專利名稱：人胚胎干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種體外培養(yǎng)獲得人胚胎干細(xì)胞系的方法以及用該方法獲得的人胚胎干細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
人胚胎干細(xì)胞是一種來源于人類早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團的一種具有無限自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。利用人胚胎干細(xì)胞可以使人們了解胚胎早期發(fā)育規(guī)律、細(xì)胞分化機制等基本生物學(xué)問題。更使人們感興趣的是，人胚胎干細(xì)胞能分化為成人體內(nèi)任何一種細(xì)胞，因此將來可能在實驗室內(nèi)制造臨床上需要的特殊細(xì)胞，這對某些難以根治的疾病如糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、早老性癡呆等都可能產(chǎn)生革命性的影響。若把人胚胎干細(xì)胞和組織工程結(jié)合起來，將來可以在實驗室內(nèi)制造病人所需要的器官，其意義無疑是深遠(yuǎn)的。同時，人胚胎干細(xì)胞還能作為藥物篩選、毒物篩查的實驗材料，比動物實驗更接近人體的真實情況。理論上，人胚胎干細(xì)胞系的數(shù)量越多越好，這樣能滿足不同病人的需要。而不同的人胚胎建立的人干細(xì)胞系具有不同的MHC基因，因此這些細(xì)胞系之間的免疫特性是不同的。這也是國際上要建立干細(xì)胞庫的首要原因。另外，目前發(fā)現(xiàn)不同的干細(xì)胞系之間在分化潛能上也有一定的差異，也就是說，雖然干細(xì)胞系之間的基本特點是一致的，但它們之間仍然是有差別的。
因此，本領(lǐng)域仍然迫切需要有人胚胎干細(xì)胞系的建系方案和新的人胚胎干細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種在體外獲得人胚胎干細(xì)胞系的方法，所述方法包括(1)消化除去囊胚的透明帶，然后將整個囊胚放到由小鼠成纖維細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上進行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)液的配方是DMEM，20％胎牛血清，0.06-0.2mmol/Lβ-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需氨基酸，1-2mmol/L谷氨酰胺，30-60U/ml青霉素，30-60μg/ml鏈霉素；
(2)在步驟1的細(xì)胞培養(yǎng)進行8-10天后，將細(xì)胞團塊切成小塊，再接種到新鮮的小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液配方為KO-DMEM，20％血清替代物0.06-0.2mmol/L β-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需氨基酸，1-2mmol/L谷氨酰胺，30-60U/ml青霉素，30-60μg/ml鏈霉素，3-5ng/ml bFGF；(3)在步驟2的細(xì)胞生長到第4～8代時，除去培養(yǎng)液，在飽和濕度、37℃、5％CO2下用0.05％胰酶-EDTA進行消化傳代培養(yǎng)，分離得到人胚胎干細(xì)胞系。
在一個較佳的實施方案中，在步驟(3)中人胚胎干細(xì)胞以1∶5～1∶10的比例進行傳代。
在另一較佳的實施方案中，步驟(1)中所用的原代培養(yǎng)液的配方為DMEM，20％胎牛血清，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmol/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素。
在另一較佳的實施方案中，步驟(2)中所用的培養(yǎng)液配方為KO-DMEM，20％血清替代物，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmol/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和4ng/ml bFGF。
本發(fā)明另一方面還提供了一種用上述述方法獲得的人胚胎干細(xì)胞系。較佳的是，所述人胚胎干細(xì)胞系是人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1，其保藏號為CCTCC-C200503。
附圖簡述

圖1顯示了在4倍倒置相差顯微鏡觀察的本發(fā)明的人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1的第66代。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例來具體描述本發(fā)明。
1、人胚胎干細(xì)胞原代培養(yǎng)取得生長第5天或第6天的人囊胚(從臨床IVF即體外受精后的剩余囊胚中獲得)后，用5mg/ml Protease(鏈霉蛋白酶，Sigma)消化透明帶。將整個囊胚放到由小鼠成纖維細(xì)胞制備成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上進行原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)液的配方是DMEM，20％(W/V)胎牛血清(Hyclone)，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmol/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素。原代細(xì)胞生長9天左右后，將細(xì)胞團塊用巴氏吸管拉成的尖頭切割成若干小塊，再接種到新鮮的飼養(yǎng)層細(xì)胞上。此時培養(yǎng)液配方換成KO-DMEM，20％(W/V)血清替代物(Gibco)，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmol/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，4ng/ml bFGF。在人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)早期階段，都必須用機械切割的方法將細(xì)胞團分成小塊后再傳代，直到在一個4孔皿中有足夠的未分化細(xì)胞時才能改用消化傳代的方法。
