專利名稱：分離和測(cè)定血液游離dna的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本申請(qǐng)涉及一種用于分離提取血液(血清或血漿)中DNA的試劑，以及分離提取并定量檢測(cè)血液(血清或血漿)中DNA的方法。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)70年代，歐洲學(xué)者首次報(bào)道惡性腫瘤病人的血液(血清或血漿)中存在游離(Circulating)DNA，其含量約為健康人的10倍。這類游離DNA均為雙鏈DNA分子，其范圍為200bp至21kb，其中大部分以核小體(Nucleosome)的形式存在。分子生物學(xué)研究證實(shí)，血液中的游離DNA與原發(fā)腫瘤的基因組DNA具有相同的遺傳變異，如癌基因突變、微衛(wèi)星失衡和抑癌基因啟動(dòng)子甲基化等，因而認(rèn)為此類游離DNA主要來(lái)自腫瘤，其來(lái)源大致有(1)微轉(zhuǎn)移(Micrometastatsis)癌細(xì)胞，此類癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血循環(huán)后發(fā)生凋亡或壞死，從而將遺傳物質(zhì)釋放到血液中。(2)原發(fā)腫瘤中癌細(xì)胞凋亡或壞死并將遺傳物質(zhì)釋放到血液中。(3)活躍增殖的癌細(xì)胞在DNA復(fù)制時(shí)將一部分新合成的DNA片段排放到細(xì)胞外，從而進(jìn)入血循環(huán)。
近十年來(lái)，血液游離DNA已成為基因組醫(yī)學(xué)(Genomic Medicine)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，首先是作為一種非損傷性的診斷手段，可以隨時(shí)采集病人樣本進(jìn)行分析，有助于系統(tǒng)研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中各種遺傳變異的變化軌跡，加深對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)。西班牙學(xué)者Garcia-Olmo等認(rèn)為，血液游離DNA中的癌基因可能會(huì)自發(fā)地轉(zhuǎn)染多潛能的干細(xì)胞，使后者成為一類腫瘤干細(xì)胞，因而血液游離DNA作為基因組轉(zhuǎn)移(Genometastasis)值得高度關(guān)注。其次是在臨床醫(yī)學(xué)中，這些DNA作為一類新穎的腫瘤標(biāo)志物有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，一是其遺傳變異具有顯著的腫瘤特異性，借此可以鑒別良性與惡性疾患。二是基因檢測(cè)技術(shù)具有高度敏感性，特別是采用實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR)等先進(jìn)技術(shù)后，可以對(duì)1ng以下的微量DNA進(jìn)行定量分析，其檢測(cè)靈敏度較現(xiàn)有免疫學(xué)技術(shù)(如放射免疫和酶聯(lián)免疫吸附等)可以提高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。因而血液游離DNA的檢測(cè)在臨床上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如1.腫瘤診斷由于腫瘤病人血液游離DNA含量顯著高于正常人和良性疾病患者，因而檢測(cè)血液游離DNA含量及其遺傳變異對(duì)腫瘤診斷很有應(yīng)用價(jià)值。不少報(bào)道認(rèn)為其敏感性和特異性均優(yōu)于現(xiàn)有的蛋白類及糖脂類腫瘤標(biāo)志物。
2.復(fù)發(fā)預(yù)警和預(yù)后評(píng)估意大利學(xué)者Sozzi等指出，血液游離DNA檢測(cè)可以作為術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)警信號(hào)，因此在術(shù)后隨訪過(guò)程中定期檢測(cè)血液游離DNA含量，有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。此外，不少學(xué)者報(bào)道，血液游離DNA含量較高者預(yù)后較差、生存期短。
3.療效預(yù)測(cè)血液中游離DNA以核小體的形式存在，這類核酸蛋白復(fù)合物的含量與化療療效呈反比關(guān)系。因而檢測(cè)其含量可以作為療效的一項(xiàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，借此可以對(duì)病人進(jìn)行個(gè)體化治療。
目前血液游離DNA研究中的二個(gè)主要技術(shù)障礙是DNA抽提與定量檢測(cè)。血液中的游離DNA主要以核小體的形式存在，其基本結(jié)構(gòu)是以4個(gè)珠蛋白為核心、其表面由DNA雙螺旋鏈繞珠蛋白1.75圈(約200bp)而成。經(jīng)典的DNA抽提方法是用蛋白酶-K水解珠蛋白，然后用異硫氰胍使DNA變性并溶解在水相中，后者通過(guò)柱層析方法使DNA吸附在羥基磷灰石基質(zhì)表面，通過(guò)洗滌去除蛋白成份后再將吸附的DNA洗脫下來(lái)。此方法的缺點(diǎn)是水解時(shí)間長(zhǎng)(需要1-2小時(shí))、DNA的洗脫效率低(不超過(guò)50％)、成本高(約10元/樣本)。此外，由于血液中游離DNA的含量很低，通常需要用1-2ml血清或血漿才能獲得足夠的DNA進(jìn)行檢測(cè)。
DNA定量普遍采用紫外分光光度法(測(cè)定260nm波長(zhǎng)下的光吸收)，但這種方法在DNA濃度很低(＜1μg/ml)時(shí)誤差太大，而血液游離DNA在抽提后普遍低于此限度，因而不適宜用于血液游離DNA的定量分析。國(guó)外學(xué)者曾采用放射免疫法對(duì)血液游離DNA進(jìn)行測(cè)定，如瑞士學(xué)者Leon等應(yīng)用此技術(shù)測(cè)得健康人血清DNA含量平均為13ng/ml，而腫瘤病人高達(dá)180ng/ml。
