專利名稱：一種綜合的基因改組方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的指導(dǎo)進(jìn)化，具體的說是一種綜合的基因改組方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白，是一種能將易錯(cuò)PCR和StEP巧妙的整合在一個(gè)反應(yīng)過程中的基因改組方法。
背景技術(shù)：
指導(dǎo)進(jìn)化就是在實(shí)驗(yàn)室中人為創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(如突變、重組)，從而在不需要了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能的前提下，定向選擇出所需性質(zhì)的蛋白分子。目前這一機(jī)制已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物，農(nóng)業(yè)，化學(xué)工業(yè)，生物工程等領(lǐng)域(Patten，P.A.，Howard，R.J.&Stemmer，W.P.C.Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals andvaccines.Curr Opin Biotechnol.1997，8724-733)，特別是被應(yīng)用于提高酶的活性(Crameri，A.，Raillard，S-A.，Bermudez，E.&Stemmer，W.P.C.DNAshuffling of a family of genes from diverse species accelerates directedevolution.Nature.1998，391，288-291.)、穩(wěn)定性(Oh，K.H.，Nam，S.H.& Kim，H.S.Improvement of Oxidative and Thermostability of N-Carbamyl-D-AminoAcid Amidohydrolase by Directed Evolution.Protein Eng.2002，15，689-695.)和表達(dá)水平(Bulter，T.et.al.Functional expression of a fungal laccase inSaccharomyces cerevisiae by directed evolution.Appl.Environ.Microbiol.2003，69，987-995.)。
隨著各種新型突變技術(shù)和新型的檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，對于指導(dǎo)進(jìn)化的研究不斷向縱深發(fā)展。指導(dǎo)進(jìn)化相關(guān)的方法有很多，其中簡單和為人們所熟知的就是采用易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)產(chǎn)生隨機(jī)突變。該方法采用低保真性的擴(kuò)增步驟，在每一輪循環(huán)中都隨機(jī)的引入點(diǎn)突變。該方法具有很多成功的例子，但是不能夠滿足進(jìn)化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的復(fù)雜性，主要是由于缺乏重組機(jī)制。運(yùn)用該方法，人們往往無法得到核苷酸序列分布的多樣性，因?yàn)槎鄠€(gè)點(diǎn)突變不容易重新組合，因此無法獲得對功能序列空間的有意義的探索。而另一種PCR相關(guān)的基因改組方法—交錯(cuò)延伸過程(StEP)則可以通過序列延伸過程中模板間的切換，介導(dǎo)產(chǎn)生不同母鏈DNA間的序列交換，從而有效的實(shí)現(xiàn)基因間的重新組合。
在以往的研究中，StEP和error-prone PCR經(jīng)常被結(jié)合使用，但是需要經(jīng)歷相對獨(dú)立的兩個(gè)反應(yīng)過程(Zhao，H.，Giver，L.，Shao，Z.& Arnold，F(xiàn).H.Molecular evolution by staggered extension process(StEP)in.vitrorecombination.Nat.Biotechnol.1998，16，258-261.；Zhao H，Arnold F H.Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent ofthermitase[J].Protein Eng，1999，1247～53.)，而這些過程往往工作量很大，非常費(fèi)時(shí)，而且在這些煩瑣的步驟中，一些有意義的突變位點(diǎn)可能會(huì)丟失。以對SAM合成酶基因進(jìn)行改組為例，其具體反應(yīng)流程是(如圖1-b)首先進(jìn)行易錯(cuò)PCR——進(jìn)行產(chǎn)物純化——產(chǎn)物經(jīng)酶切后克隆進(jìn)載體——重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌——轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有乙硫氨酸和氨芐的LB培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選——從存活菌株中提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化釀酒酵母——SAM抽提——用HPLC進(jìn)行SAM含量測定——抽提能促進(jìn)胞內(nèi)SAM積累量提高的重組質(zhì)粒——以上述重組質(zhì)粒為模板，建立StEP反應(yīng)體系，進(jìn)行基因改組。因此能否將兩者有機(jī)的結(jié)合起來，盡可能的減少工作量，提高工作效率，是亟待解決的一個(gè)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種綜合的基因改組方法，該方法通過簡單的實(shí)驗(yàn)步驟將以往兩種獨(dú)立的基因改造技術(shù)(易錯(cuò)PCR和StEP)巧妙的結(jié)合在一個(gè)反應(yīng)體系中，并通過一輪反應(yīng)即實(shí)現(xiàn)了基因的突變與改組；并運(yùn)用該方法產(chǎn)生了改組基因和活性提高的改組蛋白。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種綜合的基因改組方法，步驟如下1)易錯(cuò)PCR選取待突變/改組的線性雙鏈基因，采用易錯(cuò)PCR方法擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，所得到的產(chǎn)物用80％酒精沉淀，清洗去除反應(yīng)體系中的可溶性組分；2)StEP反應(yīng)在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、緩沖液和超純水，組成StEP反應(yīng)體系，并擴(kuò)增得到改組基因，通過瓊脂糖凝膠電泳，并對目的大小的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后進(jìn)行表達(dá)與篩選，獲得具有目的特征的改組基因。
