一種基于基因測(cè)序法的hla-b27基因分型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于基因測(cè)序法的HLA-B27基因分型的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)研究HLA與疾病相關(guān)性的資料表明，某些疾病的發(fā)生率與一些特殊型別的 HLA檢出率有關(guān)，運(yùn)些病人大多是發(fā)病機(jī)理不明并伴有免疫功能異常和有遺傳傾向性的疾 病，因此，分析HLA抗原表達(dá)情況不僅有助于了解發(fā)病機(jī)理，對(duì)于疾病的診斷、預(yù)防和預(yù)后 判斷都有重要意義。
[0003] HLA-B27基因?qū)儆贗型M肥基因，基本上表達(dá)在機(jī)體中所有有核的細(xì)胞上，尤其是 淋己細(xì)胞的表面有豐富的含量。早在二十多年前，人們就已發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原的表達(dá)與強(qiáng) 直性脊柱炎有高度相關(guān)性，超過(guò)90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者其HLA-B27抗原表達(dá)為陽(yáng)性，普 通人群中僅5-10%的為陽(yáng)性，而強(qiáng)直性脊柱炎由于癥狀與許多疾病相似而難W確診，因此 HLA-B27的檢測(cè)在疾病的診斷中有著重要意義。
[0004] 強(qiáng)直性脊柱炎（A巧是一種W紙骼關(guān)節(jié)和中軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的、原因不明的 自身免疫性疾病，W侵犯脊柱為主，早期表現(xiàn)為滑膜炎和初帶附著點(diǎn)的病變，晚期由于初 帶巧化造成脊柱強(qiáng)直，目前本病的發(fā)病原因和致病機(jī)制尚未完全明確?；颊咴缙诎Y狀與腰 椎間盤突出癥、紙骼關(guān)節(jié)炎、腰背肌筋膜炎等相似，在X線片上沒(méi)有紙骼關(guān)節(jié)炎的明確表 現(xiàn)，因此在臨床診斷上容易混淆而致誤診，延誤病情早期治療，失去最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致中、 晚期不可逆癥狀出現(xiàn)，最終發(fā)生關(guān)節(jié)強(qiáng)直甚至致殘。賴建銘等通過(guò)對(duì)AS家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)， HLA-B27陽(yáng)性的幼年AS患者中69%有脊柱關(guān)節(jié)病家族史，其中90%為一級(jí)親屬，顯示AS 有明顯的家族聚集性，說(shuō)明AS的危害性很大。因此，早期診斷對(duì)控制患者病情發(fā)展、減輕崎 形、維持和改善功能，具有相當(dāng)重要的意義。應(yīng)盡可能地在肯定的放射學(xué)紙骼關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)之 前進(jìn)行診斷。在脊柱性關(guān)節(jié)病運(yùn)一類的疾病中除了強(qiáng)直性脊柱炎W外，還有許多其它的疾 病與HLA-B27抗原的表達(dá)有著或多或少的相關(guān)性，因此HLA-B27的檢測(cè)在運(yùn)些疾病的診斷 中是一個(gè)非常有價(jià)值的指標(biāo)。
[0005] 文獻(xiàn)報(bào)道指出，①HLA-B27陰性和陽(yáng)性患者男性發(fā)病率明顯高于女性，陰性與同 性別陽(yáng)性患者平均發(fā)病年齡明顯偏晚；②HLA-B27陰性患者W31~45歲為主，陽(yáng)性患者W 16~30歲為主；③HLA-B27陰性和陽(yáng)性患者首發(fā)癥狀均W中軸關(guān)節(jié)炎和外周關(guān)節(jié)炎為主。 陰性和陽(yáng)性患者主要臨床表現(xiàn)上均W出現(xiàn)下腰疼痛，髓部疼痛為主。陰性患者出現(xiàn)全身癥 狀（包括發(fā)熱、盜汗和乏力）明顯少于陽(yáng)性患者?？傊?，HLA-B27陰性患者比同性別陽(yáng)性患 者平均發(fā)病年齡明顯偏晚，部分陰性患者病情相對(duì)較輕。HLA-B27陰性和陽(yáng)性患者發(fā)病上的 差異在對(duì)HLA-B27檢測(cè)陰性的疑似患者診斷中應(yīng)得到重視。
[000引 目前可用于檢測(cè)HLA-B27的方法有流式細(xì)胞法、ELISA法、PCR-SSP法、測(cè)序法、巧 光PCR法等，但運(yùn)些方法都存在不同程度的缺點(diǎn)。流式細(xì)胞法要求標(biāo)本新鮮，不能長(zhǎng)期保 存，因此不利于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)；且該方法原理基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，而HLA-B27 的單克隆抗體會(huì)與其它HLA-B等位基因產(chǎn)物發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。ELISA法成本低，結(jié)果數(shù)據(jù)客觀，但操作復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，結(jié)果準(zhǔn)確性差，且固相載 體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此每次測(cè)定均需作標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR-SSP法需要凝膠電 泳，多用于科研無(wú)法在醫(yī)院推廣。測(cè)序法最為準(zhǔn)確，通常檢測(cè)分析周期稍長(zhǎng)，分析樣本較多 時(shí)，若無(wú)前期篩選（陽(yáng)性結(jié)果的初步篩選），其工作量較大，且往往需要重復(fù)確認(rèn)（當(dāng)擴(kuò)增不 出結(jié)果時(shí)需要仔細(xì)分析確認(rèn)擴(kuò)增條件和擴(kuò)增結(jié)果）；巧光PCR方法，采用巧光染料對(duì)擴(kuò)增的 特異片段產(chǎn)生信號(hào)，通常擴(kuò)增片段較小，無(wú)法進(jìn)一步對(duì)HLA-B27進(jìn)行分型。