因此，本領(lǐng)域中仍然需要有一種廉價(jià)、簡(jiǎn)便、快速的血液游離DNA分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種用于分離提取血液樣品中游離DNA的試劑，所述試劑基本上由乙酸/乙酸鉀緩沖液、十二烷基硫酸鈉和水組成，其中十二烷基硫酸鈉的濃度為60-120毫克/毫升，所述試劑的pH為3-5。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，每100毫升所述試劑由60毫升的5M乙酸鉀、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸鈉以及余量水組成。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離提取血液樣品中游離DNA的方法，該方法包括在93-97℃下用上述試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述血液樣品是血清或血漿。較佳的，所述方法還包括將得到的DNA沉淀溶解于水中。
本發(fā)明另一方面涉及一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品具有人上皮生長(zhǎng)因子受體cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特異性上游引物和下游引物在人上皮生長(zhǎng)因子受體基因AY588246的188248至188315位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述Taqman探針具有SEQID NO5所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。在一個(gè)較佳的方案中，所述上游引物具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面涉及一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的方法，其特征在于，該方法包括a)用上述試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定正常組織中DNA含量與基因拷貝數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系；b)從所述血液樣品中分離提取DNA；c)用上述試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定步驟b)所得DNA中的基因拷貝數(shù)，并根據(jù)步驟a)的函數(shù)關(guān)系將所測(cè)定的基因拷貝數(shù)換算成DNA含量。在一個(gè)較佳的方案中，所述血液樣品是血清或血漿。在另一較佳方案中，所述步驟b)的從所述血液樣品中分離提取DNA是在93-97℃下用前述用于分離提取血液樣品中游離DNA的試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。
利用本發(fā)明，可以從300-500μl血清或血漿中分離提取DNA，此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是DNA分離時(shí)間短(僅需要1個(gè)小時(shí))、DNA得率高(理論上講＞90％)、成本低(約1元/樣本)。所得的DNA通過(guò)高靈敏的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)，能夠在2小時(shí)內(nèi)獲得定量分析數(shù)據(jù)。
申請(qǐng)人用本發(fā)明方法分析了20例健康人和63例腫瘤病人的血液樣本，發(fā)現(xiàn)健康人血漿DNA含量平均為0.995ng/ml，腫瘤病人為24.81ng/ml；健康人血清DNA含量平均為18.81ng/ml，腫瘤病人為117.55ng/ml。若將血漿游離DNA含量的陽(yáng)性臨界值設(shè)定為3ng/ml，則健康人均為檢測(cè)陰性，而腫瘤病人的陽(yáng)性率達(dá)到95.2％。此外，血液游離DNA含量檢測(cè)對(duì)肺癌的陽(yáng)性檢出率明顯高于5項(xiàng)臨床常用的腫瘤標(biāo)志物(CA19-9，CA-125，Cyfra21-1，CEA和NSE)，尤其在5項(xiàng)標(biāo)志物均為檢測(cè)陰性的樣本中，91.7％的樣本DNA含量高于陽(yáng)性值。最后，本申請(qǐng)?zhí)峁┑馁Y料還顯示，血漿DNA含量與化療療效之間存在明顯的關(guān)系，在肺鱗癌中DNA含量低于平均值(24.81ng/ml)者化療有效率明顯增高，而在小細(xì)胞肺癌中則相反。上述資料提示本發(fā)明在腫瘤診斷及療效評(píng)估等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備，其中1表示純化前的PCR產(chǎn)物；2表示純化后的PCR產(chǎn)物；3，4表示經(jīng)篩選獲得的2個(gè)陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒電泳結(jié)果。
圖2顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(RG3000型定量PCR儀結(jié)果)。
圖3顯示了DNA含量與定量PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一方面涉及一種用于分離提取血液樣品中游離DNA的試劑，所述試劑基本上由乙酸/乙酸鉀緩沖液、十二烷基硫酸鈉和水組成，其中十二烷基硫酸鈉的濃度為60-120毫克/毫升，所述試劑的pH為3-5。
