專利名稱：一種改進(jìn)的重疊延伸pcr方法及其所獲得的突變基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因定點(diǎn)突變的方法，具體的說是一種改進(jìn)的重疊延伸PCR方法及其所獲得的突變基因，是一種能在一個(gè)反應(yīng)過程中實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)定位突變的基因改造方法。
背景技術(shù)：
定點(diǎn)突變(site-directed mutagenesis，SDM)就是指在基因的特定位點(diǎn)引入突變，即在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定長(zhǎng)度的核苷酸序列。該方法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)與功能及蛋白質(zhì)性質(zhì)等方面的研究。
產(chǎn)生SDM的方法最常見是采用Overlap extension PCR(OE-PCR)介導(dǎo)定點(diǎn)突變，又稱重疊延伸PCR。該技術(shù)是將兩個(gè)或多個(gè)基因片段通過末端互補(bǔ)、重疊延伸的方法進(jìn)行體外基因拼接的簡(jiǎn)單、快速的基因重組技術(shù)(Russell，Higuchi.protocolsA guide to methods and applications[A].Recombinant PCR[M].Academic Press，1990.177-183.)。該方法要求兩條側(cè)翼的通用引物和兩個(gè)反向部分重疊的突變引物。首先引物兩兩配對(duì)分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生兩個(gè)部分重疊的PCR片段，兩者的重疊區(qū)都通過引物的錯(cuò)配引入相同的突變。序列的重疊允許兩個(gè)片段在混合、變性、復(fù)性后在DNA聚合酶作用下延伸產(chǎn)生全長(zhǎng)的DNA片段；該片段可作為第二次延伸的模板，以兩個(gè)側(cè)翼引物進(jìn)行全長(zhǎng)DNA擴(kuò)增。1987年，該技術(shù)問世一年后，Mullis KB等人便首先運(yùn)用引物的錯(cuò)配引導(dǎo)(mis-priming)，通過對(duì)基因進(jìn)行體外定點(diǎn)突變，成功地將突變序列引入產(chǎn)物末端(Mullis KB，F(xiàn)aloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol.1987；155335-50.)；1988年，Higuchi R等在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用重疊延伸方法將突變序列引入產(chǎn)物中的中間部位(Higuchi R，Krummel B，Saiki RK.A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis ofDNA fragmentsstudy of protein and DNA interactions.Nucleic Acids Res.1988Aug 11；16(15)7351-67.)；此后Ho和Horton嘗試用重疊延伸方法進(jìn)行基因重組和嵌合基因的構(gòu)建并獲成功(Ho SN，Hunt HD，Horton RM，Pullen JK，Pease LR.Site-directed mutagenesis by overlap extension using thepolymerase chain reaction.Gene.1989 Apr 15；77(1)51-9.；Horton RM，HuntHD，Ho SN，Pullen JK，Pease LR.Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymesgene splicing by overlap extension.Gene.1989 Apr15；77(1)61-8.)。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)天然酶蛋白的催化性質(zhì)、底物特異性和熱穩(wěn)定性等進(jìn)行改造已經(jīng)有很多成功的例子(Ma YF，Evans DE，Logue SJ，Langridge P.Mutations of barley beta-amylase that improve substrate-bindingaffinity and thermostability.Mol Genet Genomics.2001 Nov；266(3)345-52.；Huang CY，Chang AK，Nixon PF，Duggleby RG.Site-directed mutagenesis ofthe ionizable groups in the active site of Zymomonas mobilis pyruvatedecarboxylaseeffect on activity and pH dependence.Eur J Biochem.2001Jun；268(12)3558-65.；Wang SX，Dunphy WG.Activation of Xenopus Chk1by mutagenesis of threonine-377.FEBS Lett.2000 Dec 29；487(2)277-81.)。
盡管OE-PCR作為一種常見的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是一般情況下，每次只能引入一處突變，而當(dāng)多個(gè)位點(diǎn)需要突變時(shí)，將需要煩瑣的試驗(yàn)步驟和很大工作量，同時(shí)也增加了引入一些不必要點(diǎn)突變的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速高效的實(shí)現(xiàn)基因多點(diǎn)突變的-改進(jìn)的重疊延伸PCR方法(modified overlap extension by PCR，MOE-PCR)；本發(fā)明是一種快速、簡(jiǎn)單、無錯(cuò)的多點(diǎn)突變方法，應(yīng)用本發(fā)明既可以實(shí)現(xiàn)在一輪反應(yīng)過程中對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，又沒有引入其它突變位點(diǎn)，從而為DNA進(jìn)行多點(diǎn)突變提供了新的選擇；應(yīng)用本發(fā)明，僅經(jīng)過一輪反應(yīng)就成功的實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)sam1 8個(gè)稀有密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種改進(jìn)的重疊延伸PCR方法，反應(yīng)過程分為以下幾個(gè)步驟(1)片段合成以所需突變的全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，根?jù)突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)設(shè)計(jì)一系列平行引物，引物中包含待突變的堿基，每相鄰一對(duì)引物的末端設(shè)計(jì)一個(gè)重疊區(qū)段，長(zhǎng)度為20-30bp；采用上述每相鄰的一對(duì)引物分別進(jìn)行平行的PCR，實(shí)現(xiàn)各個(gè)DNA小片段的擴(kuò)增；(2)雙混合分別純化上述片段，分成不同組分，將等量相鄰的每個(gè)組分的DNA片段分別兩兩混合，片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成長(zhǎng)片段，反應(yīng)為無引物PCR過程；(3)預(yù)延伸將上述多組反應(yīng)后產(chǎn)物混合在一起，新形成的長(zhǎng)片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成全長(zhǎng)新模板，該步驟也是無引物PCR過程；(4)全長(zhǎng)DNA合成在上述反應(yīng)體系中加入全長(zhǎng)基因的一對(duì)外側(cè)引物，以上一步產(chǎn)生的重組全長(zhǎng)DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)基因；(5)后延伸將上述反應(yīng)體系再經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的94℃變性30s，72℃退火和延伸1min；(6)將突變基因連入載體并轉(zhuǎn)入宿主菌株，進(jìn)行序列分析。