2、人胚胎干細(xì)胞的消化傳代培養(yǎng)(1)當(dāng)人胚胎干細(xì)胞生長到第4～6天時，吸去培養(yǎng)液，用PBS(無鈣、鎂)洗一遍，吸去PBS。
(2)加預(yù)溫過的0.05％(W/V)胰酶-EDTA室溫下消化1～2分鐘，當(dāng)飼養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)較大空隙時表示消化較充分，用1ml吸管輕輕吹打細(xì)胞幾次，加6ml預(yù)熱的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。
(3)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，離心1000rpm，5min。
(4)棄上清，將細(xì)胞沉淀用人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后按適當(dāng)比例分配到新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，以X和Y軸方向晃動培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，最后將細(xì)胞放到培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。人胚胎干細(xì)胞一般的傳代比例是1∶5～1∶10。
人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件是飽和濕度、37℃、5％CO2。
3、凍存人胚胎干細(xì)胞(1)將配好的凍存液(90％W/V胎牛血清，10％V/VDMSO)置于冰上備用。
(2)棄去培養(yǎng)液，用PBS(無鈣、酶)洗一遍，吸去PBS。
(3)加預(yù)溫過的0.05％W/V胰酶-EDTA室溫下消化1～2分鐘，當(dāng)飼養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)較大空隙時表示消化較充分，用1ml吸管輕輕吹打細(xì)胞幾次，加6ml預(yù)熱的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。
(4)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，離心1000rpm，5min。
(5)棄上清，將細(xì)胞沉淀用凍存液重懸，吹打兩下后立即將細(xì)胞分裝到凍存管中。將凍存管轉(zhuǎn)移到細(xì)胞凍存盒中-70℃保存過夜，第二天轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)長期保存。一般每個10cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿可凍8支細(xì)胞。
該人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1已經(jīng)于2005年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC-C200503。
4、復(fù)蘇人胚胎干細(xì)胞(1)將人胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，37℃水浴直至冰塊幾乎全部溶解。
(2)用75％酒精擦拭凍存管，用1ml吸管將細(xì)胞吸出后緩慢地加到預(yù)熱的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中。
(3)細(xì)胞離心1000rpm，5min。
(4)用人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀后接種到六孔皿中，以X和Y軸方向晃動培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，將細(xì)胞放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5、鑒定人胚胎干細(xì)胞系(1)人胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定和基因表達(dá)未分化的人胚胎干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、堿性磷酸酶(AKP)等，不表達(dá)細(xì)胞表面抗原SSEA-1。這些抗原可用免疫熒光的方法進行檢測。用RT-PCR的方法還可檢測到未分化的人胚胎干細(xì)胞表達(dá)Oct-3、Sox2、FGF4、Rex1等基因。人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1表達(dá)細(xì)胞表面抗原SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、堿性磷酸酶(AKP)，不表達(dá)細(xì)胞表面抗原SSEA-1。代表未分化的基因FGF4、SOX2、LeftyA、OCT-4、TDGF1、Thy-1、Rex-1、Nanog在人胚胎干細(xì)胞SH-HES1中表達(dá)。細(xì)胞表面抗原用間接免疫熒光技術(shù)檢測。用RT-PCR的方法鑒定未分化基因的表達(dá)。
(2)人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)分化能力將人胚胎干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID-BEIGE)體內(nèi)后可產(chǎn)生畸胎瘤，若畸胎瘤含有三個胚層來源的細(xì)胞，可基本證明人胚胎干細(xì)胞具有體內(nèi)分化的多能性。由于畸胎瘤需要較長時間才能形成，因此應(yīng)該盡早進行這項檢測。用石蠟包埋、HE染色的方法分析畸胎瘤的組織構(gòu)成。