術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”指該試劑可以含有任何其它組分，這些組分可以具有任何的含量，只要這些組分及含量的存在對(duì)于本發(fā)明試劑在分離提取血液樣品中游離DNA上的效果沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響即可。
申請(qǐng)人曾作了以下嘗試1)在相同pH(pH為3-5)條件下，用甘氨酸緩沖液和檸檬酸緩沖液代替乙酸緩沖液；2)在乙酸緩沖液中用乙酸鈉來(lái)替換乙酸鉀；3)用其它去垢劑如NP-40或Triton X-100替換十二烷基硫酸鈉，但是上述嘗試均沒(méi)有取得滿意的效果。因此，本發(fā)明的試劑中的組分是非常特定的。在本發(fā)明的試劑中，乙酸緩沖液中乙酸鉀的最終濃度應(yīng)達(dá)到3M，pH范圍為3-5即可。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，每100毫升所述試劑由60毫升的5M乙酸鉀、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸鈉以及余量水組成。
本發(fā)明另一方面還涉及一種分離提取血液樣品中游離DNA的方法，其特征在于，該方法包括在93-97℃下用上述試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。
加熱處理的主要目的有二個(gè)，一是促使DNA雙螺旋解離，二是引起蛋白變性。因而通過(guò)加熱后離心，可以很容易使核酸與蛋白分離，其中蛋白位于離心管底部白色沉淀中，而核酸溶解在上部水相(酸性緩沖液)內(nèi)。通常處理溫度超過(guò)80℃便可達(dá)到上述目的，但將溫度設(shè)置在93-97℃效果更好。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，宜在95℃下用本發(fā)明上述試劑處理所述血液樣品。在上述實(shí)施方案中，所述血液樣品可以是血清或血漿。另外，該方法還包括將得到的DNA沉淀溶解于水中，-70℃下保藏。
本發(fā)明另一方面提供了一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的試劑盒，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品具有人上皮生長(zhǎng)因子受體cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特異性上游引物和下游引物在人上皮生長(zhǎng)因子受體基因AY588246的188248至188315位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述Taqman探針具有SEQ ID NO5所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述上游引物具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面還提供了一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的方法，其特征在于，該方法包括a)用本發(fā)明的上述試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定正常組織中DNA含量與基因拷貝數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系b)從所述血液樣品中分離提取DNA；c)用本發(fā)明的上述試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定步驟b)所得DNA中的基因拷貝數(shù)，并根據(jù)步驟a)的函數(shù)關(guān)系將所測(cè)定的基因拷貝數(shù)換算成DNA含量。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，步驟b)的從所述血液樣品中分離提取DNA是在93-97℃下用本發(fā)明所述的試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。
實(shí)時(shí)定量PCR法是根據(jù)Taqman技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新穎的基因檢測(cè)方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記的Taqman探針與模板cDNA進(jìn)行雜交，然后在多聚酶鏈反應(yīng)過(guò)程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探針3’-端的熒光淬滅基團(tuán)，獲得熒光激發(fā)信號(hào)，后者與模板量呈正相關(guān)。Taqman探針的制備以及熒光淬滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。