以釀酒酵母總DNA為模板，擴(kuò)增帶有EcoRI和NotI的sam1基因，該基因具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列。將該基因作為起始基因，進(jìn)行如下步驟的反應(yīng)(如圖1)(1)片段合成以釀酒酵母SAM合成酶基因sam1(如圖2)作為模板，設(shè)計(jì)6對(duì)平行引物，引物中包含待突變的堿基，每相鄰一對(duì)引物的末端設(shè)計(jì)一個(gè)重疊區(qū)段，長(zhǎng)度為20-30bp；采用上述每相鄰的一對(duì)引物分別進(jìn)行平行的PCR，實(shí)現(xiàn)6個(gè)DNA小片段的擴(kuò)增；(2)雙混合純化后的上述片段被分成5個(gè)組分，在每個(gè)組分中，等量的相鄰的DNA片段兩兩混合(每一個(gè)片段約10ng)。片段1和2混合后命名為組分1，以下依次命名為組分2-5，片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成長(zhǎng)片段，反應(yīng)為無引物PCR過程；(3)預(yù)延伸隨后，將5個(gè)組分混合在一起，新形成的長(zhǎng)片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成全長(zhǎng)新模板，該步驟也是無引物PCR過程；(4)全長(zhǎng)DNA合成在反應(yīng)體系中加入全長(zhǎng)基因的一對(duì)外側(cè)引物，以上一步產(chǎn)生的重組全長(zhǎng)DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因；(5)后延伸經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的94℃變性30s，72℃退火和延伸1min；(6)將突變基因連入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入釀酒酵母，進(jìn)行序列分析；并且進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)量和SAM的胞內(nèi)積累量。所獲得的突變基因具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列；該核酸序列來源于初始基因，與初始基因相比具有8個(gè)點(diǎn)突變G126T，G138T，G462T，G483T，G603T，G621T，G936T和G975T。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明通過獨(dú)特的反應(yīng)過程提供了一個(gè)新的基因定點(diǎn)突變方法，該方法通過簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)現(xiàn)在一輪循環(huán)中對(duì)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變；并且整個(gè)反應(yīng)過程具有良好的保真性，不引入其它點(diǎn)突變。
2.在本發(fā)明中，申請(qǐng)人運(yùn)用該方法對(duì)來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1為起始基因進(jìn)行了8個(gè)稀有密碼子的改造，驗(yàn)證了該方法的有效性，并獲得了一種突變基因，核酸序列與原有基因序列相比具有8點(diǎn)突變G126T，G138T，G462T，G483T，G603T，G621T，G936T和G975T，將原有的稀有密碼子變換成常見密碼子；該基因編碼的SAM合成酶可以在釀酒酵母中高效表達(dá)，并且能提高胞內(nèi)SAM的積累量；引用本發(fā)明，可進(jìn)一步提供直接用于生產(chǎn)高表達(dá)SAM合成酶的工程菌株。
總之，本發(fā)明首次將DNA shuffling技術(shù)的原理與定點(diǎn)突變相結(jié)合，提出并實(shí)踐了一種新的定點(diǎn)突變方法。


圖1用MOE-PCR對(duì)sam1進(jìn)行多點(diǎn)突變的示意圖，反應(yīng)步驟包括(1)片段合成用高保真的Pfu DNA聚合酶合成6條DNA片段，每相鄰兩條片段之間具有一個(gè)重疊區(qū)，長(zhǎng)度為20-30bp，引物中包含有待突變的堿基，6條片段通過重疊連接在一起可以組成全長(zhǎng)的DNA，白色空格位置代表待突變的位點(diǎn)；(2)雙混合將相鄰的DNA片段兩兩混合，組成5個(gè)平行的組分，分別進(jìn)行無引物的重疊延伸PCR(OE-PCR)；(3)預(yù)延伸將上述5個(gè)平行的組分混合在一個(gè)反應(yīng)體系中，再通過無引物的重疊延伸PCR獲得全長(zhǎng)的重聚DNA模板；(4)全長(zhǎng)DNA合成在反應(yīng)體系中加入一對(duì)相對(duì)于全長(zhǎng)DNA末端的引物，以上一步反應(yīng)產(chǎn)生的DNA為模板擴(kuò)增出全長(zhǎng)的經(jīng)過突變的目的基因；(5)后延伸經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的94℃變性，72℃退火和延伸。
圖2為SAM合成酶基因sam1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，其中，LaneMDNA Marker DL2000；Lane1PCR目的條帶；圖3用MOE-PCR方法對(duì)sam1的8個(gè)稀有密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變的瓊脂糖凝膠電泳圖(膠濃度1％)，其中，Lane MDNA size marker DL2000；Lane1-6用PCR方法合成的片段1-6；Lane7MOE-PCR的最終結(jié)果。
圖4重組質(zhì)粒pYES-sam1”酶切和PCR驗(yàn)證圖譜，其中，LaneM1Marker DL2000；Lane1PCR驗(yàn)證結(jié)果；Lane2空白質(zhì)粒pYES2經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切；Lane3重組質(zhì)粒pYES-sam1”經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切；LaneM2MarkerλDNA\HindIII。
圖5表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析，其中，M為中分子量蛋白質(zhì)Marker；Lane1-3分別代表包含有不同質(zhì)粒的釀酒酵母的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白Lane1包含有pYES2；Lane2包含有pYES-sam1；Lane3包含有pYES-sam1”。
