專利名稱：一種抗腫瘤的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物組合物，還涉及該藥物組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
一些活細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中聚集已經(jīng)約有150的歷史了，而有目的的將這些細(xì)菌的這一特性運(yùn)用在腫瘤治療的研究中是從上世紀(jì)中期開始的。在這方面，研究最為深入的是三種細(xì)菌沙門氏菌、厭氧芽孢桿菌和雙歧桿菌。其中，厭氧芽孢桿菌和雙歧桿菌主要在腫瘤壞死部位繁殖，并且其親腫瘤性依賴于腫瘤體積的大小[Dang LH，Beltegowda C，Huso DL，et al.Combinationbacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.PNAS 2001；9815155-60]。沙門氏菌是兼性厭氧細(xì)菌，既可以生長在腫瘤壞死部位，也可以在活的腫瘤組織處生長，而且其親腫瘤性不依賴于腫瘤的大小。(Ming zhao，meng Yang，Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs ofGFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS.2005；102755-60.)。在對嚙齒動物的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，厭氧芽孢桿菌和雙歧桿菌在腫瘤組織中聚集并不能導(dǎo)致腫瘤的消退。經(jīng)過減毒的沙門氏菌具有一定的抗腫瘤作用。(Low KB，Ittensohn M，Let，et al.VNP20009，a genetically modified Salmonella typhimurium for the treatment of solid tumors.Proc Am Assoc Cancer Res 1999；40.)基于這些細(xì)菌具有的親腫瘤性，越來越多的研究傾向于將它們作為載體攜帶抗腫瘤基因發(fā)揮抑瘤作用，所傳遞的抗腫瘤基因包括前藥轉(zhuǎn)化酶基因、細(xì)胞因子、血管生成抑制劑等，但這些細(xì)菌本身的毒性，限制了其在抗腫瘤方面作用的發(fā)揮。
目前關(guān)于細(xì)菌在實(shí)體瘤聚集的機(jī)制仍然不清楚。最初認(rèn)為是由于實(shí)體瘤組織產(chǎn)生的厭氧環(huán)境有利于厭氧細(xì)菌的生長而導(dǎo)致細(xì)菌在腫瘤生長。1997年發(fā)現(xiàn)沙門氏菌也具有親腫瘤性，后來實(shí)驗(yàn)證實(shí)沙門氏菌的生長遍布整個腫瘤組織(Ming zhao，meng Yang，Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with aminoacid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS.2005；102755-60)，否定了上述最初的假設(shè)?，F(xiàn)在較為認(rèn)可的一種說法是腫瘤組織為細(xì)菌生長提供了免疫抑制的環(huán)境，從而有利于細(xì)菌生長，但依然未得到證實(shí)。
有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠在腫瘤部位聚集(Yong A Yu，Shahrokh Shabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visu lization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.NatureBiotechnology 2004；22313-21)，但并未公開有關(guān)大腸桿菌的詳細(xì)數(shù)據(jù)。細(xì)菌富集重金屬離子早有報道，現(xiàn)在可以通過基因工程的方法提高細(xì)菌富集重金屬離子的能力(Pavel Kotrba，Lucie Doleckova，Victor de Lorenzo，et al.Enhancedbioaccumulation of heavy metal ions by bacterial cells due to surface display of short metalbinding peptides.Applied and Environmental Microbiology 1999；651092-1098；)，但主要是用于環(huán)境污染的治理，尚無利用細(xì)菌這一特性用于腫瘤的治療。以前的報道主要是關(guān)于細(xì)菌富集重金屬離子，關(guān)于細(xì)菌是否可以吸附重金屬螯合物尚無報道。順鉑是金屬螯合物，是目前一線抗腫瘤藥，臨床證明具有良好的抗實(shí)體瘤作用。但順鉑對人體有較大的毒性，在大劑量應(yīng)用時病人會出現(xiàn)各種副反應(yīng)，如消化道反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性和過敏反應(yīng)等，在一定程度限制其抗腫瘤作用的發(fā)揮。