專利名稱：改良的多色實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)PCR的領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及進(jìn)行多重實(shí)時(shí)PCR的系統(tǒng)。
現(xiàn)有技術(shù)背景通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA是分子生物學(xué)的基本技術(shù)。通過PCR的核酸分析需要樣品制備、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。盡管這些步驟通常是順序地進(jìn)行，但是可同時(shí)發(fā)生擴(kuò)增和分析。擴(kuò)增前可將DNA染料或熒光探針添加到PCR混合物中，并在擴(kuò)增期間用于分析PCR產(chǎn)物。樣品分析與擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生在同一儀器內(nèi)的同一試管中。這種結(jié)合的方法由于不必將樣品從它們密閉的容器中移出用于進(jìn)一步分析，所以減少了樣品處理、節(jié)約了時(shí)間，以及極大地減少了用于隨后反應(yīng)的產(chǎn)物被污染的風(fēng)險(xiǎn)。將擴(kuò)增和產(chǎn)物分析結(jié)合的概念已經(jīng)被稱作“實(shí)時(shí)”PCR。見，例如，美國(guó)專利No.6,174,670。
在每個(gè)PCR循環(huán)期間監(jiān)控?zé)晒庾畛跎婕笆褂娩寤义V。(HiguchiR，G Dollinger，PS Walsh和R.Griffith，Simultaneous amplificationand detection of specific DNA sequences，Bio/Technology 10(1992)413-417；Higuchi R，CFockler G Dollinger和R Watson，Kinetic PCRanalysisreal time monitoring of DNA amplification reactions，Bio/Technology 11(1993)1026-1030)。在該系統(tǒng)中，每個(gè)循環(huán)測(cè)量一次熒光作為產(chǎn)物濃度的相對(duì)測(cè)量值。溴化乙錠檢測(cè)雙鏈DNA；如果存在模板，那么熒光強(qiáng)度隨著溫度循環(huán)而增加。此外，首先檢測(cè)到熒光增加的循環(huán)數(shù)與最初模板濃度的對(duì)數(shù)成反比地增加。已經(jīng)開發(fā)了能提供關(guān)于核酸濃度和序列的另外數(shù)據(jù)的其它熒光系統(tǒng)。
在動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)PCR中，在每個(gè)PCR循環(huán)中監(jiān)控PCR產(chǎn)物的形成。在擴(kuò)增反應(yīng)期間，通常在具有另外用于測(cè)量熒光信號(hào)的裝置的熱循環(huán)儀中測(cè)量擴(kuò)增。
實(shí)時(shí)PCR儀器現(xiàn)有技術(shù)中已知幾種類型的實(shí)時(shí)檢測(cè)熱循環(huán)儀。
例如，EP0 640 828公開了一種用于同時(shí)監(jiān)控多個(gè)核酸擴(kuò)增的儀器。其特征是其包括一個(gè)金屬塊熱循環(huán)儀，其中包括一個(gè)具有為了容納多孔平板如微量滴定板而在其內(nèi)形成的多個(gè)凹口的熱傳導(dǎo)構(gòu)件。通過CCD照相機(jī)的方法獲得檢測(cè)，所述照相機(jī)被安排用于檢測(cè)(同時(shí))從所有所述凹口中發(fā)射的光?？蛇x擇地，建議使用纖維光學(xué)。依賴于使用的熒光染料，更重要的是依賴于存在靠近CCD照相機(jī)的濾光輪，該系統(tǒng)具有分析多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的能力，其中在一個(gè)反應(yīng)室中，通過2個(gè)或更多個(gè)不同標(biāo)記的雜交探針檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)不同擴(kuò)增子。然而，EP0 640 828既沒有預(yù)期也沒有建議，哪個(gè)標(biāo)記或檢測(cè)形式可用于這種多重/多色方法。
US6,015,674公開了一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)和定量的儀器和系統(tǒng)，特征是其能檢測(cè)第一和第二熒光指示劑，為了在同一反應(yīng)容器中檢測(cè)不同的擴(kuò)增子，所述指示劑可被用作不同雜交探針的標(biāo)記。然而，US6,015,674沒有公開用于進(jìn)行具有更高復(fù)雜程度的多重實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)。
