本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種軟骨細(xì)胞的分離方法，尤其是一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法。
背景技術(shù)：
：軟骨由軟骨組織及其周?chē)能浌悄?gòu)成，軟骨組織是由膠原組織、少許細(xì)胞、以及60-80％的水份等成份所構(gòu)成。根據(jù)軟骨組織內(nèi)所含纖維成分的不同，可將軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨三種，其中以透明軟骨的分布較廣，結(jié)構(gòu)也較典型。每根骨的末端，都有一層軟骨組織包裹著。這些軟骨組織可使骨骼之間避免摩擦及沖擊。成人的軟骨組織中并沒(méi)有血管或神經(jīng)，因此軟骨組織受傷后自行修補(bǔ)的能力有限。軟骨組織工程學(xué)是工程學(xué)與生物醫(yī)學(xué)尤其是細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合的邊緣科學(xué)，它涉及細(xì)胞、支架材料和包括多種生長(zhǎng)因子在內(nèi)的發(fā)育環(huán)境3種基本要素。1988年Vacanti等將聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)作為支架，復(fù)合軟骨細(xì)胞后植入裸鼠皮下進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)，28天后發(fā)現(xiàn)有軟骨樣組織出現(xiàn)。1997年Cao等以一個(gè)3歲兒童耳廓作模型，用涂有PLA的PGA無(wú)紡網(wǎng)制成人耳形狀的支架，接種軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)1周后植入裸鼠皮下，12周后取出的標(biāo)本呈人耳狀軟骨，組織形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)為軟骨組織。這一實(shí)驗(yàn)的成功，標(biāo)志著預(yù)制人工軟骨的組織工程技術(shù)正在走向成熟。盡管目前軟骨組織工程的研究仍處在體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，距離有效的臨床應(yīng)用尚有艱巨的道路要走，但其發(fā)展速度和臨床應(yīng)用前景已受到廣泛關(guān)注。軟骨組織工程是將軟骨種子細(xì)胞種植于可生物降解、組織相容性好的生物材料形成復(fù)合物，然后再把該復(fù)合物植入軟骨缺損處，生物材料自行降解的過(guò)程中，種植的細(xì)胞形成新的軟骨來(lái)填充缺損。在軟骨組織工程研究中對(duì)軟骨種子細(xì)胞的數(shù)量要求巨大、生物學(xué)功能活性要求高，軟骨種子細(xì)胞的來(lái)源仍是未很好解決的問(wèn)題。雖然體外傳代培養(yǎng)可以擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，但軟骨細(xì)胞增殖能力有限，擴(kuò)增達(dá)一定量后細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)制衰老和產(chǎn)生去分化及生物學(xué)功能衰退。因此，以有限的供體活組織收獲盡可能多而功能活性高的原代軟骨細(xì)胞，以降低體外擴(kuò)增倍數(shù)，無(wú)論是在軟骨組織工程的研究中還是在臨床應(yīng)用中，都顯得非常重要。而目前常用的原代軟骨細(xì)胞分離方法收獲效率低，造成了供體活組織的浪費(fèi)。且軟骨細(xì)胞得率低，活力較差，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)就仍然很難滿(mǎn)足自體軟骨細(xì)胞或組織移植的要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法，自體軟骨組織預(yù)處理后，剪碎，先用胰蛋白酶-EDTA處理，然后用Ⅱ型膠原酶溶液消化，待大部分細(xì)胞游離時(shí)，細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清，收集細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸后培養(yǎng)3天，收集貼壁細(xì)胞即得原代軟骨細(xì)胞。其中，所述預(yù)處理為用含有雙抗的PBS溶液進(jìn)行清洗，以清除自體軟骨組織表面的血污及附著的其他組織。所述預(yù)處理優(yōu)選在無(wú)菌條件下進(jìn)行。按照本發(fā)明，所述含有雙抗的PBS溶液中所述雙抗為青霉素和鏈霉素的混合物。其中所述青霉素終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml。預(yù)處理后的自體軟骨組織需要先剪碎。優(yōu)選剪碎為剪成1mm3的大小。本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法，先用胰蛋白酶-EDTA溶液處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述胰蛋白酶-EDTA溶液為含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液。優(yōu)選的，按g/ml計(jì)，所述胰蛋白酶的終濃度為0.25％，所述EDTA的終濃度為0.02％。本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法中所述胰蛋白酶-EDTA溶液處理時(shí)間優(yōu)選為5～10min。在胰蛋白酶-EDTA溶液處理后還包括用PBS溶液清洗軟骨組織的步驟。優(yōu)選PBS溶液清洗軟骨組織3-5次。進(jìn)一步，本發(fā)明所述原代分離方法在胰蛋白酶-EDTA溶液處理后采用Ⅱ型膠原酶溶液消化。優(yōu)選的，所述Ⅱ型膠原酶的終濃度為0.1v/v％～0.2v/v％。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述Ⅱ型膠原酶消化優(yōu)選為4℃消化過(guò)夜。在一些實(shí)施例中，消化時(shí)間為12小時(shí)左右。