如果將順鉑靜脈滴注，藥物會全身分布，并且很快代謝，無法特異性到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮抑瘤作用，無法在腫瘤部位聚集較高的濃度，抗腫瘤作用無特異性。目前尚無關(guān)于利用大腸桿菌的腫瘤靶向性及富集重金屬的能力發(fā)揮抗腫瘤作用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前順鉑抗腫瘤中對人體毒性大，和利用細(xì)菌的親腫瘤特性進(jìn)行抗腫瘤時細(xì)菌毒性高等問題，本發(fā)明公開了一種抗腫瘤的藥物組合物，該組合物中含有富集有抗腫瘤物質(zhì)的活體大腸桿菌。本發(fā)明的藥物組合物中的大腸桿菌包括大腸埃希菌屬的各個種或在此基礎(chǔ)上經(jīng)過遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌，例如DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803等等，本發(fā)明的藥物組合物中的抗腫瘤物質(zhì)為順鉑，也可以為其它能被大腸桿菌富集的抗腫瘤物質(zhì)。
本發(fā)明所述腫瘤可以為各種實(shí)體瘤，例如鼠黑色素腫瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080、鼠膀胱肉瘤細(xì)胞MB-49及鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6等實(shí)體瘤等。
本發(fā)明還公開了上述藥物組合物的制備方法，其中富集有抗癌物質(zhì)的大腸桿菌的制備方法，包括如下步驟(1)將大腸桿菌在帶有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0.6～0.8；(2)在培養(yǎng)基中加入一定量的順鉑，使溶液順鉑含量為0.1mg/ml；(3)37℃振蕩培養(yǎng)1小時后取出，用生理鹽水洗滌，離心并重懸。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用活體成像技術(shù)，意外地發(fā)現(xiàn)大腸桿菌不但具有腫瘤靶向性，而且具有富集抗腫瘤化療藥物順鉑的能力，并且其富集順鉑的劑量已經(jīng)達(dá)到了治療劑量。利用大腸桿菌的這些特性，使大腸桿菌富集一定量的順鉑，并且特異性聚集到腫瘤部位，發(fā)揮腫瘤診斷或治療的作用。本發(fā)明的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途中腫瘤診斷是通過富集并耐受順鉑的大腸桿菌聚集于腫瘤組織實(shí)現(xiàn)的，腫瘤治療是通過富集順鉑的大腸桿菌的腫瘤靶向能力聚集于腫瘤組織，發(fā)揮順鉑的抗腫瘤作用實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明公開的藥物組合物在腫瘤診斷或治療中的作用是通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的。
首先檢測大腸桿菌的腫瘤靶向性。
將帶有熒光標(biāo)記(LucABCDE)的質(zhì)粒pXen-1分別轉(zhuǎn)入不同種的大腸桿菌中，然后將轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，運(yùn)用活體成像體外觀察細(xì)菌在體內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在腫瘤組織持續(xù)存在，最長時間觀察一月，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌仍然在腫瘤組織大量聚集，而正常組織未觀察到細(xì)菌聚集。檢測的腫瘤類型可以為各種實(shí)體瘤，本發(fā)明選擇了B16黑色素瘤、鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌等，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌均可以在這些腫瘤組織中聚集。由此可以認(rèn)為細(xì)菌對多種腫瘤具有靶向性。檢測的大腸桿菌類型可以多種，本發(fā)明選擇其中三種DH5α、BL21和HB101，由此也可認(rèn)為多種大腸桿菌工程菌和經(jīng)過減毒處理的菌株均具有腫瘤靶向性。
將腫瘤細(xì)胞尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，使裸鼠產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤。將大腸桿菌尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，一段時間后，運(yùn)用活體成像儀器對小鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以聚集在小鼠的轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)，由此證實(shí)，細(xì)菌不僅對原發(fā)腫瘤具有靶向性，而且對轉(zhuǎn)移腫瘤也具有靶向性。