[0007] 雖然上述方法在臨床HLA-B27檢測(cè)上扮演著重要角色，但卻各有其缺陷，一種操 作簡(jiǎn)便、快速、且準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法的開發(fā)將起到關(guān)鍵性臨床作用。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道利 用巧光PCR結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HLA-B27不同基因亞型的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)HLA-B27基因進(jìn)行檢測(cè)分型中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供 一種能夠快速、靈敏、特異的對(duì)HLA-B27基因進(jìn)行分型的方法。
[0009] HLA-B27 基因型種類繁多，包括：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、 B27-06、B27-07、B27-08、B27-09、B27-10、B27-11、B27-12、B27-13、B27-14、B27-15、B27-16、 B27-17、B27-18、B27-19、B27-20、B27-21、B27-24、B27-27、B27-30、B27-32、B27-33、B27-34、 B27-35、B27-36、B27-41、B27-42等。HLA-B27各亞型的分布在不同地區(qū)、種群中存在差異， 發(fā)明人通過(guò)研讀文獻(xiàn)，尤其近幾年文獻(xiàn)中所提到的中國(guó)人群中出現(xiàn)的HLA-B27基因的特定 亞型，選定中國(guó)人人群中目前常見(jiàn)的HLA-B27基因型：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、 B27-05、B27-07、B27-10、B27-15 (尤其是B27-04、B27-05基因型在中國(guó)人群中出現(xiàn)的比例 最高），進(jìn)行分析。本發(fā)明通過(guò)比對(duì)上述分型，找到其保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了針對(duì)上述HLA-B27基 因亞型的測(cè)序引物及探針，通過(guò)巧光PCR結(jié)合測(cè)序的方法實(shí)現(xiàn)了HLA-B27基因的分型。
[0010] 通過(guò)本方法可W區(qū)分8種基因亞型及35種次亞型。各種分型的特異序列如下：
[0011] 表1 8種基因亞型及35種次亞型的特異序列
[0012]

[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0015] 首先，本發(fā)明提供了一組用于HLA-B27基因型分型的引物及探針； [001引具體的，HLA-B27巧光PCR及測(cè)序用引物的序列如下：
[0017]HLA-B27F :5，-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3,（沈QIDN0:1)
[0018] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)
[0019] 巧光PCR換針的序列為：
[0020] HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3' (SEQ ID NO :3)
[002。所述HLA-B27探針的巧光發(fā)光基團(tuán)為FAM，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)-1。
[0022] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述引物既要用于巧光PCR反應(yīng)又要用于陽(yáng)性結(jié)果的測(cè) 序的亞型及次亞型分型。本發(fā)明中引物的設(shè)計(jì)除了通常引物設(shè)計(jì)所要考慮的退火溫度、 GC含量、引物特異性等方面，更要考慮兩個(gè)重要因素：（1)本發(fā)明由于采用巧光PCR法，而 巧光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常不太長(zhǎng)，否則影響擴(kuò)增效率，化qman探針為基礎(chǔ)的Real-timePCR W引物和探針序列決定反應(yīng)的特異性，而通過(guò)巧光強(qiáng)度判斷探針降解程度，從而推斷模板 量，通常擴(kuò)增產(chǎn)物越短，探針和上下游引物之間的距離越近，擴(kuò)增過(guò)程中探針5端的發(fā)光基 團(tuán)可W高效的切除下去，保證擴(kuò)增和巧光信號(hào)的增長(zhǎng)同步進(jìn)行，巧光PCR擴(kuò)增片段通常在 75-200bp;(2)本發(fā)明需要利用測(cè)序法具體分型，因此擴(kuò)增產(chǎn)物要包含所有亞型及次亞型 的特異區(qū)域，且盡量一個(gè)測(cè)序反應(yīng)即可完成，擴(kuò)增片段較短無(wú)法有效包含亞型及次亞型的 特異序列區(qū)域，也不利于測(cè)序分析。
