專利名稱：選育兼抗白粉病,條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種選育聚合多基因的兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于耕作制度、肥水條件與氣候條件的改變以及小麥品種抗源單一化等原因，一個麥區(qū)常遭受2種以上病蟲害的侵?jǐn)_。白粉病和條銹病已成為我國小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要病害。黃矮病由于傳播其病原(大麥黃矮病毒)的麥蚜嚴(yán)重發(fā)生，有從甘肅、山西、陜西等主發(fā)區(qū)向江淮和西南麥區(qū)蔓延擴(kuò)散的趨勢。因此，創(chuàng)造兼抗白粉、條銹和黃矮病小麥新種質(zhì)對于小麥的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
陳孝等曾選育了一個兼抗白粉、黃矮和三銹的小麥新種質(zhì)YW243(謝皓，陳孝，張增艷，辛志勇，林志珊，杜麗璞，馬有志，徐惠君.抗黃矮病小麥新品系YW243的選育和細(xì)胞分子生物學(xué)鑒定.作物學(xué)報，2000，26(6)687-691)。YW243是由Y90136與RW1685的雜交F2代材料花藥培養(yǎng)而得到的，其中Y90136的組合為PP9-1/陜7859//豐抗8號；RW1685的組合為3*豐抗13/Khapli，PP9-1組合為CSph×2/L1//CSN5BT5D/3/Zhong 7902/4/Shan7859。從系譜推斷，白粉病抗性由源自Khapli的抗白粉病基因Pm4a控制，黃矮病抗性由源于易位的中間偃麥草7X染色體上的抗黃矮病基因Bdv2控制(Zhang Z Y，Xu J S，Xu Q J，Larkin Philip，Xin Z Y.Development of novel PCR markers linked to the BYDV resistance gene Bdv2 usefulin wheat for marker-assisted selection.Theoretical and Applied Genetics，2004，109433-439)。謝皓等(謝皓，牛永春，陳孝，馬有志，吳立人，林志珊.小麥新品系YW243抗條銹性鑒定和遺傳分析.植物病理學(xué)報，2003，33(3)234-247)進(jìn)行基因推導(dǎo)和與已知基因系測交的結(jié)果表明，YW243對條銹病抗性與已知基因系抗病譜不同，可能為新的抗性基因或基因組合。它對條中31號小種的抗性表現(xiàn)為顯性單基因遺傳。劉朝輝等把YW243對條中31號小種的抗性基因(暫命名為YrX)定位在2BL上，篩選出與其連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm501等(劉朝輝，林志珊，陳孝，馬有志，徐世昌，張增艷，辛志勇，王輝.小麥新種質(zhì)YW243抗條銹病的染色體定位，麥類作物學(xué)報，2005，25(1)13-16)。
由于小麥白粉病菌(Blumeria gramini f.sp.tritici)和小麥條銹病菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)群體大，生理小種變異快、易造成原抗性品種喪失抗病性。若一個品種聚合了多個抗病基因，不僅可以識別多個不同的病原菌生理小種、擴(kuò)大了抗病譜，而且病原菌多個無毒基因必須均發(fā)生突變(概率非常低)，才會引起品種的抗性喪失(Singh S，Sidhu JS，Huang N，Vikal Y，Li Z，Brar D S.Pyramiding Three Bacterial Blight Resistance Genes[xa5，Xa13，Xa21]UsingMarker-assisted Selection into indica Rice Cultivar PR106.Theoretical andApplied Genetics，2001，1021011-1015；Li Z K，Sanche Z A，Angeles E，SinghS，Domingo J，Huang N.Are the Dominant and Recessive Plant Disease ResistanceGene Similar？A Case Study of Rice R Genes and Xanthomonas oryza pv.Oryzaeraces.Genetics，2001，159757-765)。因此，抗病基因聚合是提高品種抗性持久性、擴(kuò)大抗病譜和地區(qū)適應(yīng)性的重要策略。通過有目的地雜交、復(fù)交，可以將多個抗病基因聚合到同一個體中，但要將這些基因在后代中傳遞，育成穩(wěn)定的高代品系或品種，必須有快捷準(zhǔn)確、切實可行的鑒定手段對每代材料進(jìn)行跟蹤檢測。對于表型不同的抗病基因，可以通過不同病原菌的接種與表型鑒定加以區(qū)別。對于同一病害的不同基因聚合體及其后代，傳統(tǒng)的表型鑒定難以準(zhǔn)確鑒別其中抗病基因的個數(shù)和具體歸屬。分小種人工接種鑒定，可根據(jù)抗譜推導(dǎo)所含抗病基因的組成。但是病原分小種接種鑒定所要求的條件和經(jīng)驗都相當(dāng)高，而且分離世代早期還受同一單株難以同時用多個小種接種鑒定的限制。
因為白粉病菌生理小種的變異，抗白粉病基因Pm4a基因?qū)Π追鄄】剐匀諠u減弱，對目前流行的白粉病菌小種苗期抗性較好，成株期抗性已漸喪失。而源自高大山羊草染色體3S長臂、被引滲到小麥染色體3D、3B長臂上的抗白粉病基因Pm13，對目前流行的白粉病菌小種全生育期高抗；源自簇毛麥染色體6VS的抗白粉病基因PmV和Pm21，對白粉病菌的抗譜廣，全生育期免疫。PmV與Pm21分別來源于蘇聯(lián)的和英國的簇毛麥。
