專利名稱：用于生產(chǎn)重組蛋白的翻譯融合伙伴的快速篩選方法和由此篩選的翻譯融合伙伴的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從各種遺傳來源快速篩選能夠誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白表達(dá)或分泌生產(chǎn)的合適翻譯融合伙伴(TFPs)的技術(shù)，該非可生產(chǎn)蛋白難以使用傳統(tǒng)重組生產(chǎn)方法生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
需要開發(fā)使用重組微生物的高效率蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)來分析通過人類基因組計(jì)劃新近獲得的人基因組序列數(shù)據(jù)和在基因組單元中鑒定的不同蛋白的功能，以及生產(chǎn)人醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的蛋白產(chǎn)品。當(dāng)選擇一種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)來源于高等生物例如人的重組蛋白時(shí)，應(yīng)當(dāng)仔細(xì)考慮各種因素，包括宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、蛋白表達(dá)水平、胞內(nèi)和胞外表達(dá)的可能性、翻譯后修飾的可能性、所表達(dá)蛋白的生物活性。作為代表性的微生物表達(dá)系統(tǒng)，主要使用大腸桿菌和酵母系統(tǒng)。大腸桿菌是有利的，因?yàn)橐呀?jīng)開發(fā)了許多基于大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)且大腸桿菌表達(dá)高水平異源蛋白。然而，大腸桿菌具有下列缺點(diǎn)對(duì)于來源于高等真核生物的蛋白的重組生產(chǎn)，不能進(jìn)行翻譯后修飾、蛋白難以完全分泌到培養(yǎng)基中、缺乏折疊具有很多二硫鍵的蛋白的能力，和表達(dá)不溶形式蛋白如包涵體(Makrides，Microbial Rev.，1996，60，512)。此外，由于在人蛋白中醫(yī)學(xué)上有價(jià)值的與疾病相關(guān)的蛋白主要是糖蛋白或膜蛋白，因此為了達(dá)到完全活性，它們需要糖基化和通過二硫鍵折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)。因此，這些蛋白不可能在大腸桿菌中生產(chǎn)，且基本上需要真核表達(dá)系統(tǒng)例如酵母。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是被證明對(duì)人體安全作為GRAS(公認(rèn)安全(Generally Recognized As Safe))生物的真核微生物。釀酒酵母具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于基因操作、開發(fā)的表達(dá)系統(tǒng)多樣和易于大規(guī)模培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)進(jìn)一步包括釀酒酵母具有使來源于高等細(xì)胞的蛋白例如人蛋白分泌到細(xì)胞外的功能，和執(zhí)行蛋白的翻譯后修飾，例如糖基化。胞外分泌可以通過靶蛋白與蛋白分泌信號(hào)的人工融合而完成，且在蛋白分泌過程中，發(fā)生蛋白折疊或二硫鍵形成和糖基化，由此產(chǎn)生生物活性完全的重組蛋白。而且，由于可以直接從培養(yǎng)基中獲得生物活性蛋白，因此，基于釀酒酵母的蛋白表達(dá)系統(tǒng)不需要進(jìn)行成本效益低(cost-inefficient)的細(xì)胞破裂或重折疊，從而使用它們是很經(jīng)濟(jì)的(Eckart and Bussineau，Curr.Opin.生物技術(shù)(Biotechnol.)，1996，7，525)。
然而，盡管上面提及到了釀酒酵母的許多優(yōu)點(diǎn)，但是與使用釀酒酵母分泌人蛋白系統(tǒng)相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的問題包括蛋白分泌產(chǎn)量不均勻，即從無產(chǎn)量至幾克/升，這取決于人蛋白種類，導(dǎo)致蛋白分泌產(chǎn)量幾千以上的巨大差異，因此使其難以預(yù)測(cè)分泌產(chǎn)量。當(dāng)異源蛋白以幾克/升分泌時(shí)，認(rèn)為這個(gè)蛋白產(chǎn)量是有成本效益的。相反，對(duì)于以低水平表達(dá)蛋白的生產(chǎn)，尤其是非常有價(jià)值的人治療蛋白，蛋白的表達(dá)和分泌常常發(fā)生困難。為了解決這些問題，很多研究已集中在蛋白分泌中所包含的分泌因子。例如，在分子伴侶方面進(jìn)行了很多研究，包括超表達(dá)分泌因子BiP(KAR2)的方法，其幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(ER)最新合成的蛋白進(jìn)行折疊(Robinson et al.，生物技術(shù)(Biotechnol.)prog.，1996，271，10017)，和超表達(dá)PDI(蛋白二硫鍵異構(gòu)酶)的方法，其幫助形成半胱氨酸鍵(Robinson et al.，Bio/Technology，1994，12，381；Schultz et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1994，721，148；Hayano et al.，F(xiàn)EBS Lett.，1995，377，505)。而且，提高分泌的另一項(xiàng)研究是通過制備能誘導(dǎo)分泌并與已分泌的蛋白進(jìn)行融合的融合伙伴來進(jìn)行的(Gouka et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1997，47，1)。迄今為止，在提高異源蛋白分泌方面這些方法被認(rèn)為是非常成功的。這些融合技術(shù)的分子機(jī)制很少被研究，但是這些融合技術(shù)已被試驗(yàn)證明可減少對(duì)翻譯或翻譯后的步驟的限制，包括促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和幫助蛋白折疊。
Kjeldsen等(Protein Expr.Purif.，1997，9，331)通過胰島素前體與合成前導(dǎo)區(qū)融合提高了胰島素分泌，其中所述的合成的前導(dǎo)區(qū)是-基于理論考慮為了達(dá)到胰島素或胰島素前體的有效分泌而制備的。合成前導(dǎo)區(qū)具有N-糖基化位點(diǎn)和BiP識(shí)別位點(diǎn)，因此它延長(zhǎng)了融合蛋白在ER中停留的時(shí)間，從而引起胰島素前體的正確折疊。而且，引入了另外的糖基化位點(diǎn)的合成前導(dǎo)區(qū)顯著增加了胰島素在黑曲霉(Aspergillus niger)和釀酒酵母中的分泌(Kjeldsen et al.，Protein Expr.Purif.，1998，14，309)。在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中(Ward et al.，Bio/Technology，1989，8，435)和當(dāng)在酵母中表達(dá)疏水角質(zhì)酶(cutinase)(Sagt et al.，Appl.Environ.Microbiol.2000，66，4940)時(shí)得到了類似的結(jié)果。重組蛋白的這種高產(chǎn)量分泌是引入增加重組蛋白在ER中可溶性和誘導(dǎo)蛋白正確折疊的糖基化位點(diǎn)的結(jié)果。
被分泌的蛋白已被用作融合伙伴。例如，與來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶的融合表達(dá)引起下列蛋白的分泌產(chǎn)量增加牛凝乳酶原(Ward et al.，Bio/Technology，1989，8，435)、豬胰磷脂酶A2(Roberts et al.，Gene，1992，122，155)、人白介素-6(Contreraset al.，Bio/Technology 1991，9，378；Broekhuijsen et al.，J.Biotechnol.，1993，31，135)、母雞卵清溶菌酶(Jeenes et al.，F(xiàn)EMS Microbiol Lett，1993，107，267)和人乳鐵蛋白(Ward et al.，Bio/Technology，1995，13，498)。增加的分泌產(chǎn)量根據(jù)蛋白而變化，在5至1000倍的范圍內(nèi)。而且，人白介素-1β氨基末端24個(gè)氨基酸在酵母中用作融合伙伴引起人生長(zhǎng)激素和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(Lee et al.，Biotechnol.Prog.，1999，15，884)分泌產(chǎn)量增加。人白介素-1β分泌沒有特定分泌信號(hào)(Muesch et al.，Trends Biochem.Sci.，1990，15，86)，且通過在酵母中分泌，它的重組生產(chǎn)非常有效(Baldari et al.，Protein Eng.，1987，1，433)。而且，根據(jù)最近的報(bào)道，蛋白中最初保有的融合伙伴是蛋白正確折疊必不可少的(Takahashi et al.，Appl Microbiol.Biotechnol.，2001，55，454)。為了在釀酒酵母中表達(dá)ROL，當(dāng)與來自釀酒酵母的交配因子α的前導(dǎo)序列前體(pre-pro-leader sequence)融合的成熟形式米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶(ROL)表達(dá)時(shí)，沒有觀察到ROL的分泌。然而，當(dāng)ROL與前序列一起合成時(shí)，ROL適當(dāng)?shù)胤置?。這些結(jié)果證明ROL的前序列是ROL自身折疊必不可少的。
如上所述，經(jīng)過許多研究，已開發(fā)了各種分泌因子誘導(dǎo)重組蛋白的分泌。然而，雖然開發(fā)的分泌因子有效增加特定蛋白的分泌水平，但是他們不能用作所有蛋白分泌生產(chǎn)的一般方法。Dorner等報(bào)道了BiP在CHO細(xì)胞中超表達(dá)稍微降低了蛋白分泌(Dorner etal.，EMBO J.，1992，11，1563)，和BiP表達(dá)降低增加了蛋白分泌(Dorner et al.，Mol.cell.Biol.，1988，8，4063)。在酵母中，KAR2(BiP)的超表達(dá)沒有提高植物甜味蛋白的分泌(Harmsen et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1996，46，365)。桿狀病毒中BiP的超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞溶解產(chǎn)物中可溶抗體水平增加，但是沒有增加抗體的分泌產(chǎn)量(Hsu et al.，Protein Expr.Purif.，1994，5，595)。當(dāng)另一個(gè)分泌因子PDI作為折疊酶(foldase)在黑曲霉中超表達(dá)時(shí)，葡糖淀粉酶的分泌沒有增加(Wang and Ward，Curr.Genet.2000，37，57)。也報(bào)道了使用蛋白融合伙伴改善分泌所存在的問題是僅僅對(duì)特定蛋白的分泌效率增加。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，許多研究已集中于分泌因子的效果，但是分泌因子對(duì)分泌水平具有不同影響，其取決于蛋白類型，因此不能應(yīng)用于所有蛋白。因此，需要篩選特定適用于靶蛋白進(jìn)行靶蛋白最大分泌的最佳分泌因子的技術(shù)。在這點(diǎn)上，本發(fā)明人開發(fā)了根據(jù)重組蛋白類型從基因單元快速篩選最佳分泌融合伙伴的技術(shù)。
因此，本發(fā)明旨在提供能夠從包括酵母的各種遺傳來源快速篩選合適的翻譯融合伙伴(TFP)的方法，該翻譯融合伙伴能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)由于在酵母中表達(dá)水平低而不能大規(guī)模和低成本生產(chǎn)的蛋白的產(chǎn)生，并能夠刺激使用該方法分泌生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的翻譯融合伙伴。
附圖簡(jiǎn)述由下列詳細(xì)說明書并結(jié)合附圖將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)其中

圖1顯示了刪除轉(zhuǎn)化酶基因的方法和選擇性標(biāo)記的敲除(pop-out)方法；圖2顯示了轉(zhuǎn)化酶活性的酶譜分析(泳道1、2和3野生型釀酒酵母Y2805；和泳道4、5和6轉(zhuǎn)化酶缺陷菌株(釀酒酵母Y2805Δinv2)；圖3以照片顯示了酵母細(xì)胞依碳源的生長(zhǎng)(INV2野生型釀酒酵母Y2805；和Δinv2轉(zhuǎn)化酶缺陷菌株(釀酒酵母Y2805Δinv2)；圖4顯示了刪除轉(zhuǎn)化酶基因的Southern印跡結(jié)果(泳道1和2釀酒酵母Y2805ura3 INV2；泳道3和4釀酒酵母Y2805Δinv2U(URA3Δinv2)；和泳道5和6釀酒酵母Y2805Δinv2(ura3Δinv2)；圖5以照片顯示了酵母細(xì)胞在葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)；圖6顯示了制備pYHTS-F0、F1和F2質(zhì)粒的方法和制備酵母基因文庫(kù)的方法；圖7顯示了含有四個(gè)翻譯融合伙伴任何一種的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液的SDS-PAGE和Western印跡結(jié)果(泳道1大小標(biāo)記；泳道2白介素-2；泳道3含有pYIL-TFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道4含有pYIL-TFP2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道5含有pYIL-TFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道6含有pYIL-TFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；圖8顯示了通過Endo-H消化的糖基化分析結(jié)果，其中在SDS-PAGE上分析樣品(泳道1(-)含有pYIL-TFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，未經(jīng)Endo-H處理；泳道1(+)含有pYIL-TFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)Endo-H處理；泳道2(-)含有pYIL-TFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，未經(jīng)Endo-H處理；泳道2(+)含有pYIL-TFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)Endo-H處理；泳道3(-)含有pYIL-TFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，未經(jīng)Endo-H處理；泳道3(+)含有pYIL-TFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)Endo-H處理)；圖9顯示了Kex2p加工位點(diǎn)存在或不存在下，酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M大小標(biāo)記；泳道1含有pYIL-TFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道2含有pYIL-KRTFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道3含有pYIL-TFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道4含有pYIL-KRTFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道5含有pYIL-TFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道6含有pYIL-KRTFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；圖10是為分析TFP1的特性，TFP1基因已被部分刪除的質(zhì)粒的圖式介紹；圖11顯示了分析得自TFP1的翻譯融合伙伴(TFP-1、2、3和4)分泌白介素-2能力的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M大小標(biāo)記；泳道S白介素-2；泳道1-1含有pYIL-KRT1-1(也稱為pYIL-KRTFP1-1)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道1-2含有pYIL-KRT1-2(也稱為pYIL-KRTFP1-2)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道1-3含有pYIL-KRT1-3(也稱為pYIL-KRTFP1-3)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道1含有pYIL-KRTFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；和泳道1-4含有pYIL-KRT1-4(也稱為pYIL-KRTFP1-4)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；圖12顯示了含有pYIL-KRT1-4的重組酵母菌株分批補(bǔ)料發(fā)酵剖面圖和分析依發(fā)酵時(shí)間分泌到培養(yǎng)基的蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；圖13顯示了SDS-PAGE和Western印跡結(jié)果，顯示出翻譯融合伙伴TFP1、2、3和4誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白人G-CSF的分泌(泳道M大小標(biāo)記、泳道1含有pYGCSF-KRTFP1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道2含有pYGCSF-KRTFP2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道3含有pYGCSF-KRTFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；和泳道4含有pYGCSF-KRTFP4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；圖14顯示了含有pYGCSF-TFP3的重組酵母菌株分批補(bǔ)料發(fā)酵剖面圖和分析依發(fā)酵時(shí)間分泌到培養(yǎng)基的蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；圖15顯示了全長(zhǎng)基因的分離，翻譯融合伙伴TFP3是全長(zhǎng)基因的一部分和通過被分離的基因和G-CSF基因之間融合位點(diǎn)的修飾G-CSF分泌提高((A)泳道T3含有pYGCSF-KRTFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-1含有pYGCSF-KRTFP3-1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-2含有pYGCSF-KRTFP3-2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-3含有pYGCSF-KRTFP3-3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，和泳道T3-4含有pYGCSF-KRTFP3-4的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；和(B)泳道T3含有pYGCSF-KRTFP3的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-1含有pYGCSF-KRTFP3-1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-1-1含有pYGCSF-KRTFP3-1-1的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，泳道T3-1-2含有pYGCSF-KRTFP3-1-2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液，和泳道T3-2含有pYGCSF-KRTFP3-2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；