下面以釀酒酵母總DNA為模板，擴(kuò)增帶有EcoRI和NotI的sam1基因，該基因具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列。將該基因克隆到pYES2載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行如下步驟1)以上述重組質(zhì)粒為模板，采用易錯(cuò)PCR方法擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，所得到的產(chǎn)物用80％酒精沉淀，并反復(fù)清洗，去除反應(yīng)體系中的可溶性組分；2)在沉淀物中加入相關(guān)物質(zhì)，組成StEP反應(yīng)體系，并擴(kuò)增得到改組基因；3)通過瓊脂糖凝膠電泳，對目的大小的DNA片段進(jìn)行純化和特異性擴(kuò)增；4)將重組基因連入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入釀酒酵母，通過篩選，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通過腺苷蛋氨酸含量的測定，分離得到含量提高的菌株及其所包含的重組基因；所獲得的重組基因具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列；該核酸序列來源于初始基因，與初始基因相比具有8個(gè)點(diǎn)突變A58C，T255A，T309C，G358A，G417A，A552G，A637T和G1060T。所獲得的重組基因編碼的蛋白，具有序列表SEQ ID No4中的氨基酸序列，其能在釀酒酵母中高效表達(dá)，并能促進(jìn)SAM在胞內(nèi)的積累量；該蛋白氨基酸序列分別來源于初始酶，并且具有4個(gè)氨基酸突變I20L，G120S，I213L和A354S。
同樣以對SAM合成酶基因進(jìn)行改組為例，采用本試驗(yàn)方法，，在本研究中，我們運(yùn)用該方法對來自釀酒酵母的SAM合成酶基因sam1進(jìn)行了改組。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.過程非常簡單。本方法首先采用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，反應(yīng)物經(jīng)80％酒精沉淀和反復(fù)清洗后，所得的產(chǎn)物作為引物與模板，通過交錯(cuò)延伸過程(staggered extension process，StEP)，也就是在DNA擴(kuò)增過程中通過縮短退火和延伸時(shí)間而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增片段在模板間的切換，從而實(shí)現(xiàn)基因間改組(反應(yīng)步驟如下易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)反應(yīng)15個(gè)循環(huán)——產(chǎn)物用80％乙醇沉淀和洗滌——將上述沉淀溶解，并加入其它組分，建立StEP反應(yīng)體系，進(jìn)行基因改組)。本發(fā)明通過獨(dú)特的反應(yīng)過程提供了一個(gè)新的基因改組方法，該方法通過簡單的實(shí)驗(yàn)步驟將以往兩種獨(dú)立的基因改造技術(shù)(易錯(cuò)PCR和StEP)巧妙的結(jié)合在一個(gè)反應(yīng)體系中，并在一個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)過程中同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因的隨機(jī)突變與改組；使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行基因改組，僅通過一輪反應(yīng)即可獲得改組基因；2.安全、效果穩(wěn)定。使用本發(fā)明所述方法可以避免傳統(tǒng)方法中由于復(fù)雜的步驟可能造成的有益點(diǎn)突變的缺失。
3.應(yīng)用效果好。使用本發(fā)明方法用來自于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1為起始基因驗(yàn)證了該方法的有效性，獲得了一種重組基因，其核酸序列與原有基因序列相比具有8點(diǎn)突變A58C，T255A，T309C，G358A，G417A，A552G，A637T，G1060T，該基因可以在大腸桿菌中高效表達(dá)；其編碼的重組酶來源于初始酶，并且具有4個(gè)氨基酸突變I20L，G120S，I213L和A354S，其具有SAM合成酶活性，能促進(jìn)SAM在胞內(nèi)的積累量提高；引用本發(fā)明，可進(jìn)一步提供直接用于生產(chǎn)重組酶的工程菌株。


圖1為采用綜合性方法對sam1進(jìn)行突變和改組；其中，A顯示該方法的試驗(yàn)步驟，經(jīng)15個(gè)循環(huán)的易錯(cuò)PCR后，產(chǎn)物經(jīng)80％乙醇沉淀和洗滌并直接用作模板和引物進(jìn)行StEP改組過程；B顯示在采用以往方法對SAM進(jìn)行改組時(shí)，為達(dá)到同樣的目的所需要的更多的試驗(yàn)步驟；圖2為SAM合成酶基因sam1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析；其中，LaneMDNA Marker DL2000；Lane1PCR目的條帶；圖3為采用綜合性方法對sam1進(jìn)行突變和改組過程的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，Lane MDNA marker DL2000；Lane1采用綜合的基因改組方法，經(jīng)一輪反應(yīng)后所得到的產(chǎn)物；Lane2目的大小DNA片段的特異性擴(kuò)增(大約1.15kb)；
圖4為采用綜合性方法指導(dǎo)進(jìn)化的sam1表達(dá)量的SDS-PAGE圖；其中，Lane M中分子量蛋白質(zhì)Marker；Lane 1-3分別代表包含有不同質(zhì)粒的釀酒酵母的表達(dá)情況Lane1包含pYES2；Lane2包含pYES2+sam1；Lane3包含pYES2+sam1’；圖5為含有重組質(zhì)粒的釀酒酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后胞內(nèi)SAM積累量的HPLC圖；其中，(a)到(c)分別代表包含有不同質(zhì)粒的釀酒酵母在誘導(dǎo)表達(dá)后SAM的胞內(nèi)積累量(a)含有pYES2，(b)含有pYES2+sam1，(c)含有pYES2+sam1’；(d)SAM標(biāo)準(zhǔn)品。
具體實(shí)施例方式