另一個(gè)一般的實(shí)例是Roche Diagnostics LightCycler(Cat.No.20110468)。它是一種快速PCR系統(tǒng)，能進(jìn)行動(dòng)態(tài)在線(on-line)PCR定量和隨后PCR產(chǎn)物解鏈曲線的分析。當(dāng)前可商購(gòu)的LightCycler 1.2版的光學(xué)系統(tǒng)包含一個(gè)光源，一個(gè)藍(lán)光發(fā)光二極管(470nm LED)和三個(gè)檢測(cè)通道。通過僅當(dāng)它們結(jié)合靶核酸時(shí)才發(fā)射熒光信號(hào)的熒光標(biāo)記的雜交探針的方法或者在某些情況下也通過結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料的方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)將要分析的所有反應(yīng)測(cè)定所定義的信號(hào)閾值，并且對(duì)于靶核酸以及對(duì)于參考核酸如標(biāo)準(zhǔn)的或管家基因測(cè)定達(dá)到這個(gè)閾值所需要的循環(huán)數(shù)Cp?？稍趯?duì)靶核酸和參考核酸獲得的Cp值的基礎(chǔ)上測(cè)定靶分子的絕對(duì)的或相對(duì)的拷貝數(shù)。
通過一系列分色鏡和濾色片將由樣品所發(fā)射的熒光分成可在三個(gè)檢測(cè)通道(530/640/710nm)之一中被記錄的不同波長(zhǎng)。這允許雙鏈DNA結(jié)合的染料SybrGreenI的檢測(cè)，TaqMan探針形式的單色檢測(cè)以及雜交探針(HybProbe)形式的雙色檢測(cè)。在WO 97/46707、WO 97/46712和WO 98/46714中公開了Lightcycler系統(tǒng)的細(xì)節(jié)。這里將這些應(yīng)用的全部?jī)?nèi)容并入作為參考。
LightCycler儀器的一個(gè)非常重要的特征是顏色補(bǔ)償軟件。原則上這種軟件允許通過校正所監(jiān)控的溫度依賴性方式的熒光輻射的光譜重疊的方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量和解鏈曲線分析。在US6,197,520中公開了技術(shù)細(xì)節(jié)。
與LightCycler系統(tǒng)類似，Corbett Rotor-Gene實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀(www.corbettresearch.com)是一種4通道多重系統(tǒng)，其包括4個(gè)不同的LEDs作為激發(fā)源以及相應(yīng)的光電二極管作為熒光檢測(cè)單元。因此，盡管這種儀器硬件至少理論上具有在一個(gè)反應(yīng)容器中與最多4個(gè)不同標(biāo)記的雜交探針進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)的能力，然而迄今為止沒有公開各自成功應(yīng)用的方案。
另一個(gè)實(shí)時(shí)PCR儀器是BioradiQ多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Cat.No170-8740)，其允許熒光團(tuán)從400nm到700nm的激發(fā)和發(fā)射。
該系統(tǒng)基于用于熱循環(huán)的常規(guī)的多孔加熱塊，作為激發(fā)源的鎢絲燈，用于提供適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)的濾光輪，用于選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)射波長(zhǎng)的第二個(gè)濾光輪，以及作為檢測(cè)單元的CCD照相機(jī)。該儀器已經(jīng)成功地用于檢測(cè)從差不多等摩爾濃度的靶產(chǎn)生的4個(gè)不同擴(kuò)增子的多重測(cè)定，其中在同一個(gè)反應(yīng)容器中使用4個(gè)不同標(biāo)記的TaqMan探針(Pedersen，S.，Bioradiations 107(2001)10-11)。
在提高多重能力的另一個(gè)方法中，US6,369,893公開了一種實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀，其包括具有至少兩個(gè)光源的第一光學(xué)裝置以及包括至少兩個(gè)用于檢測(cè)和區(qū)別不同發(fā)射波長(zhǎng)光的檢測(cè)器的第二光學(xué)裝置。特別是，公開了以不同的4個(gè)LEDs作為光源和4個(gè)不同的光電二極管作為檢測(cè)器的具體實(shí)施方案。因此，在6,369,893中公開的儀器原則上可用于對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中已知的不同熒光染料有廣泛選擇的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。然而，US6,369,893既沒有預(yù)期也沒有建議需要如何設(shè)計(jì)包括每個(gè)用不同熒光實(shí)體標(biāo)記的多個(gè)不同探針的多重實(shí)驗(yàn)的任何方法。