圖16顯示了用于通過翻譯融合伙伴TFP3分泌生產(chǎn)工業(yè)酶CalB14的發(fā)酵培養(yǎng)基的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M大小標(biāo)記；泳道1和220℃低溫下含有pYGA-CalB14的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液；和泳道12-58含有pYGT3-CalB14的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液)；圖17顯示了在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)，在給定時(shí)間點(diǎn)收集的樣品的SDS-PAGE結(jié)果，該酵母包含含翻譯融合伙伴TFP1的G-CSF表達(dá)載體pGAP-TFP1-GCSF，或傳統(tǒng)的G-CSF表達(dá)載體pGAP-MFalpha-GCSF(泳道Sc10μl含有pYGCSF-KRTFP1的釀酒酵母培養(yǎng)上清液；和泳道6-24含有pGAP-TFP1-GCSF或pGAP-MFalpha-GCSF的巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)上清液200μl濃縮物)；圖18是pYIL-KRTFP1的略圖；圖19是pYIL-KRTFP2的略圖；圖20是pYIL-KRTFP3的略圖；圖21是pYIL-KRTFP4的略圖；圖22是pYIL-KRT1-3(也稱為pYIL-KRTFP1-3)的略圖；圖23是pYIL-KRT1-4(也稱為pYIL-KRTFP1-4)的略圖；圖24是pYGT3-1-1-GCSF的略圖；和圖25是pYGT3-1-2-GCSF的略圖。
本發(fā)明最佳實(shí)施方式在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種從基因文庫(kù)篩選誘導(dǎo)非可生產(chǎn)X-R融合蛋白胞外分泌的翻譯融合伙伴(TFP)的方法，該融合蛋白是通過為自動(dòng)篩選將非可生產(chǎn)靶蛋白基因(X)與報(bào)道基因(R)連接，通過X-R融合產(chǎn)物與其它基因融合制備的。
在一個(gè)詳細(xì)方面，本發(fā)明涉及一種篩選生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的合適翻譯融合伙伴(TFP)的方法，包括(1)制備包括融合基因(X-R)的自動(dòng)篩選載體，其中為自動(dòng)篩選，將編碼非可生產(chǎn)靶蛋白的基因(X)與報(bào)道基因(R)符合讀框地連接；(2)將包括誘導(dǎo)非可生產(chǎn)融合蛋白(X-R)分泌的TFP的基因文庫(kù)與自動(dòng)篩選載體連接產(chǎn)生TFP文庫(kù)；(3)用TFP文庫(kù)轉(zhuǎn)化無報(bào)道基因活性的細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)道蛋白活性；和(4)從發(fā)揮報(bào)道蛋白活性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離基因并分析TFP性能。
如在此使用的術(shù)語(yǔ)“翻譯融合伙伴(TFP)”是指與編碼非可生產(chǎn)蛋白的基因融合并誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白分泌生產(chǎn)的基因。而且，“翻譯融合伙伴蛋白”意思是具有由前述TFP基因編碼的氨基酸序列的蛋白。
如在此使用的術(shù)語(yǔ)“非可生產(chǎn)蛋白”是指由于從人或各種生物重組生產(chǎn)蛋白的天然性能，難以在宿主細(xì)胞，如大腸桿菌或酵母中表達(dá)的蛋白。尤其是，對(duì)于本發(fā)明的目的，非可生產(chǎn)蛋白是指重組生產(chǎn)中，難以在真核宿主細(xì)胞如酵母中表達(dá)的蛋白。本發(fā)明的篩選方法和使用該篩選方法獲得的翻譯融合伙伴用于不能在原核細(xì)胞如大腸桿菌和真核細(xì)胞如酵母中重組生產(chǎn)的蛋白，以及可以在原核細(xì)胞如大腸桿菌中重組生產(chǎn)，但是由于它們?cè)谡婧思?xì)胞如酵母中產(chǎn)量低而成本效益低的許多蛋白。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”意思是編碼特定蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物被分泌和獲得作為最終期望產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的自動(dòng)篩選的報(bào)道基因選自編碼能夠胞外分泌的蛋白的基因群，但不限于此，這些蛋白包括轉(zhuǎn)化酶、蔗糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、麥芽糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和半乳糖苷酶。
在該篩選方法中，包括誘導(dǎo)非可生產(chǎn)的融合蛋白分泌的翻譯融合伙伴的基因文庫(kù)可以從各種來源獲得，例如動(dòng)物、植物和微生物，包括酵母或人。優(yōu)選的是來自酵母的基因文庫(kù)。對(duì)于基因文庫(kù)的酵母包括假絲酵母屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克盧費(fèi)氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、亞羅威阿酵母屬(Yarrowia)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉菌屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)等等?；蛭膸?kù)可以是基因組(染色體)DNA或cDNA形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在重組生產(chǎn)中難以表達(dá)的非可生產(chǎn)蛋白(X)與轉(zhuǎn)化酶(I)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，因?yàn)樵谡Ｇ闆r下分泌的轉(zhuǎn)化酶的分泌被融合的低分泌的蛋白(X)所抑制，所以由于在僅含有蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上融合蛋白的表達(dá)水平低，酵母細(xì)胞不生長(zhǎng)或它們的生長(zhǎng)大大延遲。然而，當(dāng)導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)X-I表達(dá)和分泌的有效翻譯融合伙伴時(shí)，細(xì)胞在蔗糖培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)。根據(jù)這個(gè)原理，當(dāng)非可生產(chǎn)蛋白和轉(zhuǎn)化酶的X-I融合蛋白與從各種來源獲得的翻譯融合伙伴文庫(kù)以TFP-X-I或X-I-TFP形式另外融合，導(dǎo)入酵母細(xì)胞并在其中表達(dá)時(shí)，選擇在蔗糖培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)的細(xì)胞，因而允許從各種文庫(kù)快速篩選最適于非可生產(chǎn)蛋白的TFP。
因此，在更優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及一種快速篩選用于生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的合適的翻譯融合伙伴(TFP)的方法，包括(1)制備刪除其內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶基因INV2(I)的酵母突變株以開發(fā)使用酵母轉(zhuǎn)化酶作為報(bào)道基因的自動(dòng)篩選系統(tǒng)；(2)制備酵母高產(chǎn)量選擇(HTS)載體-含有基因(X-I)的pYHTS載體(pYHTS-F0、pYHTS-F1或pYHTS-F2)，其中轉(zhuǎn)化酶基因(I)與非可生產(chǎn)蛋白基因(X)符合讀框地融合且在酵母GAL10啟動(dòng)子控制下表達(dá)；(3)制備能夠在pYHTS載體中分泌轉(zhuǎn)化酶和非可生產(chǎn)蛋白融合基因(X-I)的來自酵母基因的翻譯融合伙伴文庫(kù)；(4)將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化到步驟(1)制備的酵母突變株中和在僅含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行自動(dòng)篩選；(5)通過培養(yǎng)在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞檢測(cè)分泌到培養(yǎng)基的蛋白；和(6)從酵母細(xì)胞分離基因并分析翻譯融合伙伴的性能。
本發(fā)明人制備了轉(zhuǎn)化酶缺陷酵母突變株并發(fā)現(xiàn)通過與轉(zhuǎn)化酶融合的蛋白在刪除其轉(zhuǎn)化酶基因的酵母菌株中的表達(dá)，轉(zhuǎn)化酶可以用作自動(dòng)篩選的標(biāo)記。然后，本發(fā)明人制備了用于自動(dòng)篩選翻譯融合伙伴的載體-pYHTS-F0、F1和F2，使用非可生產(chǎn)蛋白、人白介素-2，將得自酵母的切割染色體DNA與該載體連接產(chǎn)生翻譯融合伙伴文庫(kù)，并從TFP文庫(kù)發(fā)現(xiàn)適合低分泌蛋白人白介素-2的TFP蛋白-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4。
僅使用蔗糖作為碳源，酵母細(xì)胞需要酵母INV2基因編碼的轉(zhuǎn)化酶。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“使用轉(zhuǎn)化酶的自動(dòng)篩選系統(tǒng)”意思是指當(dāng)刪除了酵母菌株染色體INV2基因時(shí)，根據(jù)導(dǎo)入載體的INV2基因的表達(dá)選擇在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌株的系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)化酶已被用作報(bào)道蛋白。例如，美國(guó)專利6,228,590和EP 0 907 727 B1公開了篩選誘導(dǎo)缺乏天然分泌信號(hào)序列并因此不能被分泌的轉(zhuǎn)化酶分泌的融合伙伴的方法。相比之下，本發(fā)明使用用于篩選能夠誘導(dǎo)非可生產(chǎn)融合蛋白表達(dá)的翻譯融合伙伴的轉(zhuǎn)化酶，其中轉(zhuǎn)化酶與非可生產(chǎn)蛋白融合。結(jié)果，表達(dá)轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)化體數(shù)量顯著減少，因此給出真假陽(yáng)性之間更好的鑒別。因而，本發(fā)明允許快速鑒定適用于非可生產(chǎn)蛋白特異的翻譯融合伙伴。
本發(fā)明獲得的翻譯融合伙伴TFP1、TFP2、TFP3和TFP4及其衍生物可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的商品化的各種蛋白。這些蛋白包括但不限于細(xì)胞因子(例如白介素)、血清蛋白(例如凝血因子包括因子VII、VIII和IX)、免疫球蛋白、細(xì)胞因子受體、乳鐵蛋白、干擾素(例如干擾素-α、-β、-γ)、集落刺激因子(例如GM-CSF、G-CSF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰島素、腫瘤壞死因子(TNF)、生長(zhǎng)因子(例如組織生長(zhǎng)因子和上皮生長(zhǎng)因子，如TGFα或TGFβ、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF))、激素(例如促卵泡素、促甲狀腺素、抗利尿激素、色素性和甲狀旁腺激素、黃體生成素釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGPR)、腦啡肽、促生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原激活物、生長(zhǎng)激素釋放肽(GHPR)、胸腺體液因子(THF)和抗癌和抗菌肽。并且，這些蛋白可以包括酶，通過碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶示例。酶的具體實(shí)例包括但不限于天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、過氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶、過氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。碳水化合物特異性酶的實(shí)例包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖酶(glucodase)、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶和葡糖苷酸酶。
非可生產(chǎn)蛋白基因是編碼具有人醫(yī)學(xué)或工業(yè)重要性、需要重組生產(chǎn)的上述蛋白的基因，和從來源于各種植物、動(dòng)物和微生物，包括人的基因分離或化學(xué)合成的基因。
本發(fā)明的自動(dòng)篩選載體包括啟動(dòng)子基因、刪除了翻譯起始和終止密碼子的編碼靶蛋白的基因、和與編碼靶蛋白的基因符合讀框融合的報(bào)道基因。啟動(dòng)子基因優(yōu)選選自包括GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1和GAL10的組。
在本發(fā)明的自動(dòng)篩選法中，待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括但不限于酵母如假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜氏酵母屬、克盧費(fèi)氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、裂殖酵母屬、亞羅威阿酵母屬和酵母屬種，真菌如曲霉屬、青霉屬、根霉菌屬和木霉屬種，和細(xì)菌如埃希氏桿菌屬(Escherichia)和芽胞桿菌屬(Bacillus)種。
根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的合適TFP的快速篩選方法優(yōu)選用于不表達(dá)或低水平表達(dá)的非可生產(chǎn)蛋白的生產(chǎn)。而且，該方法可以用于篩選能夠增加低水平表達(dá)蛋白的表達(dá)水平的TFP。如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)轉(zhuǎn)化酶用作報(bào)道子時(shí)，根據(jù)細(xì)胞在蔗糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率選擇細(xì)胞，因此允許鑒別更有效的TFPs。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于快速篩選刺激非可生產(chǎn)蛋白白介素-2的分泌生產(chǎn)的合適融合伙伴的載體-pYHTS-F0、F1和F2。這些篩選載體包括非可生產(chǎn)蛋白人白介素-2和轉(zhuǎn)化酶的融合基因，并且含有在白介素-2基因氨基末端具有三個(gè)不同閱讀框架的BamHI識(shí)別位點(diǎn)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為了快速篩選刺激人白介素-2在酵母細(xì)胞中分泌生產(chǎn)的合適融合伙伴，隨機(jī)切割酵母染色體DNA并被插入三個(gè)篩選載體(pYHTS-F0、F1和F2)。用所得篩選載體轉(zhuǎn)化缺乏轉(zhuǎn)化酶的酵母菌株，選擇在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落以鑒定能夠?qū)⒎强缮a(chǎn)白介素-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白分泌到培養(yǎng)基的合適融合伙伴。