含有PmV的小麥/簇毛麥6DL/6VS易位系Pm97033、Pm97034、pm97035由中國農(nóng)科院作物科學(xué)所陳孝等選育而成(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，JiaX.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)，含有Pm21的小麥/簇毛麥6AL/6AS易位系92R137、92R149、92R178為由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳佩度教授、劉大鈞院士等選育而成(Chen P D，Qi L L，Zhou B，Zhang S Z，Liu D J.Development and molecular cytogeneticanalysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifyingresistance to powdery mildew.Theoretical and Applied Genetics，1995，91(6)1125-1128)。PmV與Pm21均位于簇毛麥染色體6V短臂上，由于6VS與小麥部分同源染色體難以重組、交換，所以Pm21的PCR標(biāo)記也可用于檢測PmV。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種選育兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法。
本發(fā)明所提供的選育兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法，是利用Pm4a的STS標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗黃矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗條銹病基因YrX。
其中，所述利用Pm4a的STS標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm4a的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到470bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因Pm4a。
所述利用Pm13的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm13的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到564bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因Pm13。
所述利用Pm21的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因PmV的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到1400bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因PmV。
所述利用Bdv2的SCAR檢測待測小麥中有無抗黃矮病基因Bdv2的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到450bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗黃矮病基因Bdv2。
所述利用YrX-SSR檢測待測小麥中有無抗條銹病基因YrX的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥擴(kuò)增到160-180bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗條銹病基因YrX。
本發(fā)明利用抗白粉病基因Pm4a、Pm13、PmV，抗條銹病基因YrX、抗黃矮病基因Bdv2特異的PCR標(biāo)記，檢測了抗白粉病、抗條銹病、抗黃矮病5個基因的聚合體，選育出聚合Pm4a+Pm13+PmV+YrX+Bdv2五個抗病基因的兼抗白粉、條銹、黃矮病冬性材料1株，Pm4a+PmV+YrX+Bdv2四個抗病基因的冬性小麥6株，春性BC2F3材料18株，Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四個抗病基因的兼抗上述三種病害的冬性材料2株，春性BC2F3材料3株，具Pm13+YrX+Bdv2，PmV+YrX+Bdv2兼抗三種病害的春性BC2F3單株分別為7株與46株，可為培育持久、廣譜抗性品種提供遺傳基礎(chǔ)明確的豐富抗源。本發(fā)明的方法可在無發(fā)病的環(huán)境條件、植株的任一生育期進(jìn)行分子檢測和快速選擇，特別是在多個抗病基因聚合體檢測，縮短育種周期，加快育種速度上，更體現(xiàn)其優(yōu)越性。因此，本發(fā)明的分子標(biāo)記快速選育兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法，為選育既抗白粉病，條銹病又抗黃矮病的多個基因聚合的小麥種質(zhì)提供了一種快捷的選擇方法。