實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)形式總的來說，存在用于實(shí)時(shí)檢測(cè)所擴(kuò)增DNA的不同形式，其中下列是現(xiàn)有技術(shù)中公知的和是通常使用的a)DNA結(jié)合染料形式由于雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的量通常超過最初在待分析的樣品中存在的核酸的量，所以可使用雙鏈DNA特異性染料，所述染料僅在它們結(jié)合到雙鏈DNA上后，用適當(dāng)波長(zhǎng)激發(fā)才能顯示熒光增強(qiáng)。優(yōu)選地，僅使用那些不影響PCR反應(yīng)的效率的染料，例如，SybrGreenII。
現(xiàn)有技術(shù)中已知的所有其它形式需要設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記的雜交探針，其僅在結(jié)合到其靶核酸上之后發(fā)射熒光。
b)TaqMan探針用兩種成分標(biāo)記單鏈雜交探針。根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，當(dāng)用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)第一種成分時(shí)，吸收的能量被轉(zhuǎn)移到第二種成分中，即所謂的猝滅劑。在PCR反應(yīng)的退火步驟期間，雜交探針結(jié)合到靶DNA上，并在隨后的延伸階段被Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性降解。結(jié)果，將激發(fā)的熒光成分和猝滅劑在空間上相互分離，因而可測(cè)量第一種成分的熒光發(fā)射(US5,538,848)。
c)分子信標(biāo)也用第一種成分和用猝滅劑標(biāo)記這些雜交探針，所述標(biāo)記優(yōu)選地位于探針的兩端。作為探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果，在溶液中兩種成分在空間上相鄰。與靶核酸雜交后將兩種成分相互分離，從而用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后可測(cè)量第一種成分的熒光發(fā)射(US5,118,801)。
d)單標(biāo)記探針(SLP)形式這種檢測(cè)形式由在5’-或3’-端用單熒光染料標(biāo)記的單寡核苷酸組成(WO 02/14555)。可將兩個(gè)不同的設(shè)計(jì)用于寡核苷酸標(biāo)記G-猝滅探針和硝基吲哚-去猝滅探針(Nitroindole-Dequenching probe)。
在G-猝滅探針實(shí)施方案中，將熒光染料附著到寡核苷酸的5’-或3’-端的C上。當(dāng)探針與靶雜交時(shí)，假使兩個(gè)G位于與C相對(duì)的靶鏈上并且在互補(bǔ)寡核苷酸探針旁的位置1上，熒光就顯著降低。
在硝基吲哚去猝滅實(shí)施方案中，將熒光染料附著到寡核苷酸的5’-或3’-端的硝基吲哚上。硝基吲哚以某種方式降低游離探針的熒光信號(hào)。當(dāng)探針與靶DNA雜交時(shí)由于去猝滅效應(yīng)而使熒光增加。
e)FRET雜交探針FRET雜交探針試驗(yàn)形式尤其對(duì)所有類型的同源雜交測(cè)定有用(Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，Analytical Biochemistry 169(1988)1-25)。其特征是同時(shí)使用的并且與所擴(kuò)增靶核酸的同一鏈的相鄰位點(diǎn)互補(bǔ)的兩個(gè)單鏈雜交探針對(duì)。兩個(gè)探針用不同熒光成分標(biāo)記。當(dāng)用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，第一種成分將所吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二種成分上，結(jié)果當(dāng)兩個(gè)雜交探針結(jié)合到被檢測(cè)的靶分子的相鄰位置時(shí)可測(cè)量第二種成分的熒光發(fā)射。
當(dāng)退火到靶序列上時(shí)，雜交探針相互之間必須非?？拷詮念^到尾的順序排列。通常，第一個(gè)探針的標(biāo)記的3’端和第二個(gè)探針的標(biāo)記的5’端之間的間隙盡可能小，即，1-5個(gè)堿基。這允許FRET供體化合物和FRET受體化合物靠近，其一般是10-100埃。