然后檢測不富集順鉑的單純的大腸桿菌對于腫瘤的生長抑制作用。將大腸桿菌尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察一段時間后發(fā)現(xiàn)連續(xù)多次注射大腸桿菌的一組小鼠腫瘤得到明顯抑制，只注射一次大腸桿菌組對腫瘤的抑制效果不明顯。關(guān)于連續(xù)多次注射細(xì)菌對腫瘤有一定的抑制作用，申請人認(rèn)為主要是由于連續(xù)注射的細(xì)菌在腫瘤部位與腫瘤組織爭奪營養(yǎng)造成，是否還具有促細(xì)胞凋亡作用目前還不清楚。
本發(fā)明通過綜合大腸桿菌的腫瘤靶向性，抗腫瘤特性和順鉑的抗腫瘤作用，利用ICP-MS檢測了細(xì)菌對順鉑的富集能力以及富集了順鉑的細(xì)菌抗腫瘤作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和順鉑共孵育一段時間后會富集一定量的順鉑，當(dāng)優(yōu)化條件后，細(xì)菌會富集達(dá)到治療劑量的順鉑。
將富集有順鉑的大腸桿菌尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，一段時間后，將小鼠處死，取出正常臟器和腫瘤，利用活體成像裝置發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過順鉑處理后細(xì)菌仍在腫瘤聚集，在正常組織沒有細(xì)菌聚集。利用ICP-MS檢測腫瘤組織中的順鉑含量，發(fā)現(xiàn)在腫瘤局部有高濃度的順鉑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過順鉑處理后不同種的大腸桿菌均可以在不同種的腫瘤組織中聚集。
將富集有順鉑的大腸桿菌尾靜脈注入預(yù)先造成的轉(zhuǎn)移瘤小鼠體內(nèi)，一段時間后，運(yùn)用活體成像儀器觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過順鉑處理后的大腸桿菌仍然可以定位在轉(zhuǎn)移瘤組織。
基于上述實(shí)驗(yàn)，評價富集一定量順鉑的大腸桿菌對實(shí)體瘤的生長抑制作用。將大腸桿菌和順鉑共孵育一段時間后，或?qū)⒋竽c桿菌在一定量的順鉑中振蕩培養(yǎng)，將一定量的大腸桿菌每隔一段時間由尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，繪制一段時間的腫瘤生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射富集有順鉑的大腸桿菌能夠明顯抑制腫瘤的生長，比注射未經(jīng)順鉑處理過的大腸桿菌有更明顯的抑制腫瘤生長作用。本發(fā)明還通過試驗(yàn)對比了單用小劑量順鉑對腫瘤的治療效果，發(fā)現(xiàn)注射用順鉑處理過的細(xì)菌較直接注射小劑量的順鉑，對腫瘤生長有更加明顯的抑制作用，并且注射用順鉑處理過的細(xì)菌的小鼠腫瘤中順鉑含量明顯高于直接注射小劑量順鉑的小鼠。說明是由于細(xì)菌的親腫瘤性，導(dǎo)致在小鼠腫瘤部位聚集高濃度的順鉑聚集。
以上各實(shí)驗(yàn)可以采用多種大腸桿菌，本發(fā)明選擇了其中三種DH5α、BL21和HB101，檢驗(yàn)的腫瘤可以包括各種實(shí)體瘤，本發(fā)明選擇了其中三種腫瘤B16、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和前列腺癌，均取得了一致的結(jié)果。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤體積還很小時大腸桿菌細(xì)菌就可以在其中聚集，由此可以利用大腸桿菌對腫瘤進(jìn)行早期診斷。方法可以采用將熒光質(zhì)粒或者綠色或紅色熒光蛋白編碼基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，利用活體成像裝置體外觀察原發(fā)或轉(zhuǎn)移的微小病灶。
本發(fā)明的富集順鉑的大腸桿菌加上藥學(xué)上可接受的輔料，以保持大腸桿菌的活性及穩(wěn)定性，制備用于腫瘤診斷或治療的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可以制成適于本發(fā)明所述大腸桿菌發(fā)揮抗腫瘤作用的各種劑型，如片劑、散劑、膠囊劑、栓劑、注射劑、混懸劑等，優(yōu)選注射劑。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑為口服、肌肉注射，靜脈給藥等多種，優(yōu)選靜脈給藥，給藥劑量為每公斤體重所需的藥物組合物中含大腸桿菌5×108～1×1011cfu，優(yōu)選5×109cfu。
大腸桿菌作為抗腫瘤載體富集順鉑用來診斷或治療腫瘤具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，經(jīng)過基因工程改造過的大腸桿菌十分安全，不象其他細(xì)菌如沙門氏菌對人可以致病，必須經(jīng)過減毒處理后才可使用，而且還有回復(fù)為野生型的潛在危險。其次，大腸桿菌容易購買，操作方便。順鉑作為一線的抗腫瘤藥，在各醫(yī)院均可以買到，價格適中。第三，大腸桿菌富集順鉑治療腫瘤比單用相同劑量的順鉑治療顯示出更高的療效，而且對轉(zhuǎn)移腫瘤也有一定的抑制作用。并且大腸桿菌富集順鉑治療腫瘤既可以使順鉑在腫瘤組織聚集，從而較低對正常組織的損傷，也可以降低順鉑的使用劑量，降低順鉑的副作用。富集有順鉑的大腸桿菌在腫瘤的生物治療中顯示出巨大的潛力，為腫瘤的治療提供了一種十分有希望的治療策略。