人白介素-2是一種高度疏水的蛋白，難以在酵母細(xì)胞中表達(dá)，因?yàn)橛蓮?qiáng)烈啟動(dòng)子引起的大規(guī)模表達(dá)重組蛋白在ER中不是快速折疊成活性形式，而是形成可能阻斷ER作用的聚集體。因而，當(dāng)與白介素-2融合時(shí)，轉(zhuǎn)化酶也不分泌，并且酵母細(xì)胞不能在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。能夠有效分泌這些融合蛋白的翻譯融合伙伴可以通過在白介素-2基因上游插入酵母基因組文庫(kù)，并將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母菌株中和選擇在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體而鑒定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為了獲得誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白白介素-2分泌的融合伙伴，本發(fā)明人從在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體分離基因，該基因再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并回收四個(gè)不同的質(zhì)粒(pYHTS-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4)。獲得了質(zhì)粒中攜帶的四個(gè)不同翻譯融合伙伴基因TFP1(SEQ ID NO.2)、TFP2(SEQ ID NO.4)、TFP3(SEQ ID NO.6)和TFP4(SEQID NO.8)，和相應(yīng)氨基酸序列分別用SEQ ID NOS.1、3、5和7表示。
轉(zhuǎn)化酶基因在獲得的載體pYHTS-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4中被刪除，并將翻譯終止密碼子插入白介素-2基因中，由此產(chǎn)生pYIL-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4。由于這些載體以與翻譯融合伙伴融合的形式分泌白介素-2，因此插入Kex2p蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)以允許自動(dòng)除去翻譯融合伙伴，由此產(chǎn)生pYIL-KRTFP1、KRTFP2、KRTFP3和KRTFP4。而且，人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)與翻譯融合伙伴TFP1至TFP4融合，由此分別產(chǎn)生載體pYGCSF-TFP1至pYGCSF-TFP4。這些載體證明TFPs在除了人白介素-2的其他蛋白的分泌生產(chǎn)中也是有效。
另一方面，當(dāng)傳統(tǒng)表達(dá)-分泌系統(tǒng)(AMY，淀粉酶分泌信號(hào))用于在重組酵母菌株—即CalB14突變株中進(jìn)行大規(guī)模分泌生產(chǎn)時(shí)，CalB14在30℃的最適酵母培養(yǎng)溫度下不能被有效分泌，而是在22℃的低溫下被分泌，其中CalB14突變株通過野生型假絲酵母屬南極洲脂肪酶B(CalB)的分子進(jìn)化，特異活性提高了約6倍，并且由于CalB14在工業(yè)應(yīng)用中的應(yīng)用遠(yuǎn)景吸引了很多興趣。由于傳統(tǒng)系統(tǒng)具有大規(guī)模發(fā)酵時(shí)酵母生長(zhǎng)率低和發(fā)酵罐溫度控制尤其是在夏天的成本高的問題，需要允許在最適培養(yǎng)溫度分泌生產(chǎn)的分泌系統(tǒng)。在本發(fā)明中，通過制備攜帶與TFP3融合的CalB的pYGT3-CalB4載體解決了這些問題。
因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.1表示的翻譯融合伙伴TFP1蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.1表示的翻譯融合伙伴TFP1蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP1蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQ ID NO.1表示的翻譯融合伙伴TFP1蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.2的基因。此外，本發(fā)明涉及包含該基因的重組載體。優(yōu)選，重組載體中攜帶的基因是SEQ ID NO.2的基因。重組載體的實(shí)例包括pYIL-TFP1、pYIL-KRTFP1、pYGCSF-TFP1、pYGCSF-KRTFP1和pGAP-TFP1-GCSF。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRTFP1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10544BP。
在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.3表示的翻譯融合伙伴TFP2蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.3表示的翻譯融合伙伴TFP1蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP2蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQ ID NO.3表示的翻譯融合伙伴TFP2蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.4的基因。此外，本發(fā)明涉及包含該基因的重組載體。優(yōu)選，重組載體中攜帶的基因是SEQ ID NO.4的基因。該重組載體的實(shí)例包括pYIL-TFP2、pYIL-KRTFP2、pYGCSF-TFP2和pYGCSF-KRTFP2。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRTFP2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10545BP。
在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.5表示的翻譯融合伙伴TFP3蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.5表示的翻譯融合伙伴TFP3蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP3蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQ ID NO.5表示的翻譯融合伙伴TFP3蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.6的基因。此外，本發(fā)明涉及包含該基因的重組載體。優(yōu)選，重組載體中攜帶的基因是SEQ ID NO.6的基因。該重組載體的實(shí)例包括pYIL-TFP3、pYIL-KRTFP3、pYGCSF-TFP3、pYGCSF-KRTFP3和pYGT3-CalB14。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRTFP3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10546BP。
在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.7表示的翻譯融合伙伴TFP4蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.7表示的翻譯融合伙伴TFP4蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP4蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQ ID NO.7表示的翻譯融合伙伴TFP4蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.8的基因。此外，本發(fā)明涉及包含該基因的重組載體。優(yōu)選，重組載體中攜帶的基因是SEQ ID NO.8的基因。該重組載體的實(shí)例包括pYIL-TFP4、pYIL-KRTFP4、pYGCSF-TFP4和pYGCSF-KRTFP4。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRTFP4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10547BP。
如在此用于翻譯融合伙伴蛋白或基因的術(shù)語(yǔ)“類似物”意思是當(dāng)翻譯融合伙伴基因與編碼非可生產(chǎn)蛋白的基因融合時(shí)，通過誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白分泌生產(chǎn)而發(fā)揮翻譯融合伙伴活性的功能等同物。在TFP蛋白的情況下，該類似物可以包括例如具有相同性能的氨基酸之間的置換(例如用另一疏水性氨基酸取代一疏水性氨基酸、用另一親水性氨基酸取代一親水性氨基酸、用另一堿性氨基酸取代一堿性氨基酸、用另一酸性氨基酸取代一酸性氨基酸)、氨基酸的缺失和插入或其組合。
對(duì)于本發(fā)明的翻譯融合伙伴蛋白的置換類似物，通常不改變蛋白或肽活性的蛋白和肽中的氨基酸置換是本領(lǐng)域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，AcademicPress，New York，1979)。最常發(fā)生的在雙方向上置換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
此外，對(duì)于本發(fā)明的翻譯融合伙伴蛋白的缺失類似物，使用基因組文庫(kù)(染色體文庫(kù))或cDNA文庫(kù)鑒定的翻譯融合伙伴基因的全部序列的一部分缺失可能不影響或可能刺激非可生產(chǎn)蛋白的分泌。本發(fā)明人研究了翻譯融合伙伴TFP1、TFP2、TFP3和TFP4的缺失類似物片段對(duì)非可生產(chǎn)蛋白分泌的影響。攜帶刪除富含絲氨酸/丙氨酸序列、N-糖基化位點(diǎn)或?qū)⒍叨紕h除的TFP1的載體不分泌非可生產(chǎn)蛋白。相比之下，攜帶已刪除5’-UTR(5’非翻譯區(qū))的TFP1的載體(pYIL-KRT1-4)使非可生產(chǎn)蛋白的表達(dá)水平增加三倍以上。而且，當(dāng)另外刪除3’末端(pYIL-KRT1-3)時(shí)，誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白的分泌。因此，本發(fā)明5’-UTR的翻譯融合伙伴缺失類似物和3’末端部分刪除的TFPs包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要它們不反面影響非可生產(chǎn)蛋白的分泌。
在一個(gè)詳細(xì)方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.9表示的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.9表示的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQID NO.9表示的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。此外，本發(fā)明提供了攜帶該基因的重組載體。優(yōu)選，重組載體中攜帶的基因是編碼SEQ ID NO.9表示的翻譯融合伙伴TFP1-3的基因。該重組載體的示例是pYIL-KRT1-3(也稱作pYIL-KRTFP1-3)。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRTFP1-3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10548BP。
在另一個(gè)詳細(xì)方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO.10表示的基因編碼的翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白或其類似物。本發(fā)明還涉及編碼由SEQ ID NO.10表示的翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.10表示的基因編碼的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有SEQ ID NO.10表示的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。本發(fā)明提供了包含編碼翻譯融合伙伴TFP1-4并由SEQ ID NO.10表示或其類似物的基因的重組載體。而且，本發(fā)明提供了包含具有編碼翻譯融合伙伴TFP1-4并由SEQ ID NO.10表示的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因的重組載體。該重組載體的示例是pYIL-KRT1-4(也稱作pYIL-KRTFP1-4)。此外，本發(fā)明提供了用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYIL-KRT1-4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10549BP。
此外，對(duì)于本發(fā)明的翻譯融合伙伴蛋白的插入類似物，某些序列添加至使用基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)鑒定的翻譯融合伙伴基因的全部序列或發(fā)揮活性的一部分序列可能不影響或可能刺激非可生產(chǎn)蛋白的分泌。本發(fā)明人研究了翻譯融合伙伴的插入類似物對(duì)非可生產(chǎn)蛋白分泌的影響。TFP3的兩個(gè)插入類似物(104個(gè)氨基酸)、TFP3-3(189個(gè)氨基酸)和TFP3-4(222個(gè)氨基酸)降低了分泌產(chǎn)量。相比之下，將26個(gè)氨基酸的N-糖基化位點(diǎn)添加至TFP3制備的TFP3-1與TFP3相比，使G-CSF的分泌增加約三倍。而且，將4個(gè)氨基酸添加至TFP3-1制備的TFP3-1-1(134個(gè)氨基酸)和將13個(gè)氨基酸添加至TFP3-1制備的TFP3-1-2(143個(gè)氨基酸)大大降低了分泌過程中未用Kex2p加工的融合蛋白水平，但G-CSF的分泌產(chǎn)量沒有降低。因此，本發(fā)明翻譯融合伙伴的插入類似物，其具有增加了N-糖基化位點(diǎn)和允許用Kex2p蛋白酶方法切割融合部位的區(qū)域，都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要它們不反面影響非可生產(chǎn)蛋白的分泌。
在一個(gè)詳細(xì)方面，本發(fā)明提供了由SEQ ID NO.40表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白或其類似物。本發(fā)明還提供了編碼由SEQ ID NO.40表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.40表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQ ID NO.40表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.41的基因。此外，本發(fā)明提供了包含該基因的重組載體。優(yōu)選，該重組載體中攜帶的基因是SEQID NO.41的基因。該重組載體的示例是pYGT3-1-1-GCSF。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYGT3-1-1-GCSF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2004年12月21日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10753BP。
在另一個(gè)詳細(xì)方面，本發(fā)明提供了由SEQ ID NO.42表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白或其類似物。本發(fā)明還提供了編碼由SEQ ID NO.42表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白或其類似物的基因。本發(fā)明的范圍包括具有SEQ ID NO.42表示的氨基酸序列或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白。本發(fā)明的范圍還包括具有編碼SEQID NO.42表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白的DNA序列，或與其具有優(yōu)選75％、更優(yōu)選85％、甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的DNA序列的基因。優(yōu)選，該基因是SEQ ID NO.43的基因。此外，本發(fā)明提供了包含該基因的重組載體。優(yōu)選，該重組載體中攜帶的基因是SEQID NO.43的基因。該重組載體的示例是pYGT3-1-2-GCSF。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用pYGT3-1-2-GCSF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于2004年12月21日保藏在KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，和指定保藏號(hào)KCTC 10754BP。