本發(fā)明的方法能對(duì)EGFR基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。具體而言，本發(fā)明者采用第一對(duì)引物(如表1中的SEQ ID NO1和2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到雙鏈DNA片段，經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品。然后，以第二對(duì)引物(如表1中的SEQ ID NO3、4)及探針(例如表1中的SEQ ID NO5)組合對(duì)待測(cè)DNA樣品進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，從標(biāo)準(zhǔn)品曲線可以確定所測(cè)定的DNA樣品中的基因拷貝數(shù)。另外，用同樣方法測(cè)定不同DNA含量的DNA樣品中的基因拷貝數(shù)，經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和回歸分析得到了DNA含量和基因拷貝數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系。依據(jù)該函數(shù)關(guān)系即可將待測(cè)樣品所測(cè)得的基因拷貝數(shù)換算成DNA含量。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，列舉上述具體的兩組引物和探針僅僅是為了描述本發(fā)明，它們并不起任何限制性的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說(shuō)明書后，能夠采用常規(guī)的手段在EGFR基因序列區(qū)間內(nèi)適當(dāng)選擇其他引物來(lái)合成DNA標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠在上述EGFR標(biāo)準(zhǔn)品的序列區(qū)間內(nèi)選擇其它合適的引物和探針來(lái)達(dá)到本發(fā)明的目的。
以下借助非限制性實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立1.1材料與方法A.材料人A431上皮樣癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生化和細(xì)胞生物學(xué)研究所。胎牛血清及F12培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。Tri Reagent RNA抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Molecular Research Center公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermantas公司。PCR引物及熒光探針由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物測(cè)序由寶生物工程(大連)公司完成。Ex TaqDNA聚合酶和pMD 18-T PCR產(chǎn)物克隆載體和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
B.引物、探針設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)發(fā)表人上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)cDNA(X00588)序列和EGFR基因(AY588246)第28外顯子序列(其中，后者是EGFR基因的序列，包括內(nèi)含子和外顯子。而前者是EGFR的cDNA序列，相當(dāng)于EGFR基因的外顯子按順序首尾相連，不含內(nèi)含子)。采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司的Prism Express軟件，分別設(shè)計(jì)了2組引物及探針。其中引物1根據(jù)X00588序列設(shè)計(jì)，用于cDNA的PCR擴(kuò)增；引物2及探針根據(jù)AY588246序列設(shè)計(jì)，用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(表1)。
表1 PCR引物及探針序列

C.定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備(1)RNA抽提及cDNA合成選擇活躍增殖期細(xì)胞，按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定A260及A280，要求A260/A280＞1.80。然后取2μgRNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
(2)cDNA的PCR擴(kuò)增應(yīng)用引物1對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液內(nèi)含cDNA 1μl，10x Ex Taq緩沖液5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游及下游引物1(20μM)各1μl，Ex Taq(5U/μl)0.25μl，用DEPC-H2O補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5min變性，然后95℃ 45sec.，56℃ 2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖凝膠電泳100V 30min后EB染色攝片。
(3)基因克隆和標(biāo)準(zhǔn)品篩選 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后切割陽(yáng)性條帶，采用試劑盒純化后克隆到pMD 18-T載體中。然后按照操作說(shuō)明篩選獲得陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序復(fù)核無(wú)誤后用作定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。