圖1為利用活體成像儀器觀測細(xì)菌在腫瘤中定位。B16腫瘤接種在小鼠右后腿皮下，圖中發(fā)光處為腫瘤，注射劑量為1×109cfu/100μl，注射細(xì)菌為轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α。其中圖A，B，C分別為注射細(xì)菌后第2天、第4天、第8天。其他細(xì)菌在另外兩種腫瘤中聚集和圖1類似，未展示。
圖2為細(xì)菌在很小的腫瘤中聚集，注射細(xì)菌為轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌BL21，腫瘤為鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤，接種在小鼠右后腿皮下，解剖取出腫瘤發(fā)現(xiàn)腫瘤體積為100mm3。
圖3為尾靜脈注射1×107cfu/100μl轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，腫瘤為B16，接種在小鼠右后腿皮下。兩天后將小鼠處死，取出腫瘤，用活體成像儀器觀察到細(xì)菌在腫瘤中聚集，圖示為將腫瘤切開后顯示腫瘤內(nèi)發(fā)光情況。
圖4為連續(xù)注射細(xì)菌對小鼠腫瘤的生長影響。注射細(xì)菌為轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，注射劑量為1×108cfu/100μl，每次注射間隔7天。一次注射細(xì)菌組注射劑量和連續(xù)注射組相同。生理鹽水注射劑量為100μl。
圖5是大腸桿菌DH5α在不同的順鉑濃度和不同孵育時間對順鉑的富集量。設(shè)三個濃度，分別為0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml。孵育時間分別為1小時、12小時，長期培養(yǎng)是指將細(xì)菌轉(zhuǎn)接入含有一定濃度順鉑的LB培養(yǎng)基中，放入搖床，37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘，直至細(xì)菌OD值達(dá)到1.5左右。
圖6為小鼠雙肺的轉(zhuǎn)移腫瘤。腫瘤轉(zhuǎn)移模型的建立見材料和方法。待小鼠轉(zhuǎn)移模型形成后，尾靜脈注射1×108cfu/100ul轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，4天后，將小鼠處死，取出轉(zhuǎn)移腫瘤，在活體呈像下觀察。A為小鼠雙肺轉(zhuǎn)移腫瘤用數(shù)碼相機(jī)拍攝的照片，肺組織上的黑色斑點(diǎn)即為腫瘤轉(zhuǎn)移灶。B為小鼠雙肺轉(zhuǎn)移腫瘤的熒光照片，可見細(xì)菌在小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤大量聚集。
圖7為連續(xù)注射富集了順鉑的大腸桿菌DH5α對B16腫瘤的生長抑制作用。注射劑量為2×108cfu/200μl。另一組連續(xù)注射的細(xì)菌為未吸附順鉑的大腸桿菌DH5α，注射間隔為7天，觀察時間間隔為3天，連續(xù)觀察了30天。
圖8為連續(xù)注射富集了順鉑的大腸桿菌DH5α和注射小劑量順鉑10μg/天對小鼠腫瘤的抑制作用。大腸桿菌注射量為1×108cfu/100μl，順鉑每天尾靜脈注射10μg。
圖9為實(shí)驗(yàn)組和對照組腫瘤中的順鉑含量，每組腫瘤數(shù)5個，實(shí)驗(yàn)組和對照組各取5只小鼠。第一組小鼠連續(xù)注射富集了順鉑的細(xì)菌DH5α，第二組小鼠連續(xù)注射小劑量的順鉑100μg/天，第三組小鼠為對照組，注射100μl生理鹽水。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 受體動物和腫瘤模型的建立1、材料和方法1.1細(xì)菌、細(xì)胞及其培養(yǎng)條件大腸桿菌DH5α、BL21和HB101均穩(wěn)定整合有熒光質(zhì)粒pXen-1，均購買自Xenogen公司。質(zhì)粒pXen-1帶有氨芐抗性，細(xì)菌在加有氨芐的培養(yǎng)基中生長，不需要添加額外的物質(zhì)。在觀察單純大腸桿菌對腫瘤的生長抑制實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌在加有氨芐的培養(yǎng)基中，放入37℃，220轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)6～8小時，直至OD600達(dá)到0.6～0.8，大腸桿菌生長達(dá)到中對數(shù)期。收菌，用無菌生理鹽水洗3次，離心沉淀，最后用一定體積的生理鹽水重懸。