圖1為YrX-SSR引物gwm501擴(kuò)增BC2F2單株結(jié)果圖2為Pm4a-STS標(biāo)記檢測BC2F3部分單株結(jié)果圖3為Pm13-SCAR標(biāo)記檢測BC2F3部分單株結(jié)果圖4為PmV-SCAR標(biāo)記檢測BC2F3部分單株結(jié)果圖5為Bdv2-SCAR標(biāo)記檢測BC2F3部分單株結(jié)果圖6為YrX-SSR引物gwm501擴(kuò)增BC2F3單株結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、利用5個抗病基因的分子標(biāo)記，包括Pm4a-STS，Pm13-SCAR，Pm21-SCAR，Bdv2-SCAR和YrX-SSR，快速、輔助選育兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)。
一、測試材料的獲得1、田間兼抗白粉病、條銹病、黃矮病的春性小麥種質(zhì)04P161～04P170(BC2F2)及其自交系BC2F3獲得04P161～04P170為3×M269/GP22-15，BC2F2材料，是以春性抗黃矮病小麥品系M269為母本，兼抗白粉病、條銹病的GP22-15(攜帶Pm4a、Pm13、PmV、YrX)為父本雜交獲得F1，再以M269為父本與F1回交得到BC1代，又以M269(攜帶Bdv2)為父本與BC1回交得到BC2代植株，自交1次即獲得BC2F2材料04P161～04P170，再次自交即獲得BC2F3材料。04P161的自交單株記為04P161-1～04P161-10，依此類推，苗期抗病性鑒定從中得到苗期抗病的04P161-1～04P170-10共95株，如表3。而M269為2×寧春12/PP9-1、F6代，PP9-1為攜帶Bdv2的抗黃矮病小麥材料，組合為CSph×2/L1//CSN5BT5D/3/中7902/4/中8601。GP22-15為YW243/70283(攜帶Pm13)//Pm97033(攜帶PmV)、F3的高抗白粉病、條銹病小麥材料。YW243由Y90136(做母本)與RW1685(做父本)雜交獲F2代材料的花藥培養(yǎng)的后代選育而得兼抗黃矮、白粉病、3銹的種質(zhì)，其中Y90136組合為PP9-1/陜7859//豐抗8號，即PP9-1(做母本)與陜7859(做父本)得到雜交種F1再與豐抗8號(做父本)雜交獲得；RW1685的組合為3×豐抗13/Khapli(含有Pm4a，)，以豐抗13做母本，攜帶Pm4a的Khapli為父本，雜交獲得F1，再與豐抗13(做父本)回交2次獲得。
其中，CSph為小麥品種中國春的ph隱性突變體、不能抑制同源染色體配對(英國劍橋植物育種研究所)；L1為抗黃矮病小麥-中間偃麥草二體附加系(Cauderon Y，Saigne B，Dauge M.1973.The resistance to wheat rusts of Agropyron INtermediumand its use in wheat improvement.InProc.4th Int.Wheat Genet.Symp.，pp.401-407.University of Missouri，Columbia，Mo)；CSN5BT5D(英國劍橋植物育種研究所)為小麥品種中國春的5B缺體5D四體、不能抑制同源染色體配對；中7902與中8601(中國農(nóng)科院作物育種栽培研究所)；70283為抗白粉病小麥材料，組合為VPM/百農(nóng)3217×3；Pm97033為攜帶PmV的抗白粉病小麥-簇毛麥易位系，由中國農(nóng)科院作物育種栽培研究所育成(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，Jia X.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)；寧春12為寧夏銀川市科委育成的春小麥品種、豐產(chǎn)、廣適；陜7859(陜西農(nóng)科院糧食作物研究所)，是抗條銹病小麥品種；豐抗8號(中國農(nóng)科院作物育種栽培研究所)，組合為有芒紅7號/洛夫林10號，是抗條銹病的豐產(chǎn)小麥品種；豐抗13(中國農(nóng)科院作物育種栽培研究所)，組合為北京14/抗引655，是抗條銹病的豐產(chǎn)小麥品種；Khapli為攜帶Pm4a的抗白粉病小麥種質(zhì)(英國劍橋植物育種研究所))。
2、田間兼抗白粉病、條銹病、黃矮病的冬性小麥種質(zhì)04S003-1～04S003-10的獲得04S003-1～04S003-10為2×M269/GP22-13//CA9722×4(BC3F1)，是以春性抗黃矮病小麥品系M269為母本，兼抗白粉病、條銹病的GP22-13為父本雜交獲得F1，再以M269為父本與F1回交得到BC1代，又與冬小麥CA9722(做父本)雜交1次，回交3次的材料。其中，GP22-13組合為YW243/70283(攜帶Pm13)//Pm97033(攜帶PmV)、F3。CA9722(中國農(nóng)科院作物育種栽培研究所)是抗條銹、葉銹小麥品種。
3、含有Pm4a的Khapli，含Pm4a、抗條銹病新基因YrX的YW243(謝皓，陳孝，張增艷，辛志勇，林志珊，杜麗璞，馬有志，徐惠君.抗黃矮病小麥新品系YW243的選育和細(xì)胞分子生物學(xué)鑒定.作物學(xué)報，2000，26(6)687-691)、含有Pm13的70823(即Pm776-1)、含有PmV的Pm97033(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，JiaX.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)、含有Bdv2的HW642(Zhang Z Y，Xu J S，Xu QJ，Larkin Philip，Xin Z Y.Development of novel PCR markers linked to theBYDV resistance gene Bdv2 useful in wheat for marker-assisted selection.Theoretical and Applied Genetics，2004，109433-439))分別作為各基因檢測的陽性對照，小麥品種中國春(CS)、中8601、CA9722作為陰性對照。