D.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立標(biāo)準(zhǔn)品基因拷貝數(shù)＝質(zhì)粒的摩爾濃度×6.023×1023。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至5×108拷貝/μl后分裝成10μl/支，-70℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品按1∶10稀釋至5×107，5×106，5×105，5×104拷貝/μl，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)液內(nèi)含標(biāo)準(zhǔn)品2μl，5x實(shí)時(shí)PCR緩沖液5μl，10mM dNTP 0.75μl，250mMMg溶液0.5μl，熱啟動(dòng)Taq酶(5U/ml)0.25μl，上游及下游引物2(100μM)各0.1μl，熒光探針(50μM)0.1μl，用DEPC-H2O補(bǔ)充至25μl。PCR反應(yīng)條件為60℃ 3min，95℃ 3min，然后95℃ 30sec.，60℃ 1min，45個(gè)循環(huán)；60℃時(shí)檢測(cè)熒光。上述試劑適用于ABI PRISMTM7000型，Rotor-Gene RG3000型和LightCycler型定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。
1.2結(jié)果A431細(xì)胞為目前國(guó)際公認(rèn)的EGFR高表達(dá)細(xì)胞株。取該細(xì)胞制備cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了單一條帶，此產(chǎn)物經(jīng)凝膠分離純化后(圖1A)，通過(guò)克隆和抗菌素篩選獲得陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒(圖1B)，后者經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)序列無(wú)誤后作為定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。
以此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，證明在基因拷貝數(shù)為104-108范圍內(nèi)能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R＞0.999(圖2)。試劑盒在-70℃儲(chǔ)存6個(gè)月性能穩(wěn)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R均＞0.98。此外，試劑盒在37℃條件下連續(xù)放置48小時(shí)并間隔12小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，顯示本試劑盒在此條件下性能穩(wěn)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均＞0.99(資料未列)。
實(shí)施例2基因組DNA檢測(cè)的線性關(guān)系2.1材料與方法正常肺組織2例，系肺癌手術(shù)切除標(biāo)本，選取離癌組織5cm以上肺組織，液氮保存。DNAezsol基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海申能博采生物技術(shù)公司。
取50mg肺組織按照操作說(shuō)明抽提DNA。所得的基因組DNA采用紫外分光光度法測(cè)定A260及A280，要求A260/A280＞1.80。然后取樣本DNA進(jìn)行系列稀釋，其濃度分別為50，25，5，2.5，0.5和0.25ng/μl，各取2μl進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。
2.2結(jié)果圖3結(jié)果顯示，以正常肺組織基因組DNA為樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，其檢測(cè)限度至少為0.5ng/反應(yīng)，并且基因拷貝數(shù)與DNA含量的對(duì)數(shù)值之間呈線性關(guān)系。3次試驗(yàn)證明，該方法具有良好的重復(fù)性，各濃度的標(biāo)準(zhǔn)差均小于均數(shù)的10％(資料未列)。經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換及回歸分析，求出劑量曲線的回歸方程為Y＝1.23X+5.31(式中Y為基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，X為DNA含量的對(duì)數(shù))。此方程可用于DNA濃度換算。
實(shí)施例3血清游離DNA的定量分析3.1材料與方法健康人血清樣本10例，肺癌病人血清樣本42例，所有病人均經(jīng)過(guò)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷確認(rèn)。血清制備方法為靜脈抽取3ml血液后，置潔凈離心管內(nèi)4℃放置過(guò)夜，然后1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，留置上層血清-70℃冰箱保存。
血清游離DNA的抽提采用上述實(shí)施例3制得的血液游離DNA抽提試劑a)，其操作步驟如下1.1.5ml Eppendorf管內(nèi)加入500微升血液游離DNA抽提試劑a)，95℃預(yù)熱5min；2.加入100-500微升血漿，95℃加熱5min，劇烈振蕩20sec；3.13,000rpm離心5min；4.轉(zhuǎn)移300-700微升上清至新Eppendorf管內(nèi)，加入等量異丙醇，室溫5min；5.13,000rpm離心5min；6.棄上清，加入700微升70％乙醇；7.13,000rpm離心5min；8.棄上清，加入700微升70％乙醇；9.13,000rpm離心5min；10.棄上清，倒置Eppendorf管，室溫干燥DNA沉淀；
11.溶解DNA于20微升H2O中-70℃保存。
