)胞CD34、CD31、vWF免疫熒光檢測(cè)為陽(yáng)性(圖5d、5e、5f)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，其特征在于由向脂肪細(xì)胞和向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞群與生物材料共同構(gòu)建而成；所述的向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是從脂肪組織分離的干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化而獲得；所述的生物材料是指生物降解型高分子材料包括膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，包括有脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的分離、干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化、與生物材料的共培養(yǎng)，其特征在于，本發(fā)明方法包括以下步驟(1)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的分離培養(yǎng)1)以磷酸緩沖液沖洗脂肪組織后，加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，除去損傷組織、血液和紅細(xì)胞；2)蛋白水解酶水解脂肪組織；3)平衡密度離心，分離脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群；4)磷酸緩沖液重懸分離的細(xì)胞，加入高張鹽溶液保溫及加入紅細(xì)胞裂解液，破壞并除去殘留的紅細(xì)胞；5)離心去除上清液，加入磷酸緩沖液重懸及離心洗滌，得到的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，用含5％～15％血清的DMEM或者D/F12細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以增加干細(xì)胞的數(shù)量；(2)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞向成血管細(xì)胞誘導(dǎo)分化1)取擴(kuò)增的第3～8代脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞以培養(yǎng)基調(diào)整成濃度為1～2×105/ml的細(xì)胞懸液，輕輕滴加在可降解的、一定體積的生物活性支架材料上；2)將細(xì)胞材料復(fù)合體放入負(fù)壓容器中，負(fù)壓處理，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面；3)加入含5～15％血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)；4)將細(xì)胞材料復(fù)合體放入成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中，共同培養(yǎng)12～21天；(3)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞向成脂肪組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化1)在將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞向成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的同時(shí)，將第3～8代大規(guī)模生產(chǎn)的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中，以成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；2)細(xì)胞在顯微鏡下觀察有脂質(zhì)小泡存在，經(jīng)判定向成熟脂肪細(xì)胞分化的趨勢(shì)后，將細(xì)胞消化處理，以普通培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，備用；(4)含有誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的工程化脂肪組織的構(gòu)建1)在脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞向成血管誘導(dǎo)分化12～21天后，將已向脂肪細(xì)胞分化的細(xì)胞懸液滴加種植在有血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的支持材料的另一面，然后將細(xì)胞材料復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％CO2，飽和濕度下孵育1～2小時(shí)，使細(xì)胞粘附到材料上面；2)向細(xì)胞材料復(fù)合體中加入含5～15％血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)；3)再將細(xì)胞材料復(fù)合體中加入成脂誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)3～5天；4)最后將細(xì)胞材料復(fù)合體換成含5～10％血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，即制備成含有誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的工程化脂肪組織，保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，其特征在于用于誘導(dǎo)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞向成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的培養(yǎng)基可以是含2～8％胎牛血清的低糖DMEM或者D/F12，其中加入2～10ng/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、2～10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素、地塞米松、牛血清白蛋白(BSA)、一些氨基酸(如鳥氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺)以及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，其特征在于用于誘導(dǎo)脂肪來(lái)源干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化的培養(yǎng)基可以是含有糖皮質(zhì)激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類似物)以及其他一些物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，其特征在于用于脂肪來(lái)源干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化的一種誘導(dǎo)方案可以是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mMIBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化脂肪組織的構(gòu)建方法，其特征在于用于脂肪來(lái)源干細(xì)胞向成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的一種誘導(dǎo)方案可以是DMEM，2％FBS，10ng/ml VEGF，2ng/ml bFGF，1×ITS，0.61g/L尼克酰胺，0.1μM地塞米松，2g/L BSA，0.1g/L鳥氨酸，0.03g/L脯氨酸，0.73g/L谷氨酰胺，1g/L葡萄糖，2g/L半乳糖及10-6微量元素包括氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳。
7.組織工程化脂肪組織的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的組織工程化脂肪組織可用于制備彌補(bǔ)軟組織缺陷的填充塑型物。
8.組織工程化脂肪組織的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的組織工程化脂肪組織可用于制備創(chuàng)傷組織修復(fù)的填充塑型物。
9.組織工程化脂肪組織的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的組織工程化脂肪組織可用于美容，即構(gòu)建的組織工程化脂肪組織可作為塑型物填充于正常組織，達(dá)到美容的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及將來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞在體外分別向脂肪和向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞與生物材料相結(jié)合，共同構(gòu)建組織工程脂肪組織的方法，利用此方法可制備用于彌補(bǔ)軟組織缺陷、創(chuàng)傷組織修復(fù)以及正常組織的填充塑型物。應(yīng)用本方法構(gòu)建的脂肪組織，不僅可以用于一些組織的填充、修復(fù)還可以用于乳腺的重建、增大、矯正和美容。例如，頭面部與頸部腫瘤的切除、各種復(fù)合型創(chuàng)傷、先天性畸形的填充修復(fù)以及臉頰、嘴唇等部位的美容和皺紋去除。因此，市場(chǎng)價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1912109SQ20051008984
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者裴雪濤, 管利東, 王韞芳, 閆舫, 李紹青, 白慈賢, 岳慧敏, 南雪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所