圖6HPLC檢測(cè)腺苷蛋氨酸的胞內(nèi)積累量，其中，a，b，c分別代表包含有不同質(zhì)粒的釀酒酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和抽提后的產(chǎn)物a包含有pYES2，b包含有pYES2+sam1，c包含有pYES2+sam1”；d為腺苷蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種來源于釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1，具有序列表SEQ ID No1中的堿基序列。
SEQ ID No1ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGATAAGATCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGGACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATGGTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAGAGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGTTTCGACTATAAGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGATATCGCCCAAGGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCGGTGACCAAGGTATCATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTGACTATTCTTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCTTTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGATGACCACGGTAGATGGGTTCCACAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTCAACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAGATCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTTTATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTTTGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTATGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAGTTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCAC
GTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTATCAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAGCTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAATACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度1149堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1(2)來源于釀酒酵母INVScI菌株的編碼SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1的制備上游引物15-ATTGGATCCCAACGATGGCACTAGACATA-3；下游引物25-GCAGAATTCGAGGTTGAAGGCAGAAAA-3；下劃線序列分別為BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。
擴(kuò)增條件以釀酒酵母INVScI菌株總DNA為模板，用pfu DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmolL-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，總反應(yīng)體積100μl；反應(yīng)條件94℃變性2min；30個(gè)循環(huán)的94℃30s，53℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物回收按上海華舜試劑盒使用說明書。目的產(chǎn)物見瓊脂糖凝膠電泳(如圖2)。將目的基因經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后克隆入pYES2載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pYES2-sam1重組質(zhì)粒。
實(shí)施例2采用新的綜合的基因改組方法對(duì)sam1進(jìn)行改組，獲得編碼酶活性提高的重組酶的基因sam1，具有序列表SEQ ID No3的堿基序列。
ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGATAAGCTCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGGACCCTCACTCCAAAGTTGCTTGTGAAACCGCTGCAAAGACTGGTATGATTATGGTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAGAGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGATTCGACTATAAGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGACATCGCCCAAGGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCAGTGACCAAGGTATCATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTAACTATTCTTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCTAGAAGAGATGGCTCTTTAGCTTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGATGACCACGGTAGATGGGTTCCGCAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTC
