和/分型的方法。
[0046] 本發(fā)明的方法如下：首先使用化elex-100煮沸法或DNA提取試劑盒提取基因組 DNA作為模板，分別使用反應(yīng)液A和反應(yīng)液B進(jìn)行巧光PCR擴(kuò)增，對(duì)于反應(yīng)液A有效擴(kuò)增的 模板進(jìn)行下一步操作。A管有效擴(kuò)增，B管無效擴(kuò)增的樣本視為陰性；反之視為陽性。將陽 性樣本反應(yīng)液B擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶解，取酶解產(chǎn)物做測(cè)序反應(yīng)，采用醋酸鋼/乙醇法純化PCR 產(chǎn)物，然后在PCR儀上進(jìn)行熱變性，冰上快速降溫后，進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)被檢測(cè)者HLA-B27陽性，然后根據(jù)上述提供的特異序列，得出其基因亞 型甚至次亞型。
[0047] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0048] 1)本發(fā)明所選擇的8種基因亞型是近幾年文獻(xiàn)中所提到的中國人群中出現(xiàn)的 HLA-B27基因的特定亞型，亞洲人與B2705、B2704、B2706、B2707相關(guān)，尤其是B27-04、 B27-05分型在中國人群中出現(xiàn)的比例最高，更切合于中國人群分析，涵蓋范圍更準(zhǔn)確，且通 過測(cè)序法進(jìn)行更進(jìn)一步的次亞型分析，使信息更精確，對(duì)于中國人群HLA-B27各亞型的地 區(qū)分布、種族差異分析及后期的個(gè)性化治療都可W提供重要的數(shù)據(jù)支持。
[0049] 2)本發(fā)明在保證PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確率的前提下，擴(kuò)增產(chǎn)物既要使巧光PCR有效，又要使 其包含所有分型的特異區(qū)域便于測(cè)序分型，擴(kuò)增片段長度達(dá)6(K)bpW上，仍能有效的保證 巧光PCR的特異性和擴(kuò)增效率。
[0050] 3)本發(fā)明采用巧光PCR結(jié)合測(cè)序方法來進(jìn)行HLA-B27基因亞型及次亞型的分型， 首先采用巧光PCR法檢測(cè)樣本，可W根據(jù)擴(kuò)增曲線的有無判讀樣本的陰陽性，如果樣本為 陰性，可W直接判讀結(jié)果，無需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免繼續(xù)測(cè)序?qū)е碌睦速M(fèi)，從而節(jié)省時(shí)間和 試劑；如果樣本為陽性，則繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，通過測(cè)序法分析被測(cè)樣本的具體分型，得出比單純巧 光PCR更詳細(xì)的信息，利于臨床治療。因此，巧光PCR+測(cè)序的組合檢測(cè)方法既節(jié)省了人力 物力，又可W更精確的得知被檢測(cè)樣本信息，是非常有效的檢測(cè)手段。
[0051] 4)操作簡單：對(duì)于巧光PCR結(jié)果，可直接判斷被檢測(cè)樣本陰陽性，簡單快速，避免 后續(xù)陰性樣本的無效操作；可具體分型：對(duì)于巧光PCR陽性患者，使用測(cè)序技術(shù)可進(jìn)行具體 分型，給治療提供依據(jù)；準(zhǔn)確性高：使用巧光PCR技術(shù)，靈敏性強(qiáng)，且陽性患者會(huì)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，并得出具體分型，不會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性，特異性高，判斷準(zhǔn)確；過程可監(jiān)控：本發(fā)明 有內(nèi)參參與整個(gè)過程，保證在DNA模板有效提取的前提下繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)，避免實(shí)驗(yàn)試劑和 時(shí)間的浪費(fèi)及假陰性的誤判。陰陽性對(duì)照的參與確保反應(yīng)液的有效性。
[005引f5)整個(gè)操作過程可W在12-14h完成，結(jié)果快速，通量較高；無電泳過程，利于臨床 的推廣及普及。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋 本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0054] 實(shí)施例1
[00巧]檢測(cè)10例強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血樣品中HLA-B27基因陰陽性及其具體分型。
[0056] 本發(fā)明提供一種基于基因測(cè)序法的HLA-B27基因分型的方法，所述方法主要包括 W下步驟：
[0057] (1)模板DNA提取
[0058] 取200yL全血或直徑為3mm的干血斑，使用化elex-100煮沸法或者DNA提取試 劑盒提取模板DNA。
[0059] (2)PCR擴(kuò)增
[0060] 分裝23yL反應(yīng)液A于PCR反應(yīng)管內(nèi)，分裝管數(shù)=n+2 (注：n為待測(cè)樣本數(shù)，2為 用于陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的管數(shù)）；分別加入2yL待測(cè)DNA模板、陰性、陽性對(duì)照，混勻后 置于巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)?0°C2min;95°C3min;95°C15s， 60°C45s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在60°C采集巧光。