所用順鉑均購自中國人民解放軍307醫(yī)院，所用細(xì)胞為B16黑色素瘤細(xì)胞、鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞，所有細(xì)胞均穩(wěn)定整合有熒光質(zhì)粒pXen-1，購自Xenogen公司。B16黑色素瘤細(xì)胞在添加有12％的胎牛血清、1％丙酮酸鈉、1％MEM維生素、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰氨、1％雙抗的DMEM培養(yǎng)基中生長；鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在添加有10％的胎牛血清、100單位/ml青霉素G、250ng/ml兩性霉素、100單位/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中生長。
1.2統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)中三組腫瘤體積之間的差異采用單因素K水平的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組中腫瘤體積均以X±S表示，腫瘤組織中的順鉑含量的差異采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
1.3受體動物和腫瘤模型的建立實(shí)驗(yàn)所用動物為6～8周齡雄性Balb/c小鼠，所有小鼠均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。為了使小鼠產(chǎn)生B16、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞皮下腫瘤，分別收三種腫瘤細(xì)胞，用無菌生理鹽水洗三遍，計(jì)數(shù)后，將5×106/100μl細(xì)胞分別接種至小鼠右后腿皮下。腫瘤的生長狀況用腫瘤生長曲線表示，腫瘤體積用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，腫瘤體積計(jì)算公式為V＝L×W2/2。L代表腫瘤的長，M代表腫瘤的寬。在腫瘤接種后7～12天(前列腺癌生長需要約1個月)，當(dāng)可以觸摸到時，就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了建立轉(zhuǎn)移腫瘤模型，將5×105cfu/100μl的B16或5×106cfu/100μl MCF-7細(xì)胞尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)。7～14天后，兩肺的轉(zhuǎn)移瘤模型建立。
2.結(jié)果轉(zhuǎn)移瘤模型結(jié)果見附圖6。
實(shí)施例二 用ICP-MS檢測大腸桿菌富集順鉑作用1.材料同實(shí)施例一。
2.方法結(jié)果將大腸桿菌DH5α在帶有氨芐的5ml LB培養(yǎng)基中搖至0.6～0.8，分別加入0.5mg、0.25mg、0.05mg的順鉑，孵育1h、12h、48h長期培養(yǎng)。將經(jīng)過順鉑不同處理的大腸桿菌用1×PBS洗五遍，離心，放入60℃的烘箱里24小時，待徹底烘干后，稱重，送ICP-MS檢測鉑的含量。長期培養(yǎng)是指將細(xì)菌轉(zhuǎn)接入含有一定濃度順鉑的LB培養(yǎng)基中，放入搖床，37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，直至細(xì)菌OD達(dá)到1.5左右。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)大腸桿菌富集的鉑量隨著順鉑的濃度增加而增加，孵育24小時大腸桿菌吸附了最大量的順鉑。但是濃度太大會使細(xì)菌生長停滯，并且使細(xì)菌大量死亡。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，將順鉑加入細(xì)菌培養(yǎng)基使其終濃度為0.1mg/ml，孵育1小時，在此狀況下，細(xì)菌吸附較大量的順鉑，又不會導(dǎo)致細(xì)菌大量死亡。見附圖5。
實(shí)施例三 單純細(xì)菌對腫瘤生長抑制效果觀察1.材料同實(shí)施例一。
2.方法結(jié)果設(shè)立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周齡，均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。將轉(zhuǎn)化有pXen-1的大腸桿菌DH5α在帶有氨芐的培養(yǎng)基中搖至0.6～0.8，中對數(shù)生長期收細(xì)菌，用無菌生理鹽水清洗3次，離心，用一定體積的生理鹽水重懸，將1×108cfu/100μl大腸桿菌尾靜脈注入實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠體內(nèi)，小鼠接種腫瘤為B16黑色素瘤，注射時間為接種腫瘤后7天。對照組尾靜脈注射100μl無菌生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組1每只注射一次大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)組2每周注射一次大腸桿菌，連續(xù)注射一個月，繪制腫瘤的生長曲線。連續(xù)觀察30天，發(fā)現(xiàn)多次注射大腸桿菌對腫瘤的生長有很強(qiáng)的抑制作用，一次注射大腸桿菌對腫瘤無抑制作用。申請人認(rèn)為單純細(xì)菌對腫瘤的抑制作用主要是由于細(xì)菌在腫瘤部位與腫瘤爭奪營養(yǎng)導(dǎo)致，是否還有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用尚不清楚。見附圖4。