AACATGCTGACGAAATCACTACCGAGGACTTAAGAGCTCAACTAAAGTCCGAGTTCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTTTATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTTTGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTATGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAGTTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCTGAACCATTGTCCTTGCACGTTGACACCTATGGTACTGCTACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTATCAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTATCTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAATACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA(1)SEQ ID No3的信息(參見序列表)(A)序列特征*長(zhǎng)度1149堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(2)采用MOE-PCR對(duì)sam1進(jìn)行多點(diǎn)突變。
(1)片段合成采用6個(gè)平行的PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)6條相鄰DNA片段的擴(kuò)增(如圖3)，每相鄰兩個(gè)PCR之間具有一個(gè)重疊區(qū)，長(zhǎng)度一般20-30bp。DNA反應(yīng)體系如下dNTP 0.2mM，10×pfu buffer(with MgCl2)10μl，pfuDNA聚合酶5U，模板(總DNA)100ng，引物(見表1)各1mM，加ddH2O至反應(yīng)總體積為100μl。對(duì)于片段1進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性2min；30個(gè)循環(huán)的94℃30s，59.6℃30s，72℃55s；72℃延伸10min。

表1用MOE-PCR進(jìn)行sam1稀有密碼子改造所用的各突變引物已經(jīng)突變的堿基用陰影標(biāo)示；方框內(nèi)所示為BamHI和EcoRI限制性識(shí)別序列其它各片段的反應(yīng)條件與片段1相似，除了退火溫度和延伸時(shí)間不同。片段2-6的退火溫度分別為62.5℃，58.8℃，59.5℃，55.1℃和53.3℃；而片段2-6的延伸時(shí)間分別為1min 25s，55s，1min 20s，50s和55s。擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，然后以膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。
(2)雙混合純化后的上述片段被分成5個(gè)組分，在每個(gè)組分中，等量的相鄰的DNA片段兩兩混合(每一個(gè)片段約10ng)。片段1和2混合后命名為組分1，以下依次命名為組分2-5，片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成長(zhǎng)片段，反應(yīng)為無引物PCR過程。每組中反應(yīng)體系如下dNTP 0.2mM，10×pfu buffer(with MgCl2)2μl，pfu DNA聚合酶1U，相鄰兩條片段各10ng，加ddH2O至反應(yīng)總體積為20μl。對(duì)于組分1(即片段1&2混合)進(jìn)行無引物PCR，其反應(yīng)程序如下94℃變性2min；30個(gè)循環(huán)的94℃20s，59.6℃30s，72℃ 1min 25s；72℃延伸10min。其它組分的反應(yīng)條件與組分1相似，除了退火溫度和延伸時(shí)間不同。組分2-5的退火溫度分別為58.8℃、58.8℃、55.1℃和53.3℃；組分2-5的延伸時(shí)間分別為1min 25s、1min 20s、1min 20s、55s；(3)預(yù)延伸隨后，將5個(gè)組分混合在一起，新形成的長(zhǎng)片段之間(新形成的長(zhǎng)片段之間互為模板)經(jīng)過20個(gè)循環(huán)的94℃20s變性和72℃30s退火、延伸，形成部分全長(zhǎng)新模板，該步驟也是無引物PCR過程；(4)全長(zhǎng)DNA合成在反應(yīng)體系中加入40pmol的兩種外測(cè)引物F0和R0，以上一步產(chǎn)生的重組全長(zhǎng)DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。PCR反應(yīng)程序如下94℃變性20s；30個(gè)循環(huán)的94℃20s，53.3℃30s，72℃2min；72℃延伸10min；(5)后延伸經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的94℃變性30s，72℃退火和延伸1min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的大小的條帶，用膠回收試劑盒進(jìn)行純化；(6)將突變基因經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后克隆入同樣經(jīng)雙酶切的pYES2載體上，構(gòu)建pYES2+sam1”重組質(zhì)粒(如圖4)，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScI菌株。挑取基因工程菌單菌落接種到15ml修改的SC-U培養(yǎng)基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，賴氨酸，絡(luò)氨酸，蘇氨酸；0.05g的天冬氨酸，組氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸和纈氨酸；終體積1L)，包括2％棉籽糖。30℃培養(yǎng)至OD600＝0.4，然后4℃下1500×g離心5min，然后將細(xì)胞重懸于2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(修改的SC-U培養(yǎng)基，包含2％的半乳糖)，再接種到50ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，30℃條件下150r min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)6h。然后4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，將沉淀重懸于500μl的純凈水。4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，細(xì)胞用于檢測(cè)SAM積累。每1g菌體中加入5ml 1.5molL-1的高氯酸以120r min-1搖動(dòng)1h進(jìn)行抽提，生成的SAM水平用BioCAD700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)選用弱陽離子交換柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流動(dòng)相為0.5mol L-1的HCOONH4，pH調(diào)整為4.0，流速為5ml min-1，在260nm波長(zhǎng)下檢測(cè)產(chǎn)物，室溫22℃。作為對(duì)照，含有pYES2質(zhì)粒和pYES2+sam1質(zhì)粒的釀酒酵母也被用于檢測(cè)SAM的胞內(nèi)積累量。10μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品SAM被用于標(biāo)定SAM的保留時(shí)間。
取1ml發(fā)酵液離心，菌體沉淀用1ml蒸餾水洗滌，離心后重懸于1倍的上樣緩沖液中，沸水浴煮10min，12000×g離心2min。取10μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，0.1％考馬斯亮藍(lán)染色，然后檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