二、抗病鑒定白粉病抗病性鑒定在田間和溫室條件下，對上述測試材料幼苗先人工接種白粉病菌15號生理小種，14天后再接種白粉病自然發(fā)病的混合小種，2-3周后，感病對照中8601充分發(fā)病時，調(diào)查04P161～04P170(BC2F2)及其自交株系(BC2F3)和04S003-1～04S003-10苗期和成株期抗病性。本研究以接種葉片無白粉病菌孢子粉堆的定為抗病，葉片5％以上有白粉病菌孢子粉堆的定為感病。
黃矮病抗病性鑒定在田間苗期接種攜帶大麥黃矮病毒蚜蟲(GAV株系)，40天后觀察發(fā)病情況。以無黃矮病癥葉片的植株為抗病，有黃矮病癥葉片的植株為感病。
條銹病抗病性鑒定用摩擦法于一葉一心期接種條銹病菌30號流行小種，待對照品種銘賢169發(fā)病充分后(約15天)調(diào)查抗病性。以葉片無條銹病菌明顯孢子堆的植株為抗病。
在田間，對轉(zhuǎn)育的2個組合的春性材料與冬性材料進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果表明，春性04P161～04P170(BC2F2)與冬性04S003-1～04S003-10各10個單株均抗白粉病、條銹病、黃矮病。對上述材料按照步驟三的方法進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，結(jié)果見表1、表2。并對04P161～04P170自交(BC2F3)株系04P161-1～04P170-21進(jìn)行抗病鑒定及其抗性基因的分子檢測。
在溫室條件下，對春性材料04P161～04P170自交株系(BC2F3)04P161-1～04P170-21接種白粉病菌，鑒定其苗期、成株期的白粉病抗性，拔除苗期感病植株，保存抗病植株，繼續(xù)進(jìn)行成株期抗病鑒定，提取04P161-1～04P170-10共95個單株DNA，進(jìn)行5個抗病基因的分子檢測，結(jié)果見表3。
三、分子標(biāo)記檢測1、利用分子標(biāo)記Pm4-STS檢測抗白粉病基因Pm4aPm4-STS的PCR擴(kuò)增參照Ma等(Ma Z.Q，Wei J.B，Cheng S.H.2004，PCR-basedmarkers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat.Theoretical andApplied Genetics，109140-145)方法和發(fā)表的Pm4F、Pm4R序列合成引物Pm4F、Pm4R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(1)Pm4a-STS特異引物序列Pm4F5‘-TCCAGTGACCCCATCTGCTCATAC-3’(序列1)Pm4R5‘-GTGGTGTATCAAA TGTCATCAGTACTAC-3’(序列2)(2)反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 2.5μl25mM MgCl22.0μl10mM dNTPs 0.5μlTaqE(5u/ul)0.2μlPm4F(60ng/L) 1.0μlPm4R(60ng/L) 1.0μl基因組DNA(50ng/ul) 2.0μlddH2O 15.8μl總計 25μl(3)反應(yīng)條件先96℃預(yù)變性1min；然后94℃ 1min，60℃ 1.5min，72℃ 1.5min共35個循環(huán)；再72℃延伸10min。
將得到的PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，如得到與具Pm4a陽性對照Khapli相同的470bp的Pm4a-STS的特異帶，則待測小麥植株含有抗白粉病基因Pm4a。
2、利用分子標(biāo)記Pm13-SCAR檢測抗白粉病基因Pm13Pm13-SCAR的PCR擴(kuò)增參照Cenci等(Ceici A，D’Ovidio R，TanzareLLa 0A，Ceoloni C，Porceddu E.Identification of molecular markers linked to Pm13，an Aegilops Longissiuma gene conferring resistance to powdery mildew in wheat，Theor.Appl.Genet.，1999，98448-454)方法以及發(fā)表的P13F和P13R序列合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(1)Pm13-SCAR特異引物序列P13F5’-CGCCAGCCAATTATCTCCATGA-3’(序列3)P13R5’-AGCCATGCGCGGTGTCATGTGAA-3’(序列4)(2)反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 2.5μl25mM MgCl21.5μl10mM dNTPs 0.5μlTaqE(5u/ul) 0.2μlP13F(50ng/L)1.0μlP13R(50ng/L)1.0μl基因組DNA(50ng/ul) 2.0μlddH2O 16.3μl總計25μl(3)反應(yīng)條件先94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，共40個循環(huán)；再72℃延伸10min。