作為監(jiān)控FRET受體成分的熒光增加的替代，也可能監(jiān)控FRET供體成分的熒光減少作為雜交事件的定量測(cè)量。
特別地，為了檢測(cè)所擴(kuò)增的靶DNA，可在實(shí)時(shí)PCR中使用FRET雜交探針形式。在實(shí)時(shí)PCR領(lǐng)域的所有已知的檢測(cè)形式中，已經(jīng)證明FRET雜交探針形式是高度靈敏、精確和可靠的(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。然而，適當(dāng)FRET雜交探針序列的設(shè)計(jì)可能有時(shí)受將要檢測(cè)的靶核酸序列的特殊特性限制。
作為對(duì)使用兩個(gè)FRET雜交探針的替代，也可能使用熒光標(biāo)記的引物和僅一個(gè)標(biāo)記的寡核苷酸探針(Bernard，P.S.，等，AnalyticalBiochemistry 255(1998)101-107)。在這點(diǎn)上，其可任意地選擇，無論引物是用FRET供體還是用FRET受體化合物標(biāo)記。
除了PCR和實(shí)時(shí)PCR外，F(xiàn)RET雜交探針用于解鏈曲線分析。在這種測(cè)定中，首先在具有合適擴(kuò)增引物的一般PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶核酸。雜交探針可能在擴(kuò)增反應(yīng)期間已經(jīng)存在或者是后來添加的。PCR反應(yīng)完成后，組成型地增加樣品的溫度，并且只要雜交探針結(jié)合到靶DNA上就能檢測(cè)到熒光。在解鏈溫度時(shí)，雜交探針被從它們的靶上釋放出來，且熒光信號(hào)立即下降到背景水平。用適當(dāng)?shù)臒晒鈱?duì)溫度-時(shí)間的圖監(jiān)控這種降低，這樣可測(cè)定第一個(gè)導(dǎo)來值，在其中觀察到熒光降低的最大值。
在現(xiàn)有技術(shù)中存在許多已知的不同熒光染料對(duì)，根據(jù)本發(fā)明其主要是作為FRET供體/FRET受體對(duì)而能一起起作用的。然而，在本發(fā)明以前，沒有公開功能性的實(shí)例，所述實(shí)例特征是在多重檢測(cè)測(cè)定中已經(jīng)成功地使用4個(gè)不同的FRET對(duì)。除了其它理由之外，這可能是由于缺乏適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備，此外，是由于特殊FRET對(duì)的FRET方法的功能性被存在于同一反應(yīng)混合物中的其它熒光化合物干擾的事實(shí)。
如上面所討論的，存在用于多重/多色檢測(cè)的具有最多4個(gè)檢測(cè)器通道的不同的實(shí)時(shí)檢測(cè)熱循環(huán)儀裝置。然而，由于用幾個(gè)(至少多于2個(gè))不同標(biāo)記的探針建立具有足夠靈敏度和特異性的實(shí)時(shí)多色多重測(cè)定的嘗試迄今為止沒有成功，所以直到現(xiàn)在用于多重檢測(cè)的所有這些儀器的效用非常有限。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種改良系統(tǒng)，其允許最優(yōu)化并同時(shí)靈活設(shè)計(jì)多重/多色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)方面，將要解決的問題涉及改進(jìn)適當(dāng)雜交探針的設(shè)計(jì)。在另一個(gè)方面，將要解決的問題涉及儀器裝置的改進(jìn)。
發(fā)明概述因此，新發(fā)明涉及一種具有可應(yīng)用的檢測(cè)形式和多色特征擴(kuò)充的實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用于多重/多色檢測(cè)的特殊試劑混合物以及具有包括多個(gè)檢測(cè)單元的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的改進(jìn)的實(shí)時(shí)PCR儀器。設(shè)計(jì)該光學(xué)系統(tǒng)以提供用于多種檢測(cè)形式的激發(fā)源和檢測(cè)通道，例如SybrGreenI、多重FRET雜交探針以及多重TaqMan探針。