結(jié)果1.測(cè)序結(jié)果表明，突變基因序列，即8個(gè)點(diǎn)突變與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，沒有其它突變位點(diǎn)引入；2.運(yùn)用本發(fā)明所述的基因定點(diǎn)突變方法，經(jīng)過一輪反應(yīng)即獲得目的大小的突變DNA(如圖3)；3.在工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳中有一條明顯的表達(dá)帶，誘導(dǎo)蛋白如圖5所示。分子量約為4.2K dalton；4.通過HPLC檢測(cè)，得到一株腺苷蛋氨酸胞內(nèi)積累量提高的釀酒酵母菌株，胞內(nèi)SAM積累量較對(duì)照提高了25.6％(如圖6)。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>一種改進(jìn)的重疊延伸PCR方法及其所獲得的突變基因<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1149<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1149)<223>
<400>1atg gcc ggt aca ttt tta ttc act tct gaa tcc gtt ggt gaa ggt cac48Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15cca gat aag atc tgt gac caa gtt tcc gac gcc atc ttg gac gct tgt96Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys20 25 30tta gcc gag gac cct cac tcc aaa gtt gcg tgt gaa acc gcg gca aag144Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys35 40 45act ggt atg att atg gtc ttt ggt gaa att act acc aag gca cag ttg192Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu50 55 60gat tac caa aaa atc gtc aga gac acc atc aag aag att ggt tac gat240Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp65 70 75 80gat tcc gcc aag ggt ttc gac tat aag acc tgt aac gtc ctt gtc gcc288Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala85 90 95att gag caa caa tct cca gat atc gcc caa ggt gtc cac gag gag aag336Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys100 105 110gat ttg gaa gac atc ggt gcc ggt gac caa ggt atc atg ttt ggt tac384Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr115 120 125gcc aca gat gaa act cca gag ggt ttg cct ttg act att ctt ttg gct432
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala130 135 140cat aaa cta aac atg gcc atg gct gac gcg aga aga gat ggc tct tta480His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu145 150 155 160gcg tgg ttg aga cca gac acc aag act caa gtc acc gtc gaa tac aag528Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys165 170 175gat gac cac ggt aga tgg gtt cca caa aga atc gac acc gtc gtc gtc576Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val180 185 190tcc gct caa cat gct gac gaa atc acg acc gag gac tta aga gcg caa624Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln195 200 205cta aag tcc gag atc att gaa aaa gtc atc cca aga gac atg ttg gac672Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp210 215 220gaa aac acc aaa tac ttt atc caa cct tcc ggt aga ttc gtc atc ggt720Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly225 230 235 240ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag atc atc gtc gac768Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp245 250 255gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc ggt aag816Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys260 265 270gac tac tct aag gtt gat cgt tct gcc gct tat gcc gct aga tgg gtt864Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val275 280 285gcc aag tcc cta gtt gcc gct ggt tta tgt aag aga gtt caa gtt caa912Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln290 295 300ttt tct tat gcc atc ggt att gcg gaa cca ttg tcc ttg cac gtt gac960Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp305 310 315 320acc tat ggt act gcg acc aag tct gac gaa gaa att atc gac att atc1008Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile325 330 335agc aag aac ttt gac ttg aga cct ggt gta ttg gtc aag gag ttg gac1056Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp340 345 350tta gct aga cca atc tac ttg cca acc gct tct tat ggc cat ttc aca1104Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365aac caa gaa tac cca tgg gaa aag cct aag act ttg aag ttc taa1149Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380<210>2<211>382<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15
Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys20 25 30Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys35 40 45Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu50 55 60Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp65 70 75 80Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala85 90 95Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys100 105 110Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr115 120 125Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala130 135 140His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu145 150 155 160Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys165 170 175Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val180 185 190Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln195 200 205Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp210 215 220Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly225 230 235 240Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp245 250 255Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys260 265 270Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val275 280 285Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln290 295 300Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Tle Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp305 310 315 320
Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile325 330 335Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp340 345 350Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380<210>3<211>1149<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1149)<223>
<400>3atg gcc ggt aca ttt tta ttc act tct gaa tcc gtt ggt gaa ggt cac48Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15cca gat aag ctc tgt gac caa gtt tcc gac gcc atc ttg gac gct tgt96Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys20 25 30tta gcc gag gac cct cac tcc aaa gtt gct tgt gaa acc gct gca aag144Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys35 40 45act ggt atg att atg gtc ttt ggt gaa att act acc aag gca cag ttg192Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu50 55 60gat tac caa aaa atc gtc aga gac acc atc aag aag att ggt tac gat240Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp65 70 75 80gat tcc gcc aag gga ttc gac tat aag acc tgt aac gtc ctt gtc gcc288Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala85 90 95att gag caa caa tct cca gac atc gcc caa ggt gtc cac gag gag aag336Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys100 105 110gat ttg gaa gac atc ggt gcc agt gac caa ggt atc atg ttt ggt tac384Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Ser Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr115 120 125gcc aca gat gaa act cca gag ggt ttg cct tta act att ctt ttg gct432Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala130 135 140cat aaa cta aac atg gcc atg gct gac gct aga aga gat ggc tct tta480His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu145 150 155 160gct tgg ttg aga cca gac acc aag act caa gtc acc gtc gaa tac aag528
Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys165 170 175gat gac cac ggt aga tgg gtt ccg caa aga atc gac acc gtc gtc gtc576Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val180 185 190tcc gct caa cat gct gac gaa atc act acc gag gac tta aga gct caa624Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln195 200 205cta aag tcc gag ttc att gaa aaa gtc atc cca aga gac atg ttg gac672Leu Lys Ser Glu Phe Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp210 215 220gaa aac acc aaa tac ttt atc caa cct tcc ggt aga ttc gtc atc ggt720Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly225 230 235 240ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag atc atc gtc gac768Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp245 250 255gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc ggt aag816Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys260 265 270gac tac tct aag gtt gat cgt tct gcc gct tat gcc gct aga tgg gtt864Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val275 280 285gcc aag tcc cta gtt gcc gct ggt tta tgt aag aga gtt caa gtt caa912Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln290 295 300ttt tct tat gcc atc ggt att gct gaa cca ttg tcc ttg cac gtt gac960Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp305 310 315 320acc tat ggt act gct acc aag tct gac gaa gaa att atc gac att atc1008Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile325 330 335agc aag aac ttt gac ttg aga cct ggt gta ttg gtc aag gag ttg gac1056Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp340 345 350tta tct aga cca atc tac ttg cca acc gct tct tat ggc cat ttc aca1104Leu Ser Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365aac caa gaa tac cca tgg gaa aag cct aag act ttg aag ttc taa1149Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380<210>4<211>382<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>4Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His1 5 10 15Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys20 25 30Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys35 40 45
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Leu Ser Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr355 360 365Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe370 375 380
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的重疊延伸PCR方法，其特征在于反應(yīng)過程分為以下幾個(gè)步驟(1)片段合成以所需突變的全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，根?jù)突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)設(shè)計(jì)一系列平行引物，引物中包含待突變的堿基，每相鄰一對(duì)引物的末端設(shè)計(jì)一個(gè)重疊區(qū)段，長(zhǎng)度為20-30bp；采用上述每相鄰的一對(duì)引物分別進(jìn)行平行的PCR，實(shí)現(xiàn)各個(gè)DNA小片段的擴(kuò)增；(2)雙混合分別純化上述片段，分成不同組分，將等量相鄰的DNA片段分別兩兩混合，片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成長(zhǎng)片段，反應(yīng)為無引物PCR過程；(3)預(yù)延伸將上述多組反應(yīng)后產(chǎn)物混合在一起，新形成的長(zhǎng)片段之間互為模板，以重疊延伸PCR方式擴(kuò)增成全長(zhǎng)新模板，該步驟也是無引物PCR過程；(4)全長(zhǎng)DNA合成在上述反應(yīng)體系中加入全長(zhǎng)基因的一對(duì)外側(cè)引物，以上一步產(chǎn)生的重組全長(zhǎng)DNA為模板，PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因；(5)后延伸將上述反應(yīng)體系再經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的94℃變性30s，72℃退火和延伸1min。
2.按權(quán)利要求1所述方法所獲得的突變基因，其特征在于具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因定點(diǎn)突變的方法，具體的說是一種改進(jìn)的重疊延伸PCR方法及其所獲得的突變基因，本方法分為如下步驟片段合成；雙混合；預(yù)延伸；全長(zhǎng)DNA合成；后延伸。以來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1為起始基因驗(yàn)證了該方法的有效性，并獲得了經(jīng)稀有密碼子改造的突變基因，該基因編碼的SAM合成酶能在釀酒酵母中高效表達(dá)，并且能提高胞內(nèi)SAM的積累量。本發(fā)明在原有重疊延伸PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一系列重要的改進(jìn)，使得在一個(gè)反應(yīng)過程中實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)定位突變。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1861799SQ20051004641
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者吳文芳, 安迎鋒, 呂安國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所