上述操作在1小時(shí)以內(nèi)完成。
然后，取2微升DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，DNA含量(單位拷貝數(shù)/ml血清)按下述公式計(jì)算C＝Q×(VDNA/VPCR)×(1/VEXT)(1)公式中Q為實(shí)測(cè)的拷貝數(shù)，VDNA為經(jīng)抽提后的DNA體積(單位微升)，VPCR為定量PCR檢測(cè)時(shí)加入的DNA體積(單位微升)，VEXT為用于抽提的血清體積(單位ml)。
上述各項(xiàng)參數(shù)中，VDNA/VPCR為常數(shù)10，因而公式(1)可以簡(jiǎn)化為C＝10×Q/VEXT(2)當(dāng)血清體積為0.5ml時(shí)，公式(1)可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化為；C＝20×Q (3)上述腫瘤血清樣本同時(shí)進(jìn)行5項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，其中CA19-9，CA-125和Cyfra21-1采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，其陽(yáng)性參考值分別為＞37U/ml(CA19-9)，＞35U/ml(CA-125)和＞3.3ng/ml(Cyfra21-1)。CEA和NSE采用放射免疫法檢測(cè)，其陽(yáng)性參考值分別為＞5ng/ml(CEA)和＞20ng/ml(NSE)。腫瘤標(biāo)志物由上海市胸科醫(yī)院檢測(cè)。
3.2結(jié)果10例健康人血清的DNA基因拷貝數(shù)范圍為0.2-28.0×106/ml，平均為8.8×106/ml。按照回歸方程Y＝1.23X+5.31，將基因拷貝數(shù)換算成DNA含量，健康人血清DNA含量平均為18.81ng/ml(范圍0.17-54.64ng/ml)。此數(shù)值與Leon等的報(bào)道基本吻合。若以19ng/ml作為血清DNA含量的陽(yáng)性臨界值，則90％的健康人(9例)低于此水平。
42例肺癌病人的血清DNA其基因拷貝數(shù)平均為57.24×106/ml(范圍2-1806×106/ml)，血清DNA含量平均為117.55ng/ml(范圍6.39-1626.98ng/ml)，其中10例(23.8％)DNA含量低于陽(yáng)性值，即76.2％的肺癌病人血清DNA含量高于正常對(duì)照。
腫瘤血清標(biāo)本的各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的陽(yáng)性檢測(cè)率均不超過(guò)50％，其中Cyfra21-1陽(yáng)性率47.6％(20例)，CA-125陽(yáng)性率42.9％(18例)，CEA陽(yáng)性率26.2％(11例)，NSE陽(yáng)性率16.7％(7例)和CA19-9陽(yáng)性率11.9％(5例)。此外，42例血清樣本中有12例上述標(biāo)志物均檢測(cè)陰性，其比例為占28.6％。
表2比較了血清游離DNA含量與腫瘤標(biāo)志物陽(yáng)性檢出率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CA19-9和NSE的檢測(cè)陽(yáng)性率與DNA含量呈正相關(guān)，CEA和CA-125的檢測(cè)陽(yáng)性率與DNA含量之間無(wú)明顯相關(guān)性，而Cyfra21-1的檢測(cè)陽(yáng)性率在NDA含量＜19ng/ml和≥38ng/ml二組中顯著增高。此外，在血清DNA含量高于陽(yáng)性值的樣本中，仍有30％-40％的樣本5項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物均為檢測(cè)陰性，并且在5項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物均為檢測(cè)陰性的12例樣本中，11例(91.7％)的DNA含量高于陽(yáng)性值，提示血清游離DNA含量作為一項(xiàng)新穎腫瘤標(biāo)志物具有潛在的診斷價(jià)值。
表2血清游離DNA含量與腫瘤標(biāo)志物陽(yáng)性檢測(cè)率的關(guān)系

實(shí)施例4血漿游離DNA的定量分析4.1材料與方法健康人血漿樣本10例，肺癌病人血漿樣本21例，所有病人均為細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷確認(rèn)的初治者。病人在采血后接受化療，化療方案見(jiàn)表3?；熃Y(jié)束后按《臨床診療常規(guī)》進(jìn)行療效評(píng)估。
血漿制備方法為靜脈抽取3ml血液，10U/ml肝素抗凝。血液樣本經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘后，留置上層血漿-70℃冰箱保存。
血漿DNA抽提方法與血清DNA相同，方法見(jiàn)實(shí)施例3。
4.2結(jié)果10例健康人血漿中游離DNA在檢測(cè)范圍以下的有4例，6例檢測(cè)到DNA，此6例的DNA平均含量為0.995ng/ml(范圍0.49-2.24ng/ml)。21例肺癌病人的血漿標(biāo)本均檢測(cè)到游離DNA，平均含量為24.81ng/ml(范圍5.20-146.27ng/ml)。若將血漿游離DNA含量的陽(yáng)性臨界值設(shè)定為3ng/ml，則正常人均為檢測(cè)陰性，而腫瘤病例的陽(yáng)性率為95.2％(11/12例)。因此，血漿DNA檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷陽(yáng)性率明顯高于血清DNA檢測(cè)(95.2％vs.76.2％)。其原因是在血清制備時(shí)有一個(gè)血液凝集過(guò)程，此過(guò)程中可能有部分正常白細(xì)胞凋亡并將DNA釋放到血清中，導(dǎo)致其含量增高而影響檢測(cè)結(jié)果。而采用抗凝血制備血漿，血細(xì)胞凋亡的機(jī)會(huì)明顯減少，因而其檢測(cè)特異性大大提高。