更確切地，本發(fā)明涉及進(jìn)行多色實(shí)時(shí)PCR的系統(tǒng)，其包括實(shí)時(shí)PCR儀和用于進(jìn)行多重PCR的特殊組合物或反應(yīng)混合物本發(fā)明的組合物或反應(yīng)混合物包括至少3對(duì)，優(yōu)選地4-5對(duì)以及最優(yōu)選地確切地4對(duì)FRET雜交探針。所述每對(duì)雜交探針由攜帶FRET供體部分的FRET供體探針和攜帶具有550和710nm之間的發(fā)射最大值的FRET受體部分的FRET受體探針組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少3個(gè)，優(yōu)選地至少4個(gè)以及最優(yōu)選地確切地4個(gè)FRET供體部分是相同的。最優(yōu)選地，所有FRET供體部分相同。換句話說，如果不同F(xiàn)RET對(duì)的所有FRET供體部分都是相同的，那么它們可用同一激發(fā)源激發(fā)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少3個(gè)，優(yōu)選地至少4個(gè)以及最優(yōu)選地確切地4個(gè)FRET供體部分是熒光素。最優(yōu)選地，所有FRET供體部分都是熒光素。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，至少一個(gè)另外的FRET供體部分選自Atto425和WI343。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其對(duì)于上述所公開的那些實(shí)施方案根本不相互排斥，一種FRET受體部分選自LC-Red 705、Cy5.5、JA286和如在US6,027,709，式1中所公開的磺化的花菁染料。
可選擇Cy5作為第二FRET受體部分。
可使用LC-Red 640作為第三FRET受體部分。
選擇LCRed衍生物L(fēng)C-Red 610作為第四FRET受體部分。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，第五FRET受體部分選自Rh6G和TAMRA。
系統(tǒng)的儀器部分的特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀包括·至少一個(gè)光源，優(yōu)選地是LED·至少4個(gè)，優(yōu)選地5-6個(gè)熒光檢測(cè)器實(shí)體，所述每個(gè)實(shí)體具有相互間相差至少25，優(yōu)選地至少30nm的中心檢測(cè)波長(zhǎng)特征是所述檢測(cè)器實(shí)體能夠·同時(shí)檢測(cè)至少3個(gè)，優(yōu)選地4個(gè)以及最優(yōu)選地5個(gè)不同標(biāo)記的FRET雜交探針對(duì)的最大熒光發(fā)射，·同時(shí)檢測(cè)至少2個(gè)不同標(biāo)記的TaqMan雜交探針的最大熒光發(fā)射，和·檢測(cè)SybrGreenI的最大熒光發(fā)射·加熱和冷卻的裝置·容納反應(yīng)混合物的多個(gè)反應(yīng)容器。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，系統(tǒng)儀器部分的特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀確切地包括一個(gè)光源。
在這個(gè)上下文中，應(yīng)當(dāng)理解的是盡管該儀器能夠檢測(cè)FRET形式、TaqMan形式和SybrGreen形式的熒光發(fā)射，但術(shù)語“同時(shí)”意思是在同一熱循環(huán)方案內(nèi)(即，在儀器的一次運(yùn)行內(nèi))，檢測(cè)至少3個(gè)不同標(biāo)記的FRET雜交探針或至者少2個(gè)不同的TaqMan探針或SybrGreenI。
優(yōu)選地，該儀器包括至少24個(gè)，更優(yōu)選地32個(gè)以及最優(yōu)選地48個(gè)所述的反應(yīng)容器。
同樣優(yōu)選地，所述的中心檢測(cè)波長(zhǎng)選自520-540nm、545-565nm、570-590nm、600-620nm、630-650nm、660-680nm和700-720nm的波長(zhǎng)范圍。
同樣優(yōu)選地，每個(gè)反應(yīng)容器的特征是沿著所述反應(yīng)容器的同一軸獲得由所述熒光光源引起的熒光激發(fā)和由熒光檢測(cè)器實(shí)體進(jìn)行的熒光監(jiān)控。
已經(jīng)證明如果所述的光源和所述的檢測(cè)器實(shí)體位于單獨(dú)的殼內(nèi)則特別有利。
也已經(jīng)證明如果所述加熱和冷卻裝置是強(qiáng)迫液體或強(qiáng)迫氣體的裝置則特別有利，優(yōu)選地是強(qiáng)迫氣裝置。
也已經(jīng)進(jìn)一步證明如果將反應(yīng)容器固定在旋轉(zhuǎn)的圓盤傳送帶中則特別有利。
在最后一個(gè)方面，本發(fā)明也涉及用于擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)靶DNA序列的相應(yīng)方法，包括a)提供如上述所公開的反應(yīng)混合物，b)將所述的反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)方案，以便可發(fā)生所述多個(gè)靶序列的擴(kuò)增c)在許多擴(kuò)增循環(huán)后至少一次監(jiān)控所述每對(duì)FRET雜交探針的雜交。