易錯(cuò)PCR和StEP分別是介導(dǎo)點(diǎn)突變和DNA序列交換的常用方法，兩種方法都是基于傳統(tǒng)PCR建立起來的。兩者的不同之處在于PCR反應(yīng)體系的組分和反應(yīng)的程序。具體的說，在反應(yīng)體系的組分上，兩種方法的主要區(qū)別在于引物與模板的比率不同。對于易錯(cuò)PCR，其比率與標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序相似，約為106∶1，這一比率明顯高于StEP。在本發(fā)明中，首先要進(jìn)行易錯(cuò)PCR，在反應(yīng)初始階段，特別是前十幾個(gè)循環(huán)中，產(chǎn)物將以近似指數(shù)形式遞增，相應(yīng)的，引物也將以同樣的方式遞減；15個(gè)循環(huán)過后，以60％-100％之間的擴(kuò)增效率計(jì)算，引物與模板之間的比率將從106∶1降低到61-866∶1，而這一比率與所報(bào)道的StEP反應(yīng)體系要求的比率范圍基本吻合；產(chǎn)物經(jīng)80％的乙醇沉淀和洗滌后，反應(yīng)體系中可溶性成分(包括taq DNA聚合酶，1×taq buffer，dNTP等)將會(huì)被除去，而沉淀下來的PCR產(chǎn)物和引物經(jīng)超純水溶解后，可以作為下一個(gè)步驟中StEP反應(yīng)體系的模板與引物。這樣的處理方法，可以節(jié)省在以往方法中易錯(cuò)PCR結(jié)束后所需要的大量的反應(yīng)步驟(如圖1-b)。
實(shí)施例1一種來源于釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1，具有序列表SEQ ID No1中的堿基序列。
SEQ ID No1ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGATAAGATCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGGACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATGGTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAGAGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGTTTCGACTATAAGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGATATCGCCCAAGGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCGGTGACCAAGGTATCATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTGACTATTCTTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCTTTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGATGACCACGGTAGATGGGTTCCACAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTCAACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAGATCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTTTATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTT
TGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTATGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAGTTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCACGTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTATCAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAGCTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAATACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度1149堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1(2)來源于釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1的制備上游引物15-GTCGAATTCATGGCCGGTACATTTTTATTCAC-3；下游引物25-GCAGCGGCCGCTTAGAACTTCAAAGTCTTAGGC-3；下劃線序列分別為EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)。
擴(kuò)增條件以釀酒酵母INVScI菌株總DNA為模板，以pfu DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmolL-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，總反應(yīng)體積100μl；反應(yīng)條件94℃變性2min；30個(gè)循環(huán)的94℃30s，55℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物回收按上海華舜試劑盒使用說明書。目的產(chǎn)物見瓊脂糖凝膠電泳(如圖2)。將目的基因經(jīng)EcoRI和NotI酶切后克隆入pSE380載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pSE380-sam1重組質(zhì)粒。
實(shí)施例2采用新的綜合的基因改組方法對sam1進(jìn)行改組，獲得編碼酶活性提高的重組酶的基因sam1，具有序列表SEQ ID No3的堿基序列。
SEQ ID No 3ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGATAAGCTCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGGACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATGGTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAGAGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGATTCGACTATAAGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGACATCGCCCAA
GGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCAGTGACCAAGGTATCATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTAACTATTCTTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCTTTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGATGACCACGGTAGATGGGTTCCGCAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTCAACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAGTTCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTTTATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTTTGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTATGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAGTTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCACGTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTATCAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTATCTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAATACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA(1)SEQ ID No3的信息(參見序列表)(A)序列特征*長度1149堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(2)采用綜合的基因改組方法對sam1進(jìn)行改組。
采用易錯(cuò)PCR方法引入隨機(jī)突變。5’和3’引物分別為P1(5-GTCGAATTCATGGCCGGTACATTTTTATTCAC-3)；P2(5-GCAGCGGCCGCTTAGAACTTCAAAGTCTTAGGC-3)P1和P2中下劃線序列分別為EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，該序列的存在將允許PCR產(chǎn)物經(jīng)過相應(yīng)的酶切后克隆入經(jīng)同樣酶切的pYES2載體中。
易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系如下dATP 0.2mM，dGTP 0.2mM，dCTP 1mM，dTTP 1mM，MnCl21mM，MgCl28mM，引物各1μM，模板(質(zhì)粒pYES2-sam1)0.3ng，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，加ddH2O至反應(yīng)總體積為100μl。PCR反應(yīng)程序如下94℃變性2min，隨后15個(gè)循環(huán)的94℃30s，45℃1min，72℃2min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用80％乙醇沉淀并洗滌3次，干燥后溶解于20μl無菌水中。
該產(chǎn)物被用作下一步驟的模板和引物，其反應(yīng)體系如下dNTP 0.2mM，MgCl21.5mM，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，引物與模板(上述反應(yīng)產(chǎn)物)，加ddH2O至反應(yīng)總體積為100μl。反應(yīng)程序如下94℃變性2min，隨后80個(gè)循環(huán)的94℃30s，50℃5s。
反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，其正確大小的條帶(約1.15kb)用膠回收試劑盒純化。純化產(chǎn)物用于模板特異性的擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系為dNTP 0.2mM，MgCl21.0mM，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，模板2ng，引物0.5μM，加ddH2O至反應(yīng)總體積為100μl。PCR反應(yīng)程序如下94℃變性2min，隨后30個(gè)循環(huán)的94℃30s，52.5℃30s，72℃2min；然后72℃10min。產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，然后用EcoRI和NotI進(jìn)行限制性酶切消化，反應(yīng)物總體積為20μl。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)滅活內(nèi)切酶后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，目的大小的條帶(約1.15kb)被切下并用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。用T4 DNA連接酶將純化產(chǎn)物連接到經(jīng)同樣酶切的pSE380載體上。
將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有100μg/ml Amp和10mmol/L乙硫氨酸的LB平板上進(jìn)行篩選，以獲得含有突變目的基因的重組菌株。平板在37℃下培養(yǎng)12h。從存活的菌株中抽提重組質(zhì)粒，然后再用EcoRI和NotI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)滅活內(nèi)切酶后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，目的大小的條帶(約1.15kb)被切下并用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，再用T4 DNA連接酶將純化產(chǎn)物亞克隆到經(jīng)同樣酶切的pYES2載體上，構(gòu)建pYES2+sam1’重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScI菌株。挑取基因工程菌單菌落接種到15ml修改的SC-U培養(yǎng)基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，賴氨酸，絡(luò)氨酸，蘇氨酸；0.05g的天冬氨酸，組氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸和纈氨酸；終體積1L)，包括2％棉籽糖。