將得到的PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，如果得到與具Pm13陽性對照PM776-1相同的564bp的Pm13-SCAR特異帶，則待測小麥植株含有抗白粉病基因Pm13。
3、利用分子標(biāo)記Pm21-SCAR檢測抗白粉病基因PmVPMV與Pm21均位于簇毛麥染色體6V短臂上，由于6VS與小麥部分同源染色體難以重組、交換，所以Pm21的PCR標(biāo)記可用于檢測PmV。
Pm21-SCAR的PCR擴(kuò)增利用Pm21D和Pm21C引物和Liu等方法(Liu Z Y，SunQ X，Ni Z F.Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferringresistance to the powdery mildew in common wheat.Plant Breeding，1999，118215-219)進(jìn)行。
(1)Pm21-SCAR特異引物序列Pm21C5’-CACTCTCCTCAAACCTTGCAAG-3’(序列5)
Pm21D5’-CACTCTCCTCCACTAACAGAGG-3’(序列6)(2)反應(yīng)體系除引物外同Pm13。
(3)反應(yīng)條件先94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，共35個循環(huán)；最后72℃ 10min。
將得到的PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，如果得到與具PmV陽性對照Pm97033相同的1400bp的Pm21(V)-SCAR特異條帶，則待測小麥植株含有抗白粉病基因PmV。
4、利用分子標(biāo)記Bdv2-SCAR檢測抗黃矮病基因Bdv2Bdv2-SCAR的PCR擴(kuò)增采用引物SC-W37U和SC-W37L和張增艷等方法(張增艷，辛志勇，陳孝，王曉萍，劉景芳，杜麗璞.源于L1的小麥抗黃矮病基因的特異PCR標(biāo)記及輔助育種的研究.作物學(xué)報，2000，28(4)486-491)進(jìn)行。
(1)Bdv2-SCAR特異引物序列SC-W37U5’-ACGAATTCCCAGCTAAACGCCCTC-3(序列7)SC-W37L5’-TCATTGTTGATCTTGCATGGTCGTAG-3’(序列8)(2)Bdv2反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 2.5μl25mM MgCl22.5μl2.5mM dNTPs 2.0μlTaqE(5u/ul) 0.2μlSC-W37U(5umol/L) 1.0μlSC-W37U(5umol/L) 1.0μl基因組DNA(25ng/ul)2.0μlddH2O13.8μl總計 25μl(3)擴(kuò)增條件先96℃預(yù)變性1min；然后94℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 2min，共35個循環(huán)；最后72℃ 10min。
將得到的PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，如果得到與具Bdv2陽性對照HW642相同的450bp的Bdv2-SCAR特異帶，則待測小麥植株含有抗黃矮病基因Bdv2。
5、利用分子標(biāo)記YrX-SSR檢測抗條銹病基因YrXYrX-SSR的PCR擴(kuò)增利用SSR引物gwm501和劉朝輝等方法(劉朝輝，林志珊，陳孝，馬有志，徐世昌，張增艷，辛志勇，王輝.小麥新種質(zhì)YW243抗條銹病的染色體定位.麥類作物學(xué)報，2005，25(1)13-16)進(jìn)行。
(1)YrX-SSR引物gwm501序列g(shù)wm501-F 5’-GGCTATCTCTGGCGCTAAAA-3’(序列9)gwm501-R 5’-TCCACAAACAAGTAGCGCC-3’(序列10)(2)YrX反應(yīng)體系10×PCR緩沖液2.5μl25mM MgCl20.8μl2.5mM dNTPs 1.6μlTaqE(5u/ul) 0.2μlgwm501-F(4umol/L)1.5μlgwm501-R(4umol/L)1.5μl基因組DNA(40ng/ul) 2.0μlddH2O 14.9μl總計 25μl(3)擴(kuò)增條件先94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共45個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、硝酸銀銀染分析，如果得到與具YrX陽性對照YW243相同的160-180bp的YrX-SSR特異帶，則待測小麥植株含有抗條銹病基因YrX。
對經(jīng)步驟二的田間抗病性鑒定的春性04P161～04P170(BC2F2)與冬性04S003-1～04S003-10各10個單株按照上述方法利用分子標(biāo)記進(jìn)行抗白粉病基因、抗黃矮病基因和抗條銹病基因檢測。
春性材料檢測結(jié)果如表1所示，從田間抗白粉病、條銹病、黃矮病的春性材料04P161～04P170(BC2F2)10個單株，均檢測到抗條銹病基因YrX(圖1)，至少一個抗白粉病基因Pm4a，Pm13，PmV，除04P164中未檢測到抗黃矮病基因Bdv2外，其它9個單株均檢測到抗黃矮病基因Bdv2，分子標(biāo)記結(jié)果與田間抗性結(jié)果基本一致。
表1春性材料BC2F2單株的分子標(biāo)記檢測

注“+”表示檢測到該基因，“-”表示未檢測到該基因。