為了進(jìn)行解鏈曲線分析，也可至少一次監(jiān)控溫度依賴性方式的雜交。
發(fā)明詳述A)儀器在第一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)包括適于實(shí)時(shí)PCR的儀器。任選地，該儀器也適用于解鏈曲線分析，即，監(jiān)控DNA結(jié)合實(shí)體如雜交探針或dsDNA結(jié)合染料的溫度依賴性結(jié)合。
儀器基本上由光學(xué)部分和用于熱循環(huán)的裝置組成，其可使在它們各自反應(yīng)容器中的多個(gè)擴(kuò)增溶液進(jìn)行重復(fù)的熱循環(huán)過程以便可發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
優(yōu)選地，該系統(tǒng)儀器部分的特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀包括·至少一個(gè)光源，優(yōu)選地是發(fā)光二極管·至少4個(gè)以及優(yōu)選地5-6個(gè)熒光檢測(cè)器實(shí)體，所述的每個(gè)實(shí)體具有相互之間相差至少25，優(yōu)選地至少30nm的中心檢測(cè)波長(zhǎng)特征是所述檢測(cè)器實(shí)體能夠
·同時(shí)檢測(cè)至少3個(gè)，優(yōu)選地4個(gè)以及最優(yōu)選地5個(gè)不同標(biāo)記的FRET雜交探針對(duì)的最大熒光發(fā)射，·同時(shí)檢測(cè)至少2個(gè)不同標(biāo)記的TaqMan雜交探針的最大熒光發(fā)射，和·檢測(cè)SybrGreenI的最大熒光發(fā)射·加熱和冷卻的裝置，和·容納反應(yīng)混合物的多個(gè)反應(yīng)容器。
最優(yōu)選地，該系統(tǒng)儀器部分的特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀確切地包括一種光源。
可任意地選擇熱循環(huán)的裝置。例如，可使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的金屬塊循環(huán)儀。然而，如果熱循環(huán)的裝置提供主動(dòng)加熱的裝置以及主動(dòng)冷卻的獨(dú)立的裝置則是有利的。此外也已經(jīng)證明如果所述的加熱和冷卻的裝置是強(qiáng)迫液體或強(qiáng)迫氣體的裝置則特別有利。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的裝置使用強(qiáng)迫氣。
如果所述的熱循環(huán)裝置能夠像其在LightCycler技術(shù)(WO97/46712)中那樣進(jìn)行迅速熱循環(huán)，那么其也是優(yōu)選的。如可從WO97/46712中推斷出的，這種技術(shù)基于以環(huán)境空氣被加熱線圈加熱為特征的強(qiáng)迫氣加熱以及以提供環(huán)境空氣為特征的強(qiáng)迫氣冷卻。
關(guān)于迅速熱循環(huán)的進(jìn)一步改進(jìn)是由于有比較高的表面/體積比，所以使用毛細(xì)管作為反應(yīng)容器。本發(fā)明人已經(jīng)證明外徑小于5mm，優(yōu)選地小于3.2mm以及最優(yōu)選地小于1.6mm的毛細(xì)管特別有利，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)试S總體積在10至100μl的反應(yīng)混合物仍然可進(jìn)行每個(gè)循環(huán)的反應(yīng)時(shí)間小于2分鐘的迅速的熱循環(huán)方案。此外，每個(gè)反應(yīng)容器需要至少部分地或完全地由光學(xué)上清楚的材料如玻璃或塑料制造。
每個(gè)反應(yīng)容器(毛細(xì)管)在監(jiān)控位置中的定位優(yōu)選地以沿著所述反應(yīng)容器的同一軸進(jìn)行熒光激發(fā)和監(jiān)控為特征。由于全內(nèi)反射比的現(xiàn)象，所以這樣的原則提高信號(hào)傳導(dǎo)。
為了整個(gè)多個(gè)反應(yīng)容器都產(chǎn)生統(tǒng)一的熱循環(huán)特征，已經(jīng)進(jìn)一步證明了如果將反應(yīng)容器固定在旋轉(zhuǎn)的圓盤傳送帶中則特別有利。
儀器的光學(xué)部分基本上由具有為了激發(fā)反應(yīng)溶液中存在的熒光化合物的一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)光源的激發(fā)單元和用于從所述的反應(yīng)容器中檢測(cè)熒光發(fā)射的檢測(cè)單元組成。
根據(jù)WO97/46712，在使用適當(dāng)數(shù)目的分色鏡的前提下，可能構(gòu)建一種光學(xué)系統(tǒng)，其中將激發(fā)單元和檢測(cè)單元置于共同的殼中。然而，在本發(fā)明的上下文中，如果包括光源的激發(fā)單元和包括檢測(cè)器實(shí)體的檢測(cè)單元位于單獨(dú)的殼中，結(jié)果改良的實(shí)時(shí)PCR儀包括兩個(gè)單獨(dú)的光學(xué)單元，那么證明是有利的。