30℃培養(yǎng)至OD600＝0.4，然后4℃下1500×g離心5min，然后將細(xì)胞重懸于2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(修改的SC-U培養(yǎng)基，包含2％的半乳糖)，再接種到50ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，30℃條件下150r min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)6h。然后4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，將沉淀重懸于500μl的純凈水。4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，細(xì)胞用于檢測SAM積累。每1g菌體中加入5ml 1.5mol L-1的高氯酸以120r min-1搖動(dòng)1h.進(jìn)行抽提，生成的SAM水平用BioCAD 700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)進(jìn)行檢測。本試驗(yàn)選用弱陽離子交換柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流動(dòng)相為0.5mol L-1的HCOONH4，pH調(diào)整為4.0，流速為5ml min-1，在260nm波長下檢測產(chǎn)物，室溫22℃。作為對照，含有pYES2質(zhì)粒和pYES2+sam1質(zhì)粒的釀酒酵母也被用于檢測SAM的胞內(nèi)積累量。10μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品SAM被用于標(biāo)定SAM的保留時(shí)間。
取1ml發(fā)酵液離心，菌體沉淀用1ml蒸餾水洗滌，離心后重懸于1倍的上樣緩沖液中，沸水浴煮10min，12000×g離心2min。取10μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，0.1％考馬斯亮藍(lán)染色，然后檢測蛋白的表達(dá)。
結(jié)果1.運(yùn)用本發(fā)明所述的基因改組方法，經(jīng)過一輪反應(yīng)即獲得目的大小的重組DNA(如圖3)；
2.在工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳中有一條明顯的表達(dá)帶，誘導(dǎo)蛋白如圖4所示。分子量約為4.2K dalton；3.通過HPLC檢測，得到一株腺苷蛋氨酸胞內(nèi)積累量提高的釀酒酵母菌株，胞內(nèi)SAM積累量較對照提高了26％(如圖5)；4.對其所含質(zhì)粒pYES2+sam1’進(jìn)行序列分析，確定其含有改組基因，并且具有8個(gè)位點(diǎn)突變，引起4個(gè)氨基酸替換。
基因改組SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>一種綜合的基因改組方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1149<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1149)<223>
<400>1atg gcc ggt aca ttt tta ttc act tct gaa tcc gtt ggt gaa ggt cac 48Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15cca gat aag atc tgt gac caa gtt tcc gac gcc atc ttg gac gct tgt 96Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys20 25 30tta gcc gag gac cct cac tcc aaa gtt gcg tgt gaa acc gcg gca aag144Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys35 40 45act ggt atg att atg gtc ttt ggt gaa att act acc aag gca cag ttg192Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu50 55 60gat tac caa aaa atc gtc aga gac acc atc aag aag att ggt tac gat240Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp65 70 75 80gat tcc gcc aag ggt ttc gac tat aag acc tgt aac gtc ctt gtc gcc288Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala85 90 95att gag caa caa tct cca gat atc gcc caa ggt gtc cac gag gag aag336Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys100 105 110gat ttg gaa gac atc ggt gcc ggt gac caa ggt atc atg ttt ggt tac384Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr115 120 125gcc aca gat gaa act cca gag ggt ttg cct ttg act att ctt ttg gct432
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala130 135 140cat aaa cta aac atg gcc atg gct gac gcg aga aga gat ggc tct tta480His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu145 150 155 160gcg tgg ttg aga cca gac acc aag act caa gtc acc gtc gaa tac aag528Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys165 170 175gat gac cac ggt aga tgg gtt cca caa aga atc gac acc gtc gtc gtc576Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val180 185 190tcc gct caa cat gct gac gaa atc acg acc gag gac tta aga gcg caa624Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln195 200 205cta aag tcc gag atc att gaa