如在此用于翻譯融合伙伴蛋白或基因的術(shù)語(yǔ)“同源性”意欲表示與野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列的相似性。在蛋白的情況下，“同源性”包括與本發(fā)明TFP蛋白的氨基酸序列具有優(yōu)選75％或更高，更優(yōu)選85％或更高，甚至更優(yōu)選90％或更高和最優(yōu)選95％或更高同一性的氨基酸序列。典型地，蛋白同系物可以包括與靶蛋白相同的活性部位。在基因的情況下，“同源性”包括與編碼本發(fā)明TFP蛋白的DNA序列具有優(yōu)選75％或更高，更優(yōu)選85％或更高，甚至更優(yōu)選90％或更高和最優(yōu)選95％或更高同一性的DNA序列。同源性評(píng)估可以用肉眼或使用市場(chǎng)上可買到的程序來進(jìn)行。使用市場(chǎng)上可買到的計(jì)算機(jī)程序，兩個(gè)或更多序列之間的同源性可以用百分比(％)來表示，和可以估計(jì)鄰近序列之間的同源性(％)。
根據(jù)本發(fā)明鑒定的用于非可生產(chǎn)蛋白分泌生產(chǎn)的翻譯融合伙伴以與編碼非可生產(chǎn)蛋白的基因融合的形式使用，并可以插入載體用于非可生產(chǎn)蛋白的分泌生產(chǎn)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體含有與能夠控制蛋白在合適宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和為促進(jìn)其它基因操作或優(yōu)化蛋白表達(dá)而引入的序列操作連接的DNA序列。這種調(diào)節(jié)序列包括進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子、為轉(zhuǎn)錄控制選擇性添加的操縱子、合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄/翻譯的序列控制終止子。用于插入外源基因的這種載體可以是質(zhì)粒、病毒、粘粒等等。該載體包括克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體是其中插入外源DNA的可復(fù)制質(zhì)粒，并將外源DNA遞送入隨其轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體典型地意思是其中插入外源DNA片段，通常是雙鏈DNA片段的載體。“外源DNA”是指不是天然存在于宿主細(xì)胞中的異種DNA。表達(dá)載體能夠不依賴于宿主細(xì)胞中的宿主染色體DNA而復(fù)制，使得可以產(chǎn)生插入的外源DNA。如本領(lǐng)域通常已知的，為了增加轉(zhuǎn)染基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，該基因應(yīng)當(dāng)與在選擇作為表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中有作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列操作連接。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”如在此對(duì)于使用含有翻譯融合伙伴的重組載體所用的轉(zhuǎn)化，其意思是將DNA導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，使得DNA可復(fù)制，或作為染色體外元件或通過染色體整合。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)轉(zhuǎn)化有用的宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。此外，典型地可以使用具有外源DNA轉(zhuǎn)化率高和導(dǎo)入DNA的表達(dá)水平高的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括原核和真核細(xì)胞例如埃希氏桿菌屬種(Escherichia sp.)、假單胞菌屬種(Pseudomonassp.)、芽胞桿菌屬種(Bacillus sp.)、鏈霉菌屬種(Steptomyces sp.)、真菌和酵母、昆蟲細(xì)胞，如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)和動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS 1、COS7、BSC 1、BSC 40和BMT 10。而且，酵母包括假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜氏酵母屬、克盧費(fèi)氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、裂殖酵母屬、亞羅威阿酵母屬、酵母屬種可以優(yōu)選用作根據(jù)本發(fā)明的非可生產(chǎn)蛋白大規(guī)模生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。
在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用前述TFP蛋白重組生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的方法。
重組生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的方法包括制備表達(dá)載體，該表達(dá)載體中插入與編碼TFP蛋白的基因融合的非可生產(chǎn)蛋白編碼基因，和培養(yǎng)用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。詳細(xì)來說，本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的方法，使用具有由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、40或42表示的氨基酸序列，或與其具有優(yōu)選75％，更優(yōu)選85％，甚至更優(yōu)選90％和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白，或使用具有由SEQ ID NO.10表示的基因編碼的氨基酸序列，或與其具有優(yōu)選75％或更高，更優(yōu)選85％或更高，甚至更優(yōu)選90％或更高和最優(yōu)選95％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白。優(yōu)選，SEQ ID NO.1表示的蛋白由SEQ ID NO.2表示的基因編碼，SEQ ID NO.3表示的蛋白由SEQID NO.4表示的基因編碼，SEQ ID NO.5表示的蛋白由SEQ ID NO.6表示的基因編碼，SEQ ID NO.7表示的蛋白由SEQ ID NO.8表示的基因編碼，SEQ ID NO.40表示的蛋白由SEQ ID NO.41表示的基因編碼，SEQ ID NO.42表示的蛋白由SEQ ID NO.43表示的基因編碼。
通過下列實(shí)施例可以更好的理解本發(fā)明，這些實(shí)施例以舉例說明的方式闡述，但不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)化酶缺陷酵母突變株的制備為快速篩選非可生產(chǎn)蛋白的翻譯融合伙伴，通過使用酵母轉(zhuǎn)化酶作為報(bào)道子評(píng)價(jià)蔗糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)來建立自動(dòng)篩選系統(tǒng)。
要求轉(zhuǎn)化酶活性有缺陷的酵母菌株在轉(zhuǎn)化后的篩選時(shí)使用載體中所含轉(zhuǎn)化酶基因作為報(bào)道基因。因此，酵母染色體DNA中INV2基因被刪除。為了制備誘導(dǎo)基因刪除的盒，用EcoRI和XhoI消化pRB58質(zhì)粒(Carlson et al.，Cell，1982，20，145)-，和回收INV2編碼基因并引入pBluescript KS+(Stratagene，美國(guó))的EcoRI/XhoI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pBIΔBX。如圖1所示，在其兩個(gè)末端都具有190bp(Tc190)重復(fù)序列的URA3基因被插入pBIΔBX中所含INV2基因的HindIII-XbaI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pBIU。用EcoRI和XhoI消化pBIU，并轉(zhuǎn)化啤酒酵母Y2805Δgal1(Mat a ura3 INV2 pep4::HIS3 gal1 can1)菌株(SK Rhee，韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology))。在缺乏尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1)。
評(píng)價(jià)所選擇的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以確定它們是否完全喪失轉(zhuǎn)化酶活性。在分別包含葡萄糖和蔗糖作為唯一碳源的兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)單一菌落。結(jié)果，與對(duì)照相比，菌落在葡萄糖培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)非常緩慢。為了研究分泌到培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化酶的量，培養(yǎng)INV2+菌株和Δinv2菌株。在SDS-PAGE上分離培養(yǎng)上清液中所含的蛋白，和在蔗糖溶液中孵育凝膠30分鐘并進(jìn)行使用染料TTC(2，3，5-氯化三苯四唑)的酶譜分析。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)Δinv2菌株喪失了它的大部分轉(zhuǎn)化酶活性。然而，該突變株具有在蔗糖培養(yǎng)基中以非常緩慢的速率生長(zhǎng)的問題。據(jù)信這是因?yàn)橥ㄟ^線粒體的功能，細(xì)胞通過糖異生部分生長(zhǎng)。因此，為解決這個(gè)問題，向培養(yǎng)基中添加抗霉素A-線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑來阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果，在抗霉素A存在下，突變株的生長(zhǎng)完全被抑制(圖3)。
為了再轉(zhuǎn)化所選擇的菌株-帶有含TFP文庫(kù)的URA3載體的Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1)，有必要除去用于刪除INV2基因的URA3基因。為進(jìn)行此過程，在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并選擇喪失URA3基因的細(xì)胞，由此獲得URA3敲除的刪除菌株-Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3inv2::Tc190 pep4::HIS3 gal1 can1)(圖1)。進(jìn)行Southern印跡證實(shí)染色體上INV2基因的刪除，正如所料，和URA3基因的敲除(圖4)。當(dāng)用EcoRI處理釀酒酵母Y2805的染色體DNA并用INV2基因作為探針通過Southern印跡進(jìn)行分析，檢測(cè)到約4.3kb的片段。當(dāng)插入U(xiǎn)RA3基因(Y2805Δgal1Δinv2U)時(shí)，大小增加到約5.0 kb，和當(dāng)URA3基因被敲除(Y2805Δgal1Δinv2)時(shí)降至約3.7 kb。如圖4所示，正如所料，INV2基因明顯被刪除，并且喪失(敲除)了URA3基因。
實(shí)施例2通過與轉(zhuǎn)化酶融合鑒定自動(dòng)篩選系統(tǒng)通過與轉(zhuǎn)化酶融合的蛋白的表達(dá)，使用在酵母中高水平表達(dá)的人蛋白-人血清白蛋白(HSA)和非可生產(chǎn)蛋白-人白介素-2(IL-2)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化酶基因缺陷菌株在蔗糖培養(yǎng)基中被自動(dòng)篩選的可能性。
首先，如下制備其中白蛋白與轉(zhuǎn)化酶融合的pGHSA-INV2載體。為了將SfiI識(shí)別序列插入HSA基因兩端，使用正義引物和反義引物，每個(gè)引物具有SfiI識(shí)別序列，分別是JH97(Sfi-HAS-正向引物)(SEQ ID NO.11)和JH119(Sfi-HSA-反向引物)(SEQ ID NO.12)，pYHSA5(Kang et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，1998，8，42)作為模板和Pfu聚合酶(Stratagene，美國(guó))，進(jìn)行PCR。PCR條件包括1個(gè)循環(huán)的94℃5分鐘，和25個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和72℃2分鐘，隨后是最后1個(gè)循環(huán)的72℃7分鐘。得到大約1.8kb的PCR產(chǎn)物，其是白蛋白基因。分開地，相同條件下使用一組引物通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化酶基因，JH99(Sfi-INV-正向)(SEQ ID NO.13)和JH100(SalI-INV-反向引物)(SEQ ID NO.14)，和pRB58作為模板。用SfiI/SalI處理擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化酶基因，并與PstI/SfiI處理的白蛋白基因一起插入PstI/SalI消化的pBluescript(Stratagene，美國(guó))。然后，用SacI/PstI消化pYHSA5以切除含有GAL啟動(dòng)子和一部分白蛋白基因的片段。這個(gè)片段，以及包含一部分白蛋白基因和轉(zhuǎn)化酶基因的從上面制備的質(zhì)粒切除的PstI-SalI插入物共同連接入YEGα-HIR525載體的SacI/SalI位點(diǎn)(Choi et al.，Appl Microbiol Biotechnol.，1994，42，587)，由此產(chǎn)生pGHSA-INV2。
如下制備IL-2和轉(zhuǎn)化酶的融合表達(dá)載體。通過PCR擴(kuò)增IL-2基因，使用一組引物JH106(Sfi-IL2-正向引物)(SEQ ID NO.15)和JH107(Sfi-IL2-反向引物)(SEQ ID NO.16)，和pT7-hIL-2(JK Jung，Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)作為模板。擴(kuò)增的白介素基因插入pBluescript(Stratagene，美國(guó))的EcoRV位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pBKS-IL2。通過SfiI消化的線性化形式pBKS-IL2和包含GAL啟動(dòng)子和INV分泌信號(hào)的從pGHSA-INV2切除的SacI-SfiI插入物共同連接入pGHSA-INV2的SacI/SfiI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pGIL2-INV2。
表達(dá)白蛋白和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白的pGHSA-INV2載體、表達(dá)IL-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白的pGIL2-INV2，和僅僅表達(dá)轉(zhuǎn)化酶的pRB58逐個(gè)轉(zhuǎn)化刪除其內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶基因并因此不能在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌株(Y2805Δinv2)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基(UD)和含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基(YPSA)上，并觀察它們的生長(zhǎng)(圖5)。當(dāng)用正常表達(dá)轉(zhuǎn)化酶的pRB58載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趦煞N碳源下正常生長(zhǎng)。而且，當(dāng)用其中轉(zhuǎn)化酶與引起轉(zhuǎn)化酶高水平表達(dá)的白蛋白融合的pGHSA-INV2載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，使用兩種碳源它們生長(zhǎng)得都很好。相比之下，當(dāng)用其中轉(zhuǎn)化酶與引起轉(zhuǎn)化酶低表達(dá)的IL-2融合的pGIL2-INV2載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，它們?cè)谄咸烟桥囵B(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而在蔗糖培養(yǎng)基上很少生長(zhǎng)。據(jù)信不能在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的pGIL2-INV2轉(zhuǎn)化細(xì)胞是由于IL-2不能從細(xì)胞中分泌和導(dǎo)致與其融合的轉(zhuǎn)化酶分泌阻斷的結(jié)果。這些結(jié)果表明使用外源轉(zhuǎn)化酶基因?qū)胗捎谄鋬?nèi)源轉(zhuǎn)化酶基因的刪除而不能在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母突變株(Y2805Δinv2)和在其中分泌或不分泌，使得酵母細(xì)胞的自動(dòng)篩選成為可能。