[0061] 分裝23yL反應(yīng)液B于PCR反應(yīng)管，分裝管數(shù)=n+2 (注：n為待測(cè)樣本數(shù)，2為用 于陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的管數(shù)，A、B管樣本順序一致）；分別加入2yL待測(cè)DNA，巧光定量 ?〔尺儀上進(jìn)行？〇?擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)?01：2111111;951：3111111;95°(：153,601：453,40個(gè)循 環(huán)，每個(gè)循環(huán)在60°C采集巧光。
[00的]做質(zhì)量控制
[0063] ①反應(yīng)液A陰性對(duì)照無S型擴(kuò)增曲線或CT值>38,且陽性對(duì)照有S型擴(kuò)增曲線且 CT值<35視為PCR有效，否則整體無效。
[0064] ②在A管PCR有效前提下，查看每個(gè)待測(cè)樣本，若有S型擴(kuò)增曲線且CT值小于35， 則模板提取有效，否則重新提取模板進(jìn)行檢測(cè)。
[0065] ③反應(yīng)液B陰性對(duì)照無S型擴(kuò)增曲線或CT值>38,且陽性對(duì)照有S型擴(kuò)增曲線且 CT值<35視為PCR有效，否則整體無效。
[0066] ④在B管PCR有效前提下，查看模板提取有效樣本的B管PCR結(jié)果，若樣本無S型 擴(kuò)增曲線或CT值>38,則視為HLA-B27陰性樣本；若有S型擴(kuò)增曲線且CT值小于35,視為 HLA-B27陽性，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，W檢測(cè)具體分型。
[0067] (4)酶解
[0068] 分裝2. 5yL酶解試劑于PCR反應(yīng)管；分別加入5yL反應(yīng)液B擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，混 勻后置于普通PCR儀進(jìn)行酶解；反應(yīng)程序?yàn)?7°C60min;80°C15min。
[006引 （4)測(cè)序反應(yīng)
[0070] 分裝IiiL測(cè)序試劑和2iiL測(cè)序引物HLA-B27F(濃度為3. 2iiM)于PCR反應(yīng)管； 分別加入3yL上述酶解產(chǎn)物，混勻后置于普通PCR儀進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)?6°CImin; 96°C10s，50°C5s，60°C4min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后若不立即進(jìn)行下一步則置于4°C冰箱。
[0071] (5)純化與測(cè)序
[0072] 采用醋酸鋼/乙醇法純化測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物，按照ABI 3130測(cè)序儀使用說明進(jìn)行測(cè) 序。
[0073] (6)數(shù)據(jù)收集處理和分析
[0074] 將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，首先確認(rèn)HLA-B27是否為陽性，然后 根據(jù)本方法給出的特異序列，對(duì)陽性樣本具體分析亞型及次亞型。
[007引 （7)結(jié)果
[0076]
[0077] 做與PCR-SSP法對(duì)比
[0078] 將該10例樣本用PCR-SSP法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果如下：
[0079]
[0080] 可W看出，基因測(cè)序法除去可W具體分型的優(yōu)勢(shì)外，比PCR-SSP法靈敏性更強(qiáng)，準(zhǔn) 確性更強(qiáng)，且無需電泳，非常適合臨床推廣及使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于HLA-B27基因型分型檢測(cè)的引物及探針，其特征在于，HLA-B27熒光PCR及測(cè)序 用引物的序列為： HLA-B27F:5, -ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3' HLA-B27R:5' -GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3' HLA-B27探針的序列為： HLA-B27P:5' -GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3' 所述HLA-B27探針的熒光發(fā)光基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ-1。2. -種基于基因測(cè)序法的HLA-B27基因分型的試劑盒，其特征在于，包括內(nèi)參體系反 應(yīng)液A、檢測(cè)體系反應(yīng)液B、酶解試劑、測(cè)序引物、測(cè)序試劑、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照， 內(nèi)參體系反應(yīng)液A包括：PCR緩沖液、Mg2+、dNTPs、擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物及探針，熒光PCR反應(yīng)酶系； 檢測(cè)體系反應(yīng)液B包括：PCR緩沖液、Mg'dNTPs、引物及探針為權(quán)利要求1所述引物及 探針，熒光PCR反應(yīng)酶系； 測(cè)序引物為權(quán)利要求1所述引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于， 內(nèi)參體系反應(yīng)液A包括：10XPCR緩沖液、MgCl22. 