aaa gtc atc cca aga gac atg ttg gac672Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp210 215 220gaa aac acc aaa tac ttt atc caa cct tcc ggt aga ttc gtc atc ggt720Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly225 230 235 240ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag atc atc gtc gac768Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp245 250 255gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc ggt aag816Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys260 265 270gac tac tct aag gtt gat cgt tct gcc gct tat gcc gct aga tgg gtt864Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val275 280 285gcc aag tcc cta gtt gcc gct ggt tta tgt aag aga gtt caa gtt caa912Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln290 295 300ttt tct tat gcc atc ggt att gcg gaa cca ttg tcc ttg cac gtt gac960Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp305 310 315 320acc tat ggt act gcg acc aag tct gac gaa gaa att atc gac att atc 1008Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile325 330 335agc aag aac ttt gac ttg aga cct ggt gta ttg gtc aag gag ttg gac 1056Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp340 345 350tta gct aga cca atc tac ttg cca acc gct tct tat ggc cat ttc aca 1104Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365aac caa gaa tac cca tgg gaa aag cct aag act ttg aag ttc taa 1149Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380<210>2<211>382<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15
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Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile325 330 335Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp340 345 350Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380<210>3<211>1149<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
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權(quán)利要求
1.一種綜合的基因改組方法，其特征在于1)易錯(cuò)PCR選取待突變/改組的線性雙鏈基因，采用易錯(cuò)PCR方法擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，所得到的產(chǎn)物用80％酒精沉淀，清洗去除反應(yīng)體系中的可溶性組分；2)StEP反應(yīng)在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、緩沖液和超純水，組成StEP反應(yīng)體系，并擴(kuò)增得到改組基因，通過瓊脂糖凝膠電泳，并對目的大小的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后進(jìn)行表達(dá)與篩選，獲得具有目的特征的改組基因。
2.一種權(quán)利要求1所述基因改組方法所獲得的重組基因，其特征在于具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列。
3.一種權(quán)利要求2所述重組基因編碼的蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No4中的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因的指導(dǎo)進(jìn)化，是一種綜合的基因改組方法，首先選取待突變/改組的線性雙鏈基因，采用易錯(cuò)PCR方法擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，所得到的產(chǎn)物用80％酒精沉淀，清洗去除反應(yīng)體系中的可溶性組分；然后在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、緩沖液和超純水，組成StEP反應(yīng)體系，并擴(kuò)增得到改組基因，通過瓊脂糖凝膠電泳，并對目的大小的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后進(jìn)行表達(dá)與篩選，獲得具有目的特征的改組基因。本發(fā)明可以有效的實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)過程中同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因的隨機(jī)突變和改組，并用合成酶基因sam1為起始基因驗(yàn)證了本發(fā)明的有效性，獲得了能促進(jìn)胞內(nèi)SAM積累量提高的重組酶。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1861789SQ20051004641
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者吳文芳, 安迎鋒, 呂安國 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所