對(duì)21例病人中的17例進(jìn)行了療效評(píng)估(剩余4例尚未作評(píng)估)，其中病灶吸收超過(guò)50％的(部分有效，PR)有4例，有效率為23.5％。此外，尚有5例病情不同程度緩解(MR)，包括病灶吸收25％-36％(3例)和癌性胸水得到控制(2例)。
表3分析了療效與血漿游離DNA含量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中DNA含量低于平均值(24.81ng/ml)者(3例)均有不同程度的療效，而高于平均值的1例未見(jiàn)療效。小細(xì)胞肺癌的情況與此相反，DNA含量在平均值以上者(2例)均為化療有效，而含量在平均值以下者(2例)均無(wú)效。
在肺腺癌中，DNA含量在10ng/ml以下者病情緩解的比例(3/4例)明顯高于DNA含量在10ng/ml以上者(1/5例)。
以上資料顯示，結(jié)合肺癌的組織類型進(jìn)行分析，化療前血漿DNA含量與療效之間存在著相關(guān)性，其中在肺鱗癌和小細(xì)胞肺癌中這種關(guān)系較為清晰。這一初步研究結(jié)果與Holdenrieder等和Gautschi等的報(bào)道基本一致。
表3肺癌病人血漿DNA含量與化療療效的關(guān)系

*藥物縮寫P順鉑；T泰素；N諾維本；I異環(huán)磷酰胺；G健擇；EVP-16；CCTX**NR無(wú)效；PR；部分有效；MR病情緩解#單位ng/ml盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
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<221>misc_feature<223>引物<400>1cacggtgtat aagggactct g21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>探針<400>5cacattcgac agccctgccc act2權(quán)利要求
1.一種用于分離提取血液樣品中游離DNA的試劑，其特征在于，所述試劑基本上由乙酸/乙酸鉀緩沖液、十二烷基硫酸鈉和水組成，其中十二烷基硫酸鈉的濃度為60-120毫克/毫升，所述試劑的pH為3-5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，每100毫升所述試劑由60毫升的5M乙酸鉀、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸鈉以及余量水組成。
3.一種分離提取血液樣品中游離DNA的方法，其特征在于，該方法包括在93-97℃下用權(quán)利要求1所述的試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述血液樣品是血清或血漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將得到的DNA沉淀溶解于水中。
6.一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品具有人上皮生長(zhǎng)因子受體cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特異性上游引物和下游引物在人上皮生長(zhǎng)因子受體基因AY588246的188248至188315位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述Taqman探針具有SEQ ID NO5所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述上游引物具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
8.一種對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的方法，其特征在于，該方法包括a)用權(quán)利要求6所述的試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定正常組織中DNA含量與基因拷貝數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系；b)從所述血液樣品中分離提取DNA；c)用權(quán)利要求6所述的試劑盒，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定步驟b)所得DNA中的基因拷貝數(shù)，并根據(jù)步驟a)的函數(shù)關(guān)系將所測(cè)定的基因拷貝數(shù)換算成DNA含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述血液樣品是血清或血漿。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟b)的從所述血液樣品中分離提取DNA是在93-97℃下用權(quán)利要求1所述的試劑處理所述血液樣品，離心取出上清，在上清內(nèi)加入異丙醇和乙醇，得到血液中游離DNA的沉淀。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離提取血液樣品中游離DNA的試劑和方法，以及對(duì)血液樣品中游離DNA含量進(jìn)行定量測(cè)定的試劑盒和方法。本發(fā)明能夠迅速、高度靈敏地獲得血液樣品中游離DNA的定量分析結(jié)果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1687455SQ20051002485
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:上海奇諾腫瘤生物高新技術(shù)有限公司