其中，利用SSR引物Xgwm501PCR擴(kuò)增春性04P161-170(BC2F2)10個單株的YrX-SSR結(jié)果如圖1所示，10個單株均可擴(kuò)增出160-180bp的YrX-SSR特異帶(箭頭示目的條帶)；MpBR322 DNA/Msp I marker；1.YW243；2.中國春(CS)；3.04P161；4.04P162；5.04P163；6.04P164；7.04P165；8.04P166；9.04P167；10.04P168；11.04P169；12.04P170。
對兼抗白粉病、條銹病、黃矮病的冬性材料04S003-1～04S003-10的抗白粉病、抗條銹病、抗黃矮病基因進(jìn)行分子檢測，結(jié)果如表2。表2表明，所檢測的10個冬性單株，均是2～5個抗病基因聚合體，其中一個單株04S003-4聚合了Pm4a+Pm+PmV+YrX+Bdv2五個抗病基因，04S003-1～04S003-2、04S003-7～04S003-10六個單株聚合了Pm4a+PmV+YrX+Bdv2四個抗病基因，04S003-3、04S003-6兩個單株聚合了Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四個抗病基因，分子標(biāo)記結(jié)果與田間抗性結(jié)果基本一致。
表2冬性小麥種質(zhì)BC3F1單株分子標(biāo)記


從表1得知，10個春性小麥BC2F2單株大部分具有3-4個抗病基因。若想在后代中保持多個抗性基因，就要求對每代材料中每個基因都進(jìn)行跟蹤檢測，選擇穩(wěn)定的抗性基因聚合體作為多抗親本。
對春性小麥BC2F2材料的自交株系(BC2F3)95個單株進(jìn)行了Pm4a、Pm13、PmV、Bdv2、YrX五個抗性基因的分子標(biāo)記跟蹤檢測，04P161的自交單株記為04P161-1～04P161-10，依此類推，結(jié)果如表3和圖2～6所示。
表3春性BC2F3代自交株系分子標(biāo)記檢測結(jié)果(成株期)

注R示抗白粉??；S示感白粉病；+示檢測到該基因；-示未檢測到該基因)
由表3得知，在95個自交株系BC2F3單株中，選擇到聚合Pm4a+PmV+YrX+Bdv2、Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四個基因兼抗白粉病、條銹病和黃矮病3種病害的單株分別有18個和3個，聚合PmV+Bdv2+YrX、Pm13+Bdv2+YrX三個抗性基因兼抗白粉病、條銹病和黃矮病3種病害的的分別有46個和7個單株。上述結(jié)果證實，通過分子標(biāo)記選擇抗性基因聚合體自交后代，獲得3-4個抗病基因聚合體的數(shù)目增加。從BC2F2單株及其自交株系BC2F3單株的抗病基因分子檢測結(jié)果得知，抗病基因特別是雜合基因型和外源抗病基因在回交、自交過程中會發(fā)生分離，所以利用分子標(biāo)記對每代材料進(jìn)行選擇非常必要。
圖2中，箭頭示470bp的Pm4a-STS特異帶；M.PCR markers(購自華美生物工程公司)；1.Khapli；2CS；3.04P169-7；4.0469-8；5.4P169-9；6.04P169-10；7.04P170-1；8.04P170-2；9.04P170-3；10.04P170-4；11.04P 170-5；12.04P170-6；13.04P 170-7；14.04P170-8；15.04P170-9；16.04P170-10。圖3中，箭頭示564bp的Pm13-SCAR特異帶；M.100bp ladders；1.Pm776-1；2.CS；3.04P168-3；4.04P168-4；5.04P168-5；6.04P168-6；7.04P168-7；8.04P168-8；9.04P168-9；10.04P168-10；11.04P165-1；12.04P165-2；13.04P165-3；14.04P165-4；15.04P165-5；16.04P165-6。圖4中，箭頭示1400bp的PmV-SCAR特異帶；M.100bpladders；1.CS；2.Pm97033；3.04P166-1；4.04P166-2；5.04P166-3；6.04P166-4；7.04P 166-5；8.04P 166-6；9.04P 166-7；10.04P 166-8；11.04P 166-9；12.04P166-10；13.04P167-2；14.04P167-3；15.04P167-4；16.04P167-5。圖5中，箭頭示450bp的Bdv2-SCAR特異帶；M.100bp ladders；1.HW642；2.CS；3.04P166-1；4.04P166-2；5.04P166-3；6.04P166-4；7.04P166-5；8.04P166-6；9.04P166-7；10.04P166-8；11.04P166-9；12.04P166-10；13.04P167-2；14.04P167-3；15.04P167-4；16.04P167-5。圖6中，箭頭示160-180bp的YrX特異帶，MpBR322DNA/Msp I markers；1.YW243；2.中國春；3.04P165-1；4.04P166-2；5.04P161-1；6.04P161-2；7.04P161-3；8.04P161-4；9.04P161-5；10.04P161-6；11.04P161-7；12.04P161-8；13.04P161-9；14.04P161-10；15.04P162-1；16.04P162-2。
序列表<160>10<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tccagtgacc ccatctgctc atac 24<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtggtgtatc aaatgtcatc agtactac 28<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgccagccaa ttatctccat ga 22<210>4