實(shí)施例3使用非可生產(chǎn)蛋白人IL-2制備翻譯融合伙伴篩選載體為了使用其中IL-2與轉(zhuǎn)化酶融合的pGIL2-INV2載體獲得能夠誘導(dǎo)融合蛋白分泌的合適翻譯融合伙伴，制備具有用于制備文庫(kù)的三個(gè)閱讀框的載體pYHTS-F0、F1和F2(圖6)。
使用具有三個(gè)閱讀框和BamHI識(shí)別位點(diǎn)的正義引物，JH120(BamHI-IL2-1-正向引物)(SEQ ID NO.17)、JH121(BamHI-IL2-2-正向引物)(SEQ ID NO.18)和JH122(BamHI-IL2-3-正向引物)(SEQ ID NO.19)，反義引物，JH123(INV-1-反向引物)(SEQID NO.20)，pGIL2-INV2作為模板和Pfu聚合酶(Stratagene，美國(guó))，進(jìn)行PCR。PCR條件包括1個(gè)循環(huán)的94℃3分鐘，和25個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘，隨后是最后1個(gè)循環(huán)的72℃7分鐘。獲得約1.2kb的PCR產(chǎn)物，含有IL-2基因和一部分轉(zhuǎn)化酶基因。分開地，在相同條件下，使用一組引物，JH124(INV-正向引物)(SEQ IDNO.21)和JH95(INV-2-反向引物)(SEQ ID NO.22)，和pGIL2-INV2作為模板，進(jìn)行PCR，由此獲得含有一部分轉(zhuǎn)化酶基因的約0.9kb的片段。從瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物。具有三個(gè)閱讀框的三個(gè)1.2kb片段中的每一個(gè)與0.9kb片段混合后，使用正義引物，JH120(SEQ ID NO.17)、JH121(SEQ ID NO.18)和JH122(SEQ ID NO.19)，和反義引物，JH95(SEQID NO.22)進(jìn)行第二次PCR。通過瓊脂糖電泳獲得約2.1kb的三個(gè)片段。用BamHI和SalI消化三個(gè)回收的2.1kb片段并逐個(gè)插入BamHI和SalI二者消化的pGIL2-INV2，由此產(chǎn)生pYHTS-F0、F1和F2。
實(shí)施例4從酵母基因組制備合適的翻譯融合伙伴文庫(kù)使用來自釀酒酵母Y2805(SK Rhee，韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院)和多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)DL-1(ATCC26012)的染色體DNA制備翻譯融合伙伴文庫(kù)。用Sau3AI部分消化每種染色體DNA后，從瓊脂糖凝膠純化從0.5kb至1.0kb范圍的DNA片段，并與用BamHI消化和小牛腸磷酸酶處理的pYHTS-F0、F1和F2載體的混合物連接(圖6)。然后，用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、0.5％酵母浸膏、1％NaCl)上，并在37℃培養(yǎng)一天。使用從酵母染色體DNA制備的文庫(kù)DNA，獲得約5×104個(gè)轉(zhuǎn)化體的文庫(kù)。使用無菌蒸餾水回收全部轉(zhuǎn)化體，和使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer，韓國(guó))從回收的轉(zhuǎn)化體分離文庫(kù)DNA。
實(shí)施例5適于非可生產(chǎn)蛋白人IL-2的翻譯融合伙伴的自動(dòng)篩選使用醋酸鋰方法(Hills et al.，Nucleic Acids Res.1991，19，5791)，將實(shí)施例4中制備的文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)化啤酒酵母Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3 inv2::Tc190pep4::HIS3 gal1 can1)。然后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在缺乏尿嘧啶的UD基本培養(yǎng)基(0.67％無氨基酸的酵母氮源(yeast nitrogen base、適當(dāng)濃度的各種氨基酸的混合物、2％葡萄糖)和YPGSA培養(yǎng)基上(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％蔗糖、0.3％半乳糖、1μg/ml抗霉素A)，并在30℃培養(yǎng)5天。下表1中給出了在每種培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)量，其中比較了導(dǎo)入翻譯融合伙伴前后轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。當(dāng)僅用用于制備文庫(kù)的載體(pYHTS-F0、F1和F2)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞時(shí)，葡萄糖培養(yǎng)基上約形成1×104個(gè)菌落，但是正如所料蔗糖培養(yǎng)基上沒有細(xì)胞生長(zhǎng)。相比之下，當(dāng)用酵母基因組文庫(kù)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞時(shí)，約11個(gè)轉(zhuǎn)化體在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明在導(dǎo)入的翻譯融合伙伴幫助下，轉(zhuǎn)化酶被分泌。
表1

實(shí)施例6翻譯融合伙伴的分析蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體在YPD培養(yǎng)基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中培養(yǎng)24小時(shí)。收獲培養(yǎng)細(xì)胞后，裂解它們以分離導(dǎo)入的質(zhì)粒。分離的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中再次分離質(zhì)粒，通過限制性酶圖譜評(píng)定基因插入并進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒含有具有不同序列的四個(gè)基因，其充當(dāng)翻譯融合伙伴(表2插入質(zhì)粒的新的翻譯融合伙伴，其中所述質(zhì)粒是從在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體中分離出來的)。
表2

6-1.翻譯融合伙伴1(TFP1)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)翻譯融合伙伴1(TFP1)(SEQ ID NO.2)能夠?qū)L-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白有效分泌到胞外環(huán)境。TFP1基因與釀酒酵母基因Yar066w相同。Yar066w基因類似于α-1，4-葡聚糖-葡糖苷酶(STA1)基因并編碼含有糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白。功能未知的Yar066w基因與功能未知的釀酒酵母基因Yol155c和Yil169c分別具有70.3％和72.7％序列相似性。在Yar066w基因編碼的氨基酸序列中，與IL-2融合的區(qū)域由203個(gè)氨基酸殘基總數(shù)中的105個(gè)氨基酸殘基組成，并含有用于蛋白分泌的23個(gè)氨基酸殘基的分泌信號(hào)、N-糖基化位點(diǎn)和富含絲氨酸/丙氨酸的序列。
6-2.翻譯融合伙伴2(TFP2)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)翻譯融合伙伴2(TFP2)(SEQ ID NO.4)能夠?qū)L-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白有效分泌到胞外環(huán)境。TFP2基因與釀酒酵母基因Yar026c相同。Yar026c基因功能未知。在Yar026c基因編碼的氨基酸序列中，與IL-2融合的區(qū)域由169個(gè)氨基酸殘基總數(shù)中的117個(gè)氨基酸殘基組成，并含有用于蛋白分泌的19個(gè)氨基酸殘基的分泌信號(hào)和三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。
6-3.翻譯融合伙伴3(TFP3)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)翻譯融合伙伴3(TFP3)(SEQ ID NO.6)能夠?qū)L-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白有效分泌到胞外環(huán)境。TFP3基因與釀酒酵母基因Yjl158c(PIR4/CIS3)相同。Yjl158c基因編碼與細(xì)胞壁共價(jià)連接的O-甘露糖基化蛋白。Yjl158c基因被認(rèn)為是參與細(xì)胞分裂的Cik1基因缺陷突變株的多拷貝抑制基因。在Yjl158c基因編碼的氨基酸序列中，與IL-2融合的區(qū)域由227個(gè)氨基酸殘基總數(shù)中的104個(gè)氨基酸殘基組成，并含有用于蛋白分泌的包括23個(gè)氨基酸殘基的前分泌信號(hào)(pre-secretory signal)和包括41個(gè)氨基酸殘基的前分泌信號(hào)(pro-secretory signal)、含Lys-Arg序列的Kex2p的切割位點(diǎn)和PIR重復(fù)序列。
6-4.翻譯融合伙伴4(TFP4)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)翻譯融合伙伴4(TFP4)(SEQ ID NO.8)能夠?qū)L-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白有效分泌到胞外環(huán)境。TFP4基因來源于多形漢遜氏酵母且功能未知。與IL-2融合的區(qū)域由50個(gè)氨基酸殘基組成，其含有18個(gè)氨基酸殘基的蛋白分泌信號(hào)。
實(shí)施例7融合蛋白分泌到培養(yǎng)基的分析為評(píng)價(jià)由蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞分泌的蛋白，含有實(shí)施例6描述的四個(gè)翻譯融合伙伴的酵母細(xì)胞在YPDG培養(yǎng)基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.3％半乳糖)中培養(yǎng)40小時(shí)。除去細(xì)胞后，用丙酮(終濃度40％)沉淀溶于剩余培養(yǎng)上清液中的總蛋白并用SDS-PAGE分析。然而，每個(gè)翻譯融合伙伴不是表現(xiàn)為單一條帶，因?yàn)樵谂c轉(zhuǎn)化酶融合的狀態(tài)下它具有過度糖基化。為解決這個(gè)問題，從每個(gè)載體(pYHTS-TFP1、2、3和4)除去轉(zhuǎn)化酶，將翻譯終止密碼子引入IL-2基因。簡(jiǎn)言之，為從每個(gè)載體獲得包括IL-2基因、含GAL啟動(dòng)子、TFP和翻譯終止密碼子的片段，使用一組引物JH132(SacI-GAL-正向引物)(SEQ ID NO.23)和JH137(IL2-Term-反向引物)(SEQ ID NO.24)進(jìn)行PCR。用SacI/SalI逐個(gè)消化擴(kuò)增的基因片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-TFP1、2、3和4。四個(gè)IL-2表達(dá)載體逐個(gè)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。根據(jù)與上述相同方法培養(yǎng)所得單一菌落，并用SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液(圖7)。如圖7所示，在含IL-2表達(dá)載體除了pYIL-TFP2之外的酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了不同大小的明顯蛋白帶。使用抗IL-2抗體通過Western印跡法證實(shí)了這些條帶(圖7)，由此表明每個(gè)誘導(dǎo)分泌的融合蛋白以與IL-2融合的狀態(tài)存在。然而，SDS-PAGE上融合蛋白的大小與從每個(gè)翻譯融合伙伴和IL-2基因分子量預(yù)測(cè)的不同。這個(gè)差異被認(rèn)為是由于融合蛋白的糖基化。因此，用Endo-H消化每個(gè)融合蛋白并用SDS-PAGE分析(圖8)。在氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)TFP1具有一公認(rèn)的N-糖基化序列(氨基酸殘基28-30)，和含有公認(rèn)的O-糖基化序列的TFP3。發(fā)現(xiàn)TFP4沒有糖基化序列。如所預(yù)料，在pYIL-TFP1表達(dá)的蛋白情況下，發(fā)現(xiàn)Endo-H消化后分子量大大降低，表明pYIL-TFP1表達(dá)的蛋白是N-糖基化的。相比之下，Endo-H消化時(shí)pYIL-TFP3表達(dá)的蛋白分子量沒有改變，因?yàn)樵摰鞍资荗-糖基化的。而且，pYIL-TFP4表達(dá)的蛋白分子量沒有改變。
實(shí)施例8由Kex2p切割的真正蛋白在細(xì)胞中的生產(chǎn)為了生產(chǎn)TFP-IL-2融合蛋白，該蛋白由實(shí)施例7中使用的載體表達(dá)并以與天然人IL-2相同的真正形式分泌到培養(yǎng)基中，將酵母細(xì)胞它們自己產(chǎn)生的Kex2p蛋白酶所識(shí)別的切割位點(diǎn)(Leu-Asp-Lys-Arg)插入TFP和IL-2之間，以便從細(xì)胞中自動(dòng)除去TFP。為將Kex2p切割位點(diǎn)引入pYIL-TFP1，使用pYIL-TFP1作為模板，用兩組引物中的每一組進(jìn)行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY22(TFP1-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.25)、HY23(TFP1-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.26)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用一組引物JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)進(jìn)行第二次PCR，該擴(kuò)增產(chǎn)物是經(jīng)電泳和從凝膠中回收的含GAL啟動(dòng)子和TFP1的片段和含IL-2基因的另一個(gè)片段。用SacI/SalI消化第二次擴(kuò)增的GAL啟動(dòng)子-TFP1-IL2片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-KRTFP1。而且，為將Kex2p切割位點(diǎn)引入pYIL-TFP2，根據(jù)與上所述相同的方法，使用pYIL-TFP2作為模板，用兩組引物進(jìn)行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY20(TFP2-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.27)，與HY21(TFP2-LDKR-正向引物)(SEQID NO.28)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用兩個(gè)擴(kuò)增的基因片段作為模板，用一組引物進(jìn)行第二次PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次擴(kuò)增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-KRTFP2。此外，為將Kex2p切割位點(diǎn)引入pYIL-TFP3，根據(jù)與上所述相同的方法，使用pYIL-TFP3作為模板，用兩組引物進(jìn)行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY17(TFP3-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.38)，和HY18(TFP3-LDKR-正向引物)(SEQ IDNO.39)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用兩個(gè)擴(kuò)增的基因片段作為模板，用一組引物進(jìn)行第二次PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次擴(kuò)增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-KRTFP3。然而進(jìn)一步地，為將Kex2p切割位點(diǎn)引入pYIL-TFP4，根據(jù)與上所述相同的方法，使用pYIL-TFP4作為模板，用兩組引物進(jìn)行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)and HY24(TFP4-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.29)，和HY25(TFP4-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.30)和JH137(SEQID NO.24)。使用兩個(gè)擴(kuò)增的基因片段作為模板，用一組引物進(jìn)行第二次PCR，JH132(SEQID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次擴(kuò)增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-KRTFP4。
在四個(gè)載體當(dāng)中，pYIL-KRTFP1、pYIL-KRTFP3和pYIL-KRTFP4逐個(gè)導(dǎo)入2805Δgal1Δinv2酵母菌株中。挑選單一菌落并在YPDG培養(yǎng)基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.3％半乳糖)中培養(yǎng)40小時(shí)。除去細(xì)胞后，將剩余培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE。如圖9所示，發(fā)現(xiàn)分泌的蛋白與天然人IL-2大小相同。在誘導(dǎo)人IL-2分泌生產(chǎn)的三個(gè)TFPs當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)TFP1在真正的IL-2分泌生產(chǎn)中是最有效的。