結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1形成的畸胎瘤含有表皮(外胚層)、軟骨(中胚層)、脂肪組織(中胚層)、漿液性腺體(內(nèi)胚層)、單層柱狀上皮(內(nèi)胚層)等組織。
(3)人胚胎干細(xì)胞體外分化能力在體外適當(dāng)?shù)臈l件下人胚胎干細(xì)胞能自發(fā)或被誘導(dǎo)分化，這種分化可用特異的抗體檢測到。若能檢測到人胚胎干細(xì)胞能分化成三個胚層來源的細(xì)胞，基本可證明其在體外條件下具有分化的多能性。用間接免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞體外分化形成的特殊細(xì)胞。
本發(fā)明的人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1能形成類胚體(EB)，類胚體貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞能自發(fā)分化，用免疫熒光的方法檢測這些細(xì)胞表達(dá)肌動蛋白(中胚層)，細(xì)胞角蛋白7(內(nèi)胚層)，神經(jīng)絲蛋白70(外胚層)和神經(jīng)早期蛋白(nestin，外胚層)抗原。
本發(fā)明的SH-HES1細(xì)胞系除了在體內(nèi)和體外都具有向三個胚層分化的能力，還能形成具有自主搏動能力的心肌樣細(xì)胞，因此其分化的潛能應(yīng)該是廣泛的。
(4)人胚胎干細(xì)胞核型正常的人胚胎干細(xì)胞應(yīng)該具有兩倍體的正常核型，一般用G帶顯色的方法鑒定。人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1在15代和23代時檢測具有正常兩倍體核型。
(5)端粒酶鑒定端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身攜帶的RNA為模板延長染色體端粒的長度，因此在維持染色體長度及決定細(xì)胞壽命方面有重要作用。大多數(shù)體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，而且端粒的長度隨著歲月的增加而縮短。腫瘤細(xì)胞和生長活躍的胚胎細(xì)胞高表達(dá)端粒酶。經(jīng)鑒定，本發(fā)明的人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1高表達(dá)端粒酶。
權(quán)利要求
1.一種在體外獲得人胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于，所述方法包括(1)消化除去囊胚的透明帶，然后將整個囊胚放到由小鼠成纖維細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上進行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)液的配方是DMEM，20％胎牛血清，0.06-0.2mmol/Lβ-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需氨基酸，1-2mmol/L谷氨酰胺，30-60U/ml青霉素，30-60μg/ml鏈霉素；(2)在步驟1的細(xì)胞培養(yǎng)進行8-10天后，將細(xì)胞團塊切成小塊，再接種到新鮮的小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液配方為KO-DMEM，20％血清替代物0.06-0.2mmol/L β-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需氨基酸，1-2mmol/L谷氨酰胺，30-60U/ml青霉素，30-60μg/ml鏈霉素，3-5ng/ml bFGF；(3)在步驟2的細(xì)胞生長到第4～8代時，除去培養(yǎng)液，在飽和濕度、37℃、5％ CO2下用0.05％胰酶-EDTA進行消化傳代培養(yǎng)，分離得到人胚胎干細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中在步驟(3)中人胚胎干細(xì)胞以1∶5～1∶10的比例進行傳代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所用的原代培養(yǎng)液的配方為DMEM，20％胎牛血清，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmoL/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所用的培養(yǎng)液配方為KO-DMEM，20％血清替代物，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需氨基酸，1mmol/L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和4ng/ml bFGF。
5.一種用權(quán)利要求1所述方法獲得的人胚胎干細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述人胚胎干細(xì)胞系是人胚胎干細(xì)胞系SH-HES1，其保藏號為CCTCC-C200503。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在體外獲得人胚胎干細(xì)胞系的方法。本發(fā)明還提供了用該方法獲得的人胚胎干細(xì)胞系，尤其是人胚胎干細(xì)胞系SH－HES1，其保藏號為CCTCC－C200503。
文檔編號C12N5/0735GK1865435SQ200510026010
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者金穎, 孫博文 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院