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4agccatgcgc ggtgtcatgt gaa 23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5cactctcctc aaaccttgca ag 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6cactctcctc cactaacaga gg 22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7acgaattccc agctaaacgc cctc 24<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8tcattgttga tcttgcatgg tcgtag 26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9ggctatctct ggcgctaaaa 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10tccacaaaca agtagcgcc 19
權(quán)利要求
1.一種輔助選育兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法，是利用Pm4a的STS標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗黃矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗條銹病基因YrX。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm4a的STS標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm4a的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到470bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因pm4a。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm13的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm13的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到564bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因Pm13。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm21的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因PmV的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到1400bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗白粉病基因PmV。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Bdv2的SCAR檢測待測小麥中有無抗黃矮病基因Bdv2的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥得到450bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗黃矮病基因Bdv2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利用YrX-SSR檢測待測小麥中有無抗條銹病基因YrX的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測小麥擴(kuò)增到160-180bp的DNA片段，則該待測小麥中含有抗條銹病基因YrX。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選育多基因聚合的兼抗白粉病，條銹病和黃矮病小麥種質(zhì)的方法。該方法利用Pm4的STS標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR標(biāo)記待測小麥中有無抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗黃矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR標(biāo)記檢測待測小麥中有無抗條銹病基因YrX。本發(fā)明的方法，可準(zhǔn)確地檢測出目的基因的存在、測試材料中抗性基因的個數(shù)和具體歸屬，克服了常規(guī)表型鑒定的局限性，特別是在多個抗病基因聚合體檢測，縮短育種周期，加快育種速度上，為選育抗白粉病，條銹病和黃矮病的小麥新品系(種)提供了一種快捷的選擇方法和基因型明確、豐富的新種質(zhì)。
文檔編號C12Q1/68GK1904063SQ20051008714
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者張增艷, 辛志勇, 陳孝, 林志珊, 曾祥艷, 徐惠君, 杜麗璞 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所