pYIL-KRTFP1、pYIL-KRTFP2、pYIL-KRTFP3和pYIL-KRTFP4載體于2003年11月11日保藏在國(guó)際保藏當(dāng)局KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韓國(guó))，和指定保藏號(hào)分別為KCTC 10544BP、10545BP、10546BP和10546BP。
實(shí)施例9翻譯融合伙伴1(TFP1)的特征分析評(píng)價(jià)被認(rèn)為誘導(dǎo)IL-2分泌生產(chǎn)最有效的翻譯融合伙伴的TFP1，以確定TFP1序列上存在的任何特定序列，分泌信號(hào)(a)、N-糖基化位點(diǎn)(b)、富含絲氨酸/丙氨酸的序列(c)、其余序列(d)和5’-UTR(5’-非翻譯區(qū))(e)上是否直接影響非可生產(chǎn)蛋白IL-2的分泌。為進(jìn)行此過程，如圖10所示，制備每個(gè)特定序列被刪除的TFP1基因缺失突變體。首先，為從TFP1序列除去沒有獨(dú)特性質(zhì)的其余序列(d)，使用pYIL-KRTFP1作為模板，用一組引物進(jìn)行PCR，JH143(XbaI-TFP1-d-反向引物)(SEQ ID NO.31)和JH132(SEQ ID NO.23)。擴(kuò)增的DNA片段含有TFP1-1，其GAL啟動(dòng)子和TFP1序列的(d)序列被刪除。為從TFP1序列除去其余序列(d)和富含絲氨酸/丙氨酸的序列(c)，使用pYIL-KRTFP1作為模板，用一組引物進(jìn)行PCR，JH142(XbaI-TFP1-c-反向引物)(SEQ ID NO.32)和JH132(SEQ IDNO.23)。擴(kuò)增的片段含有TFP1-2，其GAL啟動(dòng)子、(c)序列和(d)序列被刪除。而且，為從TFP1序列除去(d)序列、(c)序列和N-糖基化位點(diǎn)(b)，使用pYIL-KRTFP1作為模板，用一組引物進(jìn)行PCR，JH141(XbaI-TFP1-b-反向引物)(SEQ ID NO.33)和JH132(SEQ IDNO.23)。擴(kuò)增的片段含有TFP1-3，其GAL啟動(dòng)子、(c)、(d)和(b)序列被刪除。為將Kex2p切割位點(diǎn)引入IL-2基因，使用pYIL-KRTFP1作為模板，用一組引物進(jìn)行PCR，JH140(SpeI-XbaI-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.34)和JH137(SEQ ID NO.24)。純化擴(kuò)增的IL-2片段，用SpeI和SalI消化，并與三個(gè)獲得的片段(TFP1-1、2和3)中的每一個(gè)一起用SacI和XbaI消化，插入SacI和SalI預(yù)先消化的YEGα-HIR525載體，由此分別產(chǎn)生如圖10所示的pYIL-KRT1-1、pYIL-KRT1-2和pYIL-KRT1-3。為除去TFP1的5’-UTR，使用pYIL-KRTFP1作為模板，用一組引物HY38(TFP1-UTR-正向引物)(SEQ ID NO.35)和JH137(SEQ ID NO.24)進(jìn)行PCR。純化擴(kuò)增的基因，用BamHI/SalI消化，并與SacI/BamHI消化的GALL0啟動(dòng)子一起連接入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525載體，由此產(chǎn)生pYIL-KRT1-4(圖10)。
四個(gè)質(zhì)粒pYIL-KRT1-1、pYIL-KRT1-2、pYIL-KRT1-3和pYIL-KRT1-4轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。培養(yǎng)單一菌落，并將培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE。如圖11所示，僅僅在含全部分泌序列、N-糖基化位點(diǎn)和富含絲氨酸/丙氨酸序列的pYIL-KRT1-3轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)IL-2條帶。在刪除富含絲氨酸/丙氨酸序列的pYIL-KRT1-2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和富含絲氨酸/丙氨酸序列和N-糖基化位點(diǎn)都刪除的pYIL-KRT1-1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中沒有觀察到IL-2條帶。這些結(jié)果表明存在于TFP1中的三個(gè)特征序列(分泌序列、N-糖基化位點(diǎn)和富含絲氨酸/丙氨酸的序列)是有效誘導(dǎo)IL-2分泌所必需的。而且，當(dāng)TFP1的5’-UTR被刪除時(shí)，蛋白表達(dá)水平增加約三倍以上。
pYIL-KRT1-3和pYIL-KRT1-4載體于2003年11月11日保藏在國(guó)際保藏當(dāng)局KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韓國(guó))，和指定保藏號(hào)分別為KCTC 10548BP和10549BP。
實(shí)施例10使用翻譯融合伙伴TFP1-4的人IL-2發(fā)酵生產(chǎn)在5-L發(fā)酵罐中通過分批補(bǔ)料培養(yǎng)法培養(yǎng)pYIL-KRT1-4載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株，以評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)IL-2分泌生產(chǎn)的能力。待接種于發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)物在燒瓶中培養(yǎng)，使用種子培養(yǎng)基(6.7％無氨基酸的酵母氮源、0.5％酪蛋白氨基酸和2％葡萄糖)。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)作為最初發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)物OD600達(dá)到約15時(shí)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率以各種補(bǔ)充量分批補(bǔ)料培養(yǎng)基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。約64小時(shí)培養(yǎng)期后，培養(yǎng)物OD600達(dá)到約200。在給定時(shí)間點(diǎn)收集5μl培養(yǎng)基并用SDS-PAGE確定分泌的蛋白(圖12)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，發(fā)現(xiàn)約500mg/L IL-2分泌到培養(yǎng)基中。通過氨基末端序列分析發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵中作為分泌產(chǎn)物產(chǎn)生的IL-2具有Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser的氨基末端序列，表明它與人體中分泌的天然IL-2相同。
實(shí)施例11翻譯融合伙伴TFP1至4分泌人G-CSF能力的比較為了確定使用非可生產(chǎn)蛋白人IL-2獲得的四個(gè)翻譯融合伙伴(TFP1、2、3和4)在其它非可生產(chǎn)人蛋白分泌中是否有效，將四個(gè)TFPs中的每一個(gè)與非可生產(chǎn)蛋白人G-CSF融合，在酵母細(xì)胞中表達(dá)并評(píng)價(jià)它的分泌。如下獲得人G-CSF基因。使用人cDNA文庫(kù)用一組引物JH144(GCSF-正向引物)(SEQ ID NO.36)和JH145(GCSF-反向引物)(SEQ ID NO.37)進(jìn)行PCR。用XbaI/SalI消化擴(kuò)增的基因并插入pYIL-KRTFP1、2、3和4中每一個(gè)的XbaI/SalI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pYGCSF-TFP1、2、3和4。
為在酵母細(xì)胞中表達(dá)人G-CSF，pYGCSF-TFP1、2、3和4載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。分離單一菌落并培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE和使用抗G-CSF抗體的Western印跡。圖13中給出了結(jié)果。每一TFPs產(chǎn)生了作為分泌產(chǎn)物的G-CSF，并發(fā)現(xiàn)TFP1和TFP3有效誘導(dǎo)G-CSF的分泌生產(chǎn)。尤其是，用抗G-CSF抗體(Chemicon，美國(guó))的Western印跡證明TPF3在G-CSF的分泌生產(chǎn)中是最有效的。因此，因?yàn)楦鶕?jù)蛋白類型，證明四個(gè)TFPs中的每一個(gè)發(fā)揮了最大分泌效率，所以認(rèn)為本發(fā)明的四個(gè)TFPs作為能夠分泌除IL-2和G-CSF之外的各種非可生產(chǎn)蛋白的翻譯融合伙伴是非常有效的。
實(shí)施例12使用翻譯融合伙伴TFP3的人G-CSF發(fā)酵生產(chǎn)在5-L發(fā)酵罐中通過分批補(bǔ)料培養(yǎng)法培養(yǎng)實(shí)施例11中制備的pYGCSF-TFP3載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株，以評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)人G-CSF分泌生產(chǎn)的能力。待接種于發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)物在燒瓶中培養(yǎng)，使用種子培養(yǎng)基(6.7％無氨基酸的酵母氮源、0.5％酪蛋白氨基酸和2％葡萄糖)。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)作為最初發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)物OD600達(dá)到約15時(shí)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率以各種補(bǔ)充量分批補(bǔ)料培養(yǎng)基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。約64小時(shí)培養(yǎng)期后，培養(yǎng)物OD600達(dá)到約200。在給定時(shí)間點(diǎn)收集5μl培養(yǎng)基并用SDS-PAGE確定分泌的蛋白(圖14)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，發(fā)現(xiàn)約300mg/L人G-CSF分泌到培養(yǎng)基中。通過氨基末端序列分析發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵中作為分泌產(chǎn)物產(chǎn)生的人G-CSF具有Thr-Pro-Leu-Gly-Pro的氨基末端序列，表明它與人體中分泌的天然G-CSF相同。
實(shí)施例13翻譯融合伙伴TPF3衍生物對(duì)人G-CSF的分泌效率分析由于發(fā)現(xiàn)TFP3對(duì)實(shí)施例11中G-CSF最佳分泌是最有效的，因此通過PCR從釀酒酵母基因組獲得全部TFP3衍生基因Yjl158c(CIS3)。如圖15所示，制備了具有不同長(zhǎng)度的六個(gè)TFP3衍生物TFP3-1、2、3和4、TFP3-1-1(SEQ ID NO.40)和TFP3-1-2(SEQ IDNO.42)。主要獲得的TFP3由Yjl158c(CIS3)227個(gè)氨基酸總數(shù)中的104個(gè)氨基酸組成。制備了長(zhǎng)度逐漸增加的產(chǎn)物TFP3-1(130個(gè)氨基酸)、TFP3-2(157個(gè)氨基酸)、TFP3-3(189個(gè)氨基酸)和TFP3-4(222個(gè)氨基酸)。TFP3衍生物逐個(gè)與G-CSF基因連接，和Kex2p切割位點(diǎn)插入融合位點(diǎn)。如圖15的A板所示，與TFP3相比另外含有26個(gè)氨基酸的TFP3-1使G-CSF分泌增加約三倍，因?yàn)樗cTFP3相比，含有N-糖基化位點(diǎn)。相比之下，當(dāng)TFP3長(zhǎng)度進(jìn)一步增加時(shí)，G-CSF分泌率沒有變化，或在TFP3-3和TFP3-4的情況下，發(fā)現(xiàn)G-CSF分泌率減少。
此外，如圖15的A板所示，Kex2p沒有完全切割的未處理形式的TFP3-1-GCSF融合蛋白以隨表達(dá)和分泌效率增加而增加的方式分泌到培養(yǎng)基?？紤]這是因?yàn)樘遣糠痔砑拥絻蓚€(gè)基因融合位點(diǎn)中存在的許多O-糖基化位點(diǎn)，打斷了Kex2p切割融合位點(diǎn)的步驟。在這點(diǎn)上，制備了與TFP3相比添加了4個(gè)氨基酸的TFP3-1-1(134個(gè)氨基酸)，和與TFP3相比添加了13個(gè)氨基酸的TFP3-1-2(143個(gè)氨基酸)并評(píng)價(jià)了它們分泌G-CSF的能力和以融合形式表達(dá)的降低。如圖15的B板所示，TFP3-1-1和TFP3-1-2與G-CSF的融合形式大大減少，而G-CSF分泌沒有減少。這些結(jié)果表明通過靶蛋白和每個(gè)獲得的TFPs之間融合位點(diǎn)的精心操作，靶蛋白分泌率可以更加提高。
兩個(gè)G-CSF表達(dá)載體，分別含有翻譯融合伙伴TFP3-1-1和TFP3-1-2的pYGT3-1-1-GCSF和pYGT3-1-2-GCSF分別于2004年12月21日保藏在國(guó)際保藏當(dāng)局KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韓國(guó))，并指定保藏號(hào)分別為KCTC 10753BP和KCTC 10754BP。
實(shí)施例14使用翻譯融合伙伴TFP3的工業(yè)脂肪酶分泌生產(chǎn)XbaI/SalI消化pYGA-CalB14(ES Choi，韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院)獲得的CalB基因插入G-CSF表達(dá)載體pYGCSF-KRTFP3的XbaI/SalI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pYGT3-CalB14。將pYGT3-CalB14載體與pYGA-CalB14載體的與培養(yǎng)溫度有關(guān)的CalB14分泌率相比較。當(dāng)使用TFP3生產(chǎn)作為分泌產(chǎn)物的CalB14時(shí)，其分泌率比傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)在30℃最適培養(yǎng)溫度下高兩倍以上(表3含有每個(gè)表達(dá)載體的酵母細(xì)胞依培養(yǎng)溫度的CalB活性)表3

在5-L發(fā)酵罐中通過分批補(bǔ)料培養(yǎng)法在30℃最適溫度下培養(yǎng)含pYGT3-CalB14載體的重組酵母菌株，以評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)CalB14分泌生產(chǎn)的能力。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)的培養(yǎng)OD600達(dá)到約15時(shí)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率以各種補(bǔ)充量分批補(bǔ)料培養(yǎng)基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。重組酵母菌株生長(zhǎng)非?？焖俸筒桓淖兣囵B(yǎng)溫度下將CalB14高效率分泌到培養(yǎng)基。蛋白活性和濃度分析顯示約1.5-2.0g/L CalB14分泌到培養(yǎng)基，因此使得成本效益高的大規(guī)模生產(chǎn)CalB14成為可能(圖16)。
實(shí)施例15翻譯融合伙伴TFP1在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中活性評(píng)價(jià)為了確定本發(fā)明開發(fā)的TFPs是否在另一種酵母-巴斯德畢赤氏酵母中有功能，用BglII/EcoRI消化另一個(gè)巴斯德畢赤氏酵母載體pPIC9(Invitrogen，美國(guó))以除去AOX啟動(dòng)子，其中插入了使用BglII-GAP-正向引物(SEQ ID NO.44)和GAP-EcoRI-反向引物(SEQID NO.45)獲得的GAP(3-磷酸甘油醛脫氫酶)啟動(dòng)子，由此產(chǎn)生pPIC9-GAP。用EcoRI-NotI消化這個(gè)載體并與每個(gè)EcoRI-NotI消化的Mfalpha(交配因子α)-GCSF和TFP1-GCSF基因連接，由此產(chǎn)生pGAP-MF-GCSF和pGAP-TFP1-GCSF。用SalI逐個(gè)消化這些載體并轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤氏酵母GS115(Invitrogen，美國(guó))。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在燒瓶中培養(yǎng)，并用SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液G-CSF分泌以選擇最后的轉(zhuǎn)化體。使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4％酵母浸膏、1％胰蛋白胨(bactopeptone)、4％甘油)，在發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)每個(gè)載體轉(zhuǎn)化的所選轉(zhuǎn)化體。在給定時(shí)間點(diǎn)收集樣品，并用SDS-PAGE分析G-CSF分泌(圖17)。如圖17所示，TFP1比Mfalpha分泌效率高。這些結(jié)果表明得自釀酒酵母的TFPs在巴斯德畢赤氏酵母中也非常有用。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明通過快速篩選和使用合適的TFPs，允許以成本效益高的方式大規(guī)模生產(chǎn)不能重組生產(chǎn)或低水平表達(dá)的各種蛋白。