優(yōu)選的，所述細(xì)胞篩網(wǎng)為200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)。優(yōu)選的，所述離心為1500rpm離心2次，每次5min。本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法在離心后收集細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。其中，重懸后細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml。優(yōu)選的，所述DMEM高糖完全培養(yǎng)基為含10v/v％的胎牛血清、1v/v％的雙抗和10ng/ml的bFGF溶液的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明采用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，鑒定分離的原代軟骨細(xì)胞。結(jié)果顯示分離的細(xì)胞呈藍(lán)紫色，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)兴{(lán)紫色異染顆粒。表明分離的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法。本發(fā)明所述原代分離方法為自體軟骨組織預(yù)處理后，剪碎，先用胰蛋白酶-EDTA溶液處理，然后用Ⅱ型膠原酶溶液消化，待大部分細(xì)胞游離時(shí)，細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清，收集細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸后培養(yǎng)3天，收集貼壁細(xì)胞即得原代軟骨細(xì)胞。本發(fā)明所述原代分離方法可以提高軟骨細(xì)胞的得率，同時(shí)保證軟骨細(xì)胞活力較好，分離獲得的原代軟骨細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后可以滿(mǎn)足臨床上自體軟骨細(xì)胞或組織移植的要求。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示接種48h后的細(xì)胞形態(tài)；圖2示達(dá)到80％融合后細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如無(wú)特殊說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)獲得。實(shí)施例1取3g膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用含有雙抗的PBS溶液進(jìn)行清洗后，剪碎成1mm3的大小后用0.25％的胰蛋白酶溶液-0.02％的EDTA溶液重懸軟骨組織5分鐘，吸出胰蛋白酶溶液后采用0.1％～0.2％的Ⅱ型膠原酶在4℃條件下消化過(guò)夜(12小時(shí)左右)，待大部分細(xì)胞游離時(shí)，經(jīng)200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾；1500rpm離心2次，棄上清，收集軟骨細(xì)胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以2×105/ml的密度接種于新的T25培養(yǎng)瓶中。3天后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞。對(duì)比例1取3g膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用含有雙抗的PBS溶液進(jìn)行清洗后，剪碎成1mm3的大小后采用0.1％的Ⅰ型膠原酶消化4～6小時(shí)，待大部分細(xì)胞游離時(shí)，經(jīng)200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾；1500rpm離心2次，棄上清，收集軟骨細(xì)胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞的總量為以2×105/ml的密度接種于新的T25培養(yǎng)瓶中。3天后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞。實(shí)施例2分別統(tǒng)計(jì)實(shí)施例1和對(duì)比例1的方法分離后的軟骨細(xì)胞得率和活力，結(jié)果見(jiàn)表1。表1兩種方法進(jìn)行分離后軟骨細(xì)胞的得率和活力對(duì)比例1實(shí)施例1細(xì)胞得率(個(gè))2.2×1066.46×106細(xì)胞活力89％96％結(jié)果顯示，實(shí)施例1所述方法分離后的軟骨細(xì)胞得率和活力均高于對(duì)比例1。實(shí)施例3分別培養(yǎng)實(shí)施例1和對(duì)比例1的方法分離后的細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80％～90％融合時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用0.25％的胰蛋白酶消化1～2分鐘1000rpm離心5分鐘后加入新的培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，鑒定軟骨細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)圖2。圖1結(jié)果顯示實(shí)施例1和對(duì)比例1分離的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48小時(shí)后的大部分細(xì)胞形態(tài)均為三角形、多角形或鋪路石狀，實(shí)施例1分離的細(xì)胞比對(duì)比例1分離的細(xì)胞得率高。圖2結(jié)果顯示實(shí)施例1和對(duì)比例1分離的細(xì)胞均呈藍(lán)紫色，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)兴{(lán)紫色異染顆粒，但實(shí)施例1分離的細(xì)胞比對(duì)比例1分離的細(xì)胞得率高。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3