0~5.OmM、dNTPsO. 5~1. 5mM、弓丨 物0· 2~2. 0μΜ、探針0· 1~1. 0yM、Taq酶2. 0~4. 0U、UNG酶0· 5~1. 0U，所述擴(kuò)增內(nèi) 參基因的引物為β_ActinF:5' -CACCCAGCACAATGAAGA-3'，β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAG GC-3'，探針的序列為：β-ActinP:5' -CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探針的熒光發(fā)光 基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ-1。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述酶解試劑為10XCIAP緩沖液、CIAP 酶、ΕχοΙ酶和水，體積比為10:1:2:12。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，測(cè)序試劑為測(cè)序Buffer和BigDye，體積 比為1:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，陰性對(duì)照為水；陽性對(duì)照為含有HLA-B27 基因的人類基因組DNA溶液。7. 權(quán)利要求1所述引物及探針、或權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的試劑盒在進(jìn)行HLA-B27 等位基因檢測(cè)和/分型中的應(yīng)用。8. -種利用權(quán)利要求2所述試劑盒進(jìn)行HLA-B27基因型檢測(cè)和/分型的方法，其特征 在于，包括如下步驟： (1) 提取基因組DNA作為模板； (2) 分別使用反應(yīng)液A和反應(yīng)液B進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，對(duì)于反應(yīng)液A有效擴(kuò)增的模板進(jìn) 行下一步操作，A管有效擴(kuò)增，B管無效擴(kuò)增的樣本視為陰性；反之視為陽性； (3) 將陽性樣本反應(yīng)液B擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶解，取酶解產(chǎn)物做測(cè)序反應(yīng)，采用醋酸鈉/乙 醇法純化PCR產(chǎn)物，然后在PCR儀上進(jìn)行熱變性，冰上快速降溫后，進(jìn)行測(cè)序； (4) 將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)被檢測(cè)者HLA-B27陽性，然后根據(jù) HLA-B27各亞型的特異序列，得出其基因亞型甚至次亞型。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所檢測(cè)和/分型的HLA-B27基因型為 B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、B27-07、B27-10、B27-15。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所檢測(cè)和/分型的HLA-B27基因型為B27-01、B27-02-01、B27-02-02、B27-03、B27-04-01/04、B27-04-02、B27-04-03、B27-04-05、 B27-05-03、B27-05-05、B27-05-06、B27-05-07、B27-05-08、B27-05-09、B27-05-10、 B27-05-11、B27-05-12、B27-05-13、B27-05-14、B27-05-15、B27-05-16、B27-05-17、 B27-05-18、B27-05-19、B27-05-20、B27-05-21、B27-05-22、B27-05-23、B27-05-24、 B27-05-25、B27-05-26、B27-05-27、B27-05-28、B27-05-29、B27-05-30、B27-07-03、 B27-07-04、B27-10、B27-15。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于基因測(cè)序法的HLA-B27基因分型的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過比對(duì)HLA-B27基因的B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、B27-07、B27-10、B27-15亞型，找到其保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了針對(duì)上述HLA-B27基因亞型的測(cè)序引物及探針，通過熒光PCR結(jié)合測(cè)序的方法實(shí)現(xiàn)了HLA-B27基因的分型。本發(fā)明所述方法操作簡單、可具體分型、準(zhǔn)確性高、過程可監(jiān)控、結(jié)果快速，通量較高，而且無電泳過程，利于臨床的推廣及普及。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105296481
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510868927
【發(fā)明人】馮振, 景葉松, 弭兆元
【申請(qǐng)人】濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日