序列表<110>韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院<120>用于生產(chǎn)重組蛋白的翻譯融合伙伴的快速篩選方法和由此篩選的翻譯融合伙伴<150>KR10-2004-0003610<151>2004-01-17<150>KR10-2004-0003957<151>2004-01-19<160>45<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>105<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(105)<223>TFP1<400>1Met Phe Asn Arg Phe Asn Lys Phe Gln Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Ser Arg Gly Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Ser20 25 30Ala Asp Leu Ser Ser Ile Thr Ser Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala35 40 45Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Ser Ser Asp Gly Thr Val Tyr Leu Pro50 55 60Ser Thr Thr Ile Ser Gly Asp Leu Thr Val Thr Gly Lys Val Ile Ala65 70 75 80Thr Glu Ala Val Glu Val Ala Ala Gly Gly Lys Leu Thr Leu Leu Asp85 90 95Gly Glu Lys Tyr Val Phe Ser Ser Asp100 105<210>2
<211>430<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(430)<223>TFP1<400>2gatcgtcata ttcactcttg ttctcataat agcagtccaa gttttcatct ttgcaagctt60tactatttct ttctttttat tggtaaactc tcgcccatta caaaaaaaaa agagatgttc 120aatcgtttta acaaattcca agctgctgtc gctttggccc tactctctcg cggcgctctc 180ggtgactctt acaccaatag cacctcctcc gcagacttga gttctatcac ttccgtctcg 240tcagctagtg caagtgccac cgcttccgac tcactttctt ccagtgacgg taccgtttat 300ttgccatcca caacaattag cggtgatctc acagttactg gtaaagtaat tgcaaccgag 360gccgtggaag tcgctgccgg tggtaagttg actttacttg acggtgaaaa atacgtcttc 420tcatctgatc 430<210>3<211>117<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(117)<223>TFP2<400>3Met Thr Pro Tyr Ala Val Ala Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Val Thr1 5 10 15Val Ser Ala Leu Gln Val Asn Asn Ser Cys Val Ala Phe Pro Pro Ser20 25 30Asn Leu Arg Gly Lys Asn Gly Asp Gly Thr Asr Glu Gln Tyr Ala Thr35 40 45Ala Leu Leu Ser Ile Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ser Leu Arg Asp50 55 60Ile Asn Leu Ile Glu Leu Glu Pro Gln Val Ala Leu Tyr Leu Leu Glu6570 75 80
Asn Tyr Ile Asn His Tyr Tyr Asn Thr Thr Arg Asp Asn Lys Cys Pro85 90 95Asn Asn His Tyr Leu Met Gly Gly Gln Leu Gly Ser Ser Ser Asp Asn100 105 110Arg Ser Leu Asn Asp115<210>4<211>424<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(424)<223>TFP2<400>4gatctcattg gattcaagag aaagaaactc tatactggcg ccaaattagc agtgtcaaat60ttcgaaaagg tgatgacgcc ctatgcagta gcaattaccg tggccttact aattgtaaca 120gtgagcgcac tccaggtcaa caattcatgt gtcgcttttc cgccatcaaa tctcagaggc 180aaaaatggag acggtactaa tgaacagtat gcaactgcac tactttctat tccctggaat 240ggacctcctg agtcattgag ggatattaat cttattgaac tcgaaccgca agttgcactc 300tatttgctcg aaaattatat taaccattac tacaacacca caagagacaa taagtgccct 360aataaccact acctaatggg agggcagttg ggtagctcat cggataatag gagtttgaac 420gatc424<210>5<211>104<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(104)<223>TFP3<400>5Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15
Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr20 25 30Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr35 40 45Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg50 55 60Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala65 70 75 80Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala85 90 95Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Ile100<210>6<211>642<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(642)<223>TFP3<400>6gatcccgcct agcccttcca gcttttcttt ttcccctttt gctacggtcg agacacggtc60gcccaaaaga aacgggtcag cgtgtactgc gccaaaaaaa ttcgcgccga tttaagctaa 120acgtccacaa acaaaaacaa aaataagaaa taggttgaca gtgggtgaaa aattctcgaa 180ggtttcatct ccaaacagtc agtatataag tattcgggaa agagagccaa tctatcttgt 240ggtgggtcta tcttaacctt ctctttttgg cagtagtaat tgtaaatcaa gacacataaa 300actatttcac tcgctaaact tacatctaaa atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc 360tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg 420tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt 480ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt 540ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc 600caagctacta ctaccgctac cccaaccagc tccgaaaaga tc 642
<210>7<211>50<212>PRT<213>多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)<220>
<221>肽<222>(1)..(50)<223>TFP4<400>7Met Arg Phe Ala Glu Phe Leu Val Val Phe Ala Thr Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Met Ala Ala Pro Val Glu Ser Leu Ala Gly Thr Gln Arg Tyr Leu Val20 25 30Gln Met Lys Glu Arg Phe Thr Thr Glu Lys Leu Cys Ala Leu Asp Asp35 40 45Lys Ile50<210>8<211>179<212>DNA<213>多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)<220>
<221>基因<222>(1)..(179)<223>TFP4<400>8gatccgcttt ttattgcttt gctttgctaa tgagatttgc agaattcttg gtggtatttg60ccacgttagg cggggggatg gctgcaccgg ttgagtctct ggccgggacc caacggtatc 120tggtgcaaat gaaggagcgg ttcaccacag agaagctgtg tgctttggac gacaagatc179<210>9<211>71<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(71)<223>TFP1-3<400>9Met Phe Asn Arg Phe Asn Lys Phe Gln Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Ser Arg Gly Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Ser20 25 30Ala Asp Leu Ser Ser Ile Thr Ser Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala35 40 45Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Ser Ser Asp Gly Thr Val Tyr Leu Pro50 55 60Ser Thr Thr Ile Ser Gly Asp65 70<210>10<211>329<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(329)<223>TFP1-4<400>10ggatccatgt tcaatcgttt taacaaattc caagctgctg tcgctttggc cctactctct60cgcggcgctc tcggtgactc ttacaccaat agcacctcct ccgcagactt gagttctatc 120acttccgtct cgtcagctag tgcaagtgcc accgcttccg actcactttc ttccagtgac 180ggtaccgttt atttgccatc cacaacaatt agcggtgatc tcacagttac tggtaaagta 240attgcaaccg aggccgtgga agtcgctgcc ggtggtaagt tgactttact tgacggtgaa 300aaatacgtct tctcatctga tcctctaga 329<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH97(Sfi-HSA-正向引物)<400>11ccggccatta cggccgtgat gcacacaaga gtgag35<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH119(Sfi-HSA-反向引物)<400>12ccggccgagg cggcctaagc ctaaggcag29<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH99(Sfi-INV-正向引物)<400>13gggcggccgc ctcggcccta gataaaaggt caatgacaaa cgaaactagc50<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH100(SalI-INV-反向引物)<400>14ccgtcgactt actattttac ttcccttact tg32<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH106(Sfi-IL2-正向引物)<400>15gcggccatta cggccgtgca cctacttcaa gttctac37<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH107(Sfi-IL2-反向引物)<400>16gcggccatta cggccgtgca cctacttcaa gttctac37<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH120(BamHI-IL2-1-正向引物)<400>17cgggatccgc acctacttca agttct26<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH121(BamHI-IL2-2-正向引物)<400>18cgggatcctg cacctacttc aagttct27<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH122(BamHI-IL2-3-正向引物)<400>19cgggatcctt gcacctactt caagttct<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH123(INV-1-反向引物)<400>20ccattgaagg aaccaacaaa at22<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH124(INV-正向引物)<400>21attttgttgg ttccttcaat gg22<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH95(INV-2-反向引物)<400>22ggctcgagct attttacttc ccttacttg29<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH132(SacI-GAL-正向引物)<400>23gggagctcat cgcttcgctg att23<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH137(IL-2-Term-反向引物)<400>24ccgtcgactt aagttagtgt tgagatg27<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY22(TFP1-LDKR-反向引物)<400>25gaacttgaag taggtgccct tttatctaga ggatcagatg agaagac47<210>26<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY23(TFP1-LDKR-正向引物)<400>26tcttctcatc tgatcctcta gataaaaggg cacctacttc aagttc46<210>27<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY20(TFP2-LDKR-反向引物)<400>27gaacttgaag taggtgccct tttatctaga ggatcgttca aactcc46<210>28<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY21(TFP2-LDKR-正向引物)<400>28ggagtttgaa cgatcctcta gataaaaggg cacctacttc aagttc46<210>29<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY24(TFP4-LDKR-反向引物)<400>29gaacttgaag taggtgccct tttatcaagg atcttgtcgt ccaaagc47<210>30<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY25(TFP4-LDKR-正向引物)<400>30gctttggacg acaagatcct tgataaaagg gcacctactt caagttc47<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH143(XbaI-TFP1-d-反向引物)<400>31cctctagaat caccgctaat tgttgtg27<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH142(XbaI-TFP1-c-反向引物)<400>32cctctagagg tgctattggt gtaagag27<210>33<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH141(XbaI-TFP1-b-反向引物)<400>33cctctagaac