實(shí)施例四 富集順鉑的大腸桿菌對腫瘤生長抑制效果觀察1.材料同實(shí)施例一。
2.方法結(jié)果設(shè)立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對照組三組。實(shí)驗(yàn)組和對照組各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周齡，均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。將大腸桿菌DH5α在帶有氨芐的LB培養(yǎng)基中搖至0.6～0.8，加入一定量的順鉑，使順鉑溶液含量為0.1mg/ml。放入搖床，37℃，220轉(zhuǎn)/分，1小時后取出，用生理鹽水洗三遍，離心，用一定體積的生理鹽水重懸，將2×108cfu/100μl細(xì)菌尾靜脈注入實(shí)驗(yàn)組1的荷瘤小鼠體內(nèi)，每周注射一次，連續(xù)注射一個月。實(shí)驗(yàn)組2注射2×108cfu/100μl沒有富集順鉑的大腸桿菌DH5α每周注射一次，連續(xù)注射一個月。對照組注射100μl無菌生理鹽水。繪制腫瘤生長曲線。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與連續(xù)注射未經(jīng)順鉑處理過的大腸桿菌相比，注射富集了順鉑的大腸桿菌對腫瘤生長有更明顯的抑制作用。見附圖7。
實(shí)施例五 富集順鉑的大腸桿菌和小量順鉑對腫瘤的生長抑制作用比較1.材料同實(shí)施例一。
2.方法結(jié)果設(shè)立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周齡，均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。將大腸桿菌在帶有氨芐的LB培養(yǎng)基中搖至0.6～0.8，加入一定量的順鉑，使溶液順鉑含量為0.1mg/ml。放入搖床，37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘，1小時后取出，用生理鹽水洗三遍，離心，用一定體積的生理鹽水重懸，將1×108cfu/100μl大腸桿菌尾靜脈注入實(shí)驗(yàn)組1的荷瘤小鼠體內(nèi)，腫瘤為B16黑色素瘤，每周注射一次，連續(xù)注射一個月。實(shí)驗(yàn)組2注射小劑量順鉑(10μg/天)，每周注射一次，連續(xù)注射一個月。對照組注射100μl無菌生理鹽水。繪制腫瘤生長曲線。并分別將實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照組的腫瘤取出，送ICP-MS檢測鉑含量。
結(jié)果顯示，注射大腸桿菌組對腫瘤的生長有明顯抑制作用，而注射小量的順鉑組與對照組無顯著差異。由此也說明，細(xì)菌會富集高濃度的順鉑到腫瘤部位特異性發(fā)揮抗腫瘤作用。之后將三組小鼠全部處死，解剖后取出腫瘤組織及正常臟器，送ICP-MS檢測鉑的含量，發(fā)現(xiàn)注射細(xì)菌組小鼠腫瘤中鉑的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純注射順鉑組小鼠腫瘤中鉑的含量；注射大腸桿菌組小鼠腫瘤組織中的順鉑含量遠(yuǎn)高于正常組織，而注射順鉑組小鼠腫瘤組織中順鉑含量與正常組織中順鉑含量基本相同。由此也說明富集了順鉑的細(xì)菌會將順鉑特異性帶到腫瘤部位，在腫瘤局部形成高濃度的順鉑。見附圖8，附圖9。
實(shí)施例六 大腸桿菌腫瘤靶向性實(shí)驗(yàn)1.材料同實(shí)施例一2.方法結(jié)果
2.1大腸桿菌靶向原位腫瘤實(shí)驗(yàn)將帶有LucABCDE標(biāo)記的大腸桿菌DH5α 1×109cfu/100μl尾靜脈注入三只預(yù)先接種有B16黑色素瘤的小鼠體內(nèi)，第一只小鼠注射細(xì)菌后第二天在腫瘤部位出現(xiàn)熒光，另外兩只在注射細(xì)菌后第三天出現(xiàn)熒光。三只小鼠其他部位沒有熒光，熒光持續(xù)存在，一只小鼠在一個月后處死、解剖，仍發(fā)現(xiàn)腫瘤部位有熒光，正常組織無熒光。將1×108cfu/100μl和1×107cfu/100μl，轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的BL21大腸桿菌注入荷B16瘤小鼠體內(nèi)，分別在四天后和兩天后處死、解剖，發(fā)現(xiàn)在腫瘤部位均有較強(qiáng)熒光，正常組織均無熒光。注射三個濃度的大腸桿菌均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在腫瘤中聚集，而正常組織均無細(xì)菌聚集，由此說明，大腸桿菌對腫瘤組織有很強(qiáng)的腫瘤靶向性，而且，細(xì)菌的腫瘤靶向性不受腫瘤大小的限制，觀察到的細(xì)菌所能聚集的最小腫瘤體積是100mm2。除上面結(jié)果，本發(fā)明又對不同的大腸桿菌BL21和HB101，以及不同的腫瘤鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞兩種腫瘤，進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同的大腸桿菌可以在不同的腫瘤細(xì)胞聚集。見圖1，2，3。