[0023] 本發(fā)明通過(guò)比對(duì)HLA-B27各分型序列，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證后確定 本發(fā)明所列出的測(cè)序引物為最佳引物，能夠兼顧巧光PCR和常規(guī)測(cè)序擴(kuò)增PCR的需要， 其他引物對(duì)較難實(shí)現(xiàn)巧光PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確率和測(cè)序（發(fā)明人曾設(shè)計(jì)巧光PCR引物對(duì) 照組進(jìn)行過(guò)試驗(yàn)，包括對(duì)照組 1:HLA-B27-F1 :GGCTACGTGGACGACACGCTGT，HLA-B27-R1 : GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC;對(duì)照組 2 :HLA-B27-F2 :GGGTCTCACACCCTCCAGAAT， HLA-B27-R2 :CGGCGGTCCAGGAGCT，雖可W有效進(jìn)行巧光PCR反應(yīng)，但均無(wú)法覆蓋上述中國(guó)人 群中出現(xiàn)的HLA-B27基因的特定亞型及次亞型測(cè)序分析）。
[0024] 本發(fā)明引物在保證PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確率的前提下，擴(kuò)增產(chǎn)物既要使巧光PCR有效，又要 使其包含所有分型的特異區(qū)域便于測(cè)序分型，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度達(dá)6(K)bpW上，仍能有效的保 證巧光PCR的特異性和擴(kuò)增效率。
[00巧]進(jìn)一步的，為了檢測(cè)擴(kuò)增模板的有效性，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)參引物及探針，內(nèi) 參為e-Actin。具體的，P-Actin內(nèi)參引物的序列如下：
[0026]e-ActinF:5，-CACCCAGCACAATGAAGA-3,（沈QIDN0:4)
[0027] 0-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'（SEQIDN0:5)
[002引內(nèi)參探針的序列為：
[0029]e-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'(沈QIDN0:6)
[0030] 所述內(nèi)參探針的巧光發(fā)光基團(tuán)為FAM，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)-1。
[0031] 其次，本發(fā)明提供了一種用于HLA-B27基因分型的試劑盒，包括內(nèi)參體系反應(yīng)液 A、檢測(cè)體系反應(yīng)液B、酶解試劑、測(cè)序引物、測(cè)序試劑、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，
[003引內(nèi)參體系反應(yīng)液A包括：PCR緩沖液、Mg2\ dNTPs、擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物及探針，巧 光PCR反應(yīng)酶系；
[0033] 檢測(cè)體系反應(yīng)液B包括：PCR緩沖液、Mg2\dNTPs、引物及探針，巧光PCR反應(yīng)酶系， 檢測(cè)體系反應(yīng)液B中的引物序列如下：
[0034]HLA-B27F:5，-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3,（沈QIDN0:1)
[0035] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)
[003引探針的序列為：
[0037]HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3' (SEQ IDNO:3)
[003引所述HLA-B27探針的巧光發(fā)光基團(tuán)為FAM，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)-1;
[0039]測(cè)序引物為HLA-B27F :5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'（沈QIDN0:1)
[0040] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)。
[0041] 優(yōu)選的，內(nèi)參體系反應(yīng)液A包括：10XPCR緩沖液、MgCl22.0~5.0mM、dNTPs0.5~ I. 5mM、引物 0. 2 ~2.OyM、探針 0.I~I. 0yM、Taq酶 2. 0 ~4. 0U、UNG酶 0. 5 ~I.OU，所 述引物為P-ActinF:5' -CACCCAGCACAATGAAGA-3'，0 -ActinR:5' -AAGGTGGACAGCGAGGC-3'， 探針的序列為：e-ActinP:5' -CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探針的巧光發(fā)光基團(tuán)為 FAM，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)-1。
[004引其中所述酶解試劑優(yōu)選為10XCIAP緩沖液、CIAP酶、ExoI酶和水，體積比為 10:1:2:12。
[0043] 其中所述測(cè)序試劑為測(cè)序Buffer和Bi曲ye，體積比為1:1。
[0044] 優(yōu)選，陰性對(duì)照為水；陽(yáng)性對(duì)照為含有HLA-B27基因的人類基因組DNA溶液。
[0045] 此外，本發(fā)明還提供了基于上述檢測(cè)引物和/試劑盒的進(jìn)行HLA-B27等位基因檢 測(cè)