cgagagcgcc gcgagag27<210>34<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH140(SpeI-XbaI-LDKR-正向引物)<400>34ggactagtct agataaaagg gcacc25<210>35<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY38(TFP1-UTR-正向引物)<400>35gaatttttga aaattcaagg atccatgttc aatcgtttta ac42<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH144(GCSF-正向引物)<400>36cctctagata aaaggacccc cctgggccct gcc33<210>37<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>JH145(GCSF-反向引物)<400>37ggcagctgga tgtattttac atggggag28<210>38<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY17(TFP3-LDKR-反向引物)<400>38gaacttgaag taggtgccct tttatcaagg atcttttcgg agc43<210>39<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HY18(TFP3-LDKR-正向引物)<400>39gctccgaaaa gatccttgat aaaagggcac ctacttcaag ttc43<210>40<211>134<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(134)<223>TFP3-1-1<400>40Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr20 25 30Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr35 40 45Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg50 55 60Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala65 70 75 80Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala85 90 95Thr Pro Thr Set Ser Glu Lys Ile Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Ser100 105 110Thr Asn Ala Thr Ser Ser Ser Cys Ala Thr Pro Ser Leu Lys Asp Ser115 120 125Ser Cys Lys Asn Ser Gly130<210>41<211>402<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(402)<223>TFP3-1-1<400>41atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct60gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc 300tccgaaaaga tctcttcctc tgcatctaaa acatctacta atgccacatc atcttcttgt 360gccactccat ctttgaaaga tagctcatgt aagaattctg gt 402<210>42<211>143<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>肽<222>(1)..(143)<223>TFP3-1-2<400>42Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr20 25 30Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr35 40 45Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg50 55 60Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala65 70 75 80Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala85 90 95Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Ile Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Ser100 105 110
Thr Asn Ala Thr Ser Ser Ser Cys Ala Thr Pro Ser Leu Lys Asp Ser115 120 125Ser Cys Lys Asn Ser Gly Thr Leu Glu Leu Thr Leu Lys Asp Gly130 135 140<210>43<211>429<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>基因<222>(1)..(429)<223>TFP3-1-2<400>43atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct60gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc 300tccgaaaaga tctcttcctc tgcatctaaa acatctacta atgccacatc atcttcttgt 360gccactccat ctttgaaaga tagctcatgt aagaattctg gtaccttaga attgaccttg 420aaggacggt 429<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BglII-GAP-正向引物<400>44gcaagatctg gatccttttt tgtag25<210>45
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GAP-EcoRI-反向引物<400>45aagaattctt gatagttgtt caattg2權(quán)利要求
1.一種篩選生產(chǎn)非可生產(chǎn)蛋白的翻譯融合伙伴(TFP)的方法，包括(1)制備包括融合基因(X-R)的自動(dòng)篩選載體，其中編碼非可生產(chǎn)靶蛋白的基因(X)與報(bào)道基因(R)符合讀框地連接用于自動(dòng)篩選；(2)將包括能誘導(dǎo)非可生產(chǎn)融合蛋白(X-R)分泌的TFP的基因文庫(kù)與自動(dòng)篩選載體連接產(chǎn)生TFP文庫(kù)；(3)用TFP文庫(kù)轉(zhuǎn)化無報(bào)道基因活性的細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)道蛋白活性；和(4)從發(fā)揮報(bào)道蛋白活性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離基因并分析TFP性能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的報(bào)道基因是選自轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半乳糖苷酶、蔗糖酶、纖維素酶、木聚糖酶和麥芽糖酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的非可生產(chǎn)蛋白選自細(xì)胞因子、血清蛋白、免疫球蛋白、干擾素、集落刺激因子、干細(xì)胞因子(SCF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰島素、腫瘤壞死因子(TNF)、生長(zhǎng)因子、乳鐵蛋白、激素、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGPR)、腦啡肽、促生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原激活物、生長(zhǎng)激素釋放肽(GHPR)、胸腺體液因子(THF)、抗癌或抗菌肽、碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的具有TFP的基因文庫(kù)來源于假絲酵母屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克盧費(fèi)氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、亞羅威阿酵母屬(Yarrowia)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉菌屬(Rhizopus)、和木霉屬(Trichoderma)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的無報(bào)道基因活性的細(xì)胞選自假絲酵母屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克盧費(fèi)氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、亞羅威阿酵母屬(Yarrowia)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉菌屬(Rhizopus)、和木霉屬(Trichoderma)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的篩選載體包含啟動(dòng)子基因、刪除了翻譯起始和終止密碼子的編碼靶蛋白的基因、和與編碼靶蛋白的基因符合讀框融合的報(bào)道基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的篩選載體中含有的啟動(dòng)子選自GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1和GAL10。
8.一種篩選翻譯融合伙伴的方法，包括(1)制備刪除其內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶基因INV2(I)的酵母突變株；(2)制備含有基因(X-I)的酵母高產(chǎn)量選擇(HTS)載體，其中轉(zhuǎn)化酶基因(I)與非可生產(chǎn)蛋白基因(X)符合讀框地融合且在酵母GAL10啟動(dòng)子控制下表達(dá)；(3)制備能夠分泌pYHTS載體中轉(zhuǎn)化酶和非可生產(chǎn)蛋白融合基因(X-I)的來自酵母基因的翻譯融合伙伴文庫(kù)；(4)將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化步驟(1)制備的酵母突變株并在僅含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行自動(dòng)篩選；(5)通過培養(yǎng)在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞檢測(cè)分泌到培養(yǎng)基上的蛋白；和(6)從酵母細(xì)胞分離基因并分析翻譯融合伙伴的性能。
9.一種翻譯融合伙伴(TFP)蛋白，選自(a)翻譯融合伙伴TFP1蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP1蛋白具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1蛋白活性的氨基酸序列；(b)翻譯融合伙伴TFP2蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP2蛋白具有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP2蛋白活性的氨基酸序列；(c)翻譯融合伙伴TFP3蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP3蛋白具有SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3蛋白活性的氨基酸序列；(d)翻譯融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP4蛋白活性的氨基酸序列；(e)翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白具有SEQ IDNO.9表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白活性的的氨基酸序列；(f)翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白具有SEQ IDNO.10表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白活性的氨基酸序列；(g)翻譯融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.40表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白活性的氨基酸序列；和(h)翻譯融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻譯融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.42表示的氨基酸序列或與其具有90％或更高同源性且發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白活性的氨基酸序列；
10.一種翻譯融合伙伴(TFP)基因，選自(a)編碼由SEQ ID NO.1表示的翻譯融合伙伴TFP1蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1蛋白活性的蛋白的DNA；(b)編碼由SEQ ID NO.3表示的翻譯融合伙伴TFP2蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP2蛋白活性的蛋白的DNA；(c)編碼由SEQ ID NO.5表示的翻譯融合伙伴TFP3蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3蛋白活性的蛋白的DNA；(d)編碼由SEQ ID NO.7表示的翻譯融合伙伴TFP4蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP4蛋白活性的蛋白的DNA；(e)編碼由SEQ ID NO.9表示的翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1-3蛋白活性的蛋白的DNA；(f)由SEQ ID NO.10表示的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP1-4蛋白活性的蛋白的DNA；(g)編碼由SEQ ID NO.40表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3-1-1蛋白活性的蛋白的DNA；和(h)編碼由SEQ ID NO.42表示的翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白的DNA或與其具有90％或更高同源性且編碼發(fā)揮翻譯融合伙伴TFP3-1-2蛋白活性的蛋白的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的翻譯融合伙伴(TFP)基因，該基因選自SEQ ID NOS.2、4、6、8、41和43的DNA。
12.一種重組載體，包含選自權(quán)利要求10(a)至(h)所述的DNA的基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組載體，該重組載體包含選自SEQ ID NOS.2、4、6、8、41和43的DNA的基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其中該載體選自pYIL-KRTFP1(KCTC 10544BP)、pYIL-KRT1-3(KCTC 10548BP)、pYIL-KRT1-4(KCTC 10549BP)、pYIL-KRTFP2(KCTC10545BP)、pYIL-KRTFP3(KCTC 10546BP)、pYGT3-1-1-GCSF(KCTC 10753BP)、pYGT3-1-2-GCSF(KCTC 10754BP)和pYIL-KRTFP4(KCTC 10547BP)。
15.用權(quán)利要求12所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體選自假絲酵母屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克盧費(fèi)氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、亞羅威阿酵母屬(Yarrowia)、酵母屬(Saccharomyces).
17.一種制備非可生產(chǎn)蛋白的方法，包括構(gòu)建攜帶編碼非可生產(chǎn)蛋白的基因的表達(dá)載體，所述的編碼非可生產(chǎn)蛋白的基因與編碼權(quán)利要求9所述的翻譯融合伙伴(TFP)蛋白的基因融合，和培養(yǎng)用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從各種遺傳來源快速篩選能夠誘導(dǎo)非可生產(chǎn)蛋白表達(dá)或分泌生產(chǎn)的合適翻譯融合伙伴(TFPs)的方法，該非可生產(chǎn)蛋白難以以傳統(tǒng)重組生產(chǎn)方法來生產(chǎn)，和使用該方法獲得的誘導(dǎo)蛋白分泌的TFPs。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1954083SQ200480040572
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月17日
發(fā)明者孫廷薰, 崔毅星, 裴貞勛, 李應(yīng)碩, 申美景 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院