2.2大腸桿菌靶向轉(zhuǎn)移腫瘤將1×108cfu/100μl轉(zhuǎn)化有pXen-1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α尾靜脈注入預(yù)先已造成的肺腫瘤轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)。4天后，活體成像觀察，發(fā)現(xiàn)肺腫瘤部位有熒光。將小鼠處死后解剖，將肺轉(zhuǎn)移腫瘤取出后活體成像，發(fā)現(xiàn)在肺腫瘤處有熒光，正常組織無熒光。說明細(xì)菌不僅在原發(fā)的腫瘤組織聚集，還可以在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織聚集。此外，分別檢測了另外兩種大腸桿菌BL21、HB101和兩種腫瘤鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同大腸桿菌對不同種的腫瘤組織均具有定位的能力。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于包含富集有順鉑的活體大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中大腸桿菌包括大腸埃希菌屬的各個種或在此基礎(chǔ)上經(jīng)過遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的藥物組合物，其中大腸桿菌為DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述腫瘤為各種實(shí)體瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述腫瘤為鼠黑色素腫瘤B16-F10、人肝癌BEL7405或SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080、鼠膀胱肉瘤細(xì)胞MB-49或鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6。
6.權(quán)利要求1所述藥物組合物的制備方法，其特征在于組合物中富集有順鉑的活體大腸桿菌的制備包括如下步驟(1)將大腸桿菌在帶有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)在培養(yǎng)基中加入一定量的順鉑；(3)培養(yǎng)一定時間后，洗滌并重懸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中富集有順鉑的活體大腸桿菌的制備包括如下步驟(1)將大腸桿菌在帶有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8；(2)在培養(yǎng)基中加入一定量的順鉑，使溶液順鉑含量為0.1mg/ml；(3)37℃振蕩培養(yǎng)1小時后取出，用生理鹽水洗滌，離心并重懸。
8.權(quán)利要求1所述的藥物組合物的劑型為注射劑，給藥途徑為靜脈給藥。
9.權(quán)利要求1所述的藥物組合物的給藥劑量為每公斤體重所需的藥物組合物中含大腸桿菌5×108～1×1011cfu。
10.權(quán)利要求1或9所述的藥物組合物的給藥劑量為每公斤體重所需的藥物組合物中含大腸桿菌5×109cfu。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤的藥物組合物及其制備方法。本發(fā)明的藥物組合物中含有富集有抗腫瘤物質(zhì)的活體大腸桿菌，其中的抗腫瘤物質(zhì)可以為化療藥物順鉑。本發(fā)明證明了大腸桿菌具有富集順鉑的能力，利用大腸桿菌的腫瘤靶向能力以及富集順鉑的能力，使大腸桿菌攜帶一定量的順鉑，到達(dá)腫瘤部位，特異性的發(fā)揮抗腫瘤作用，達(dá)到治療腫瘤的目的。本發(fā)明的藥物組合物，其中的大腸桿菌作為新的腫瘤靶向載體，具有安全、特異性強(qiáng)、副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，使順鉑能特異性地在腫瘤組織發(fā)揮作用，避免了其毒副作用，可以用來診斷或治療腫瘤，具有廣闊的市場和應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK1903223SQ200510087110
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者張學(xué)敏, 王晨輝, 張海英 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心