對(duì)于激發(fā)單元，根據(jù)本發(fā)明可使用單色激發(fā)或多色激發(fā)。對(duì)于單色激發(fā)，可使用單色LED(發(fā)光二極管)或單色激光。也可能使用具有兩個(gè)或多個(gè)LEDs或單色激光，但在單個(gè)測(cè)量中一次僅使用一個(gè)的儀器。對(duì)于多色激發(fā)，可使用白色LED、鹵素?zé)艋螂療簟Ｔ谶@種情況下，需要在儀器中安裝濾光輪或用于將適當(dāng)?shù)臑V色片移進(jìn)和移出激發(fā)光束的其它裝置，以便可提供具有不同選擇性激發(fā)波長(zhǎng)的光。
根據(jù)本發(fā)明的激發(fā)單元的光學(xué)特性是根據(jù)必須要考慮的不同參數(shù)進(jìn)行選擇的首先，最短的激發(fā)波長(zhǎng)應(yīng)當(dāng)長(zhǎng)于360nm，優(yōu)選地長(zhǎng)于400nm，這是因?yàn)槎痰牟ㄩL(zhǎng)輻射具有相對(duì)低的穿透常規(guī)使用的用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)容器的光學(xué)材料，如玻璃或塑料的透射率。另外，用更高波長(zhǎng)例如在400-500nm的范圍內(nèi)波長(zhǎng)的激發(fā)避免了可能妨礙反應(yīng)監(jiān)控的反應(yīng)容器材料內(nèi)部的熒光干擾。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，激發(fā)單元僅由一個(gè)光源組成，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明，即使具有單一光源其也可能在實(shí)時(shí)PCR中進(jìn)行多重檢測(cè)。此外，在實(shí)時(shí)PCR中多重檢測(cè)甚至可能用單一、單色光源。
在一個(gè)實(shí)施方案中，激發(fā)單元包括在470nm處發(fā)射的藍(lán)色LED。圖1顯示根據(jù)本發(fā)明可使用的不同熒光染料的激發(fā)光譜。在這些染料中，可用具有470nm激發(fā)波長(zhǎng)的單個(gè)發(fā)光二極管激發(fā)作為經(jīng)常使用的FRET供體化合物的熒光素或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的TaqMan報(bào)道染料，而用470nm LED僅勉強(qiáng)激發(fā)經(jīng)常使用的FRET受體染料。
另外，可任選地使用在400和430nm之間，優(yōu)選地在415nm發(fā)射的第二UV-LED來激發(fā)與熒光素相比具有更小激發(fā)最大值的其它FRET供體化合物。
更確切地，藍(lán)色470nm LED能夠激發(fā)熒光素，其以HybProbe形式用作與4種不同受體(報(bào)道)染料結(jié)合的供體染料。在另一方面，一般的FRET受體染料如LC-Red-640或Cy5僅由470nm LED勉強(qiáng)激發(fā)。在雙色TaqMan測(cè)定中藍(lán)色LED也激發(fā)報(bào)道染料FAM和HEX或VIC。另外，熒光素以單標(biāo)記探針(SLP)形式用作報(bào)道染料。此外，對(duì)于不基于探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，使用藍(lán)色LED激發(fā)SybrGreenI。
可以以HybProbe形式使用任選的UVLED以激發(fā)與在比較短的波長(zhǎng)發(fā)射熒光的適當(dāng)報(bào)道染料結(jié)合的短波長(zhǎng)供體染料。此外，可包括在580nm發(fā)射的第三種LED。
對(duì)于檢測(cè)單元，根據(jù)本發(fā)明可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的不同檢測(cè)方式。例如，使用幾種光電二極管在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，其特征在于每個(gè)光電二極管能檢測(cè)特殊波長(zhǎng)的熒光。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供確切地具有5個(gè)或6個(gè)通道，使用光電二極管作為檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)。如將被顯示的，這種實(shí)施方案已經(jīng)能同時(shí)進(jìn)行4種顏色FRET雜交探針檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)單元的光學(xué)特征是根據(jù)下列不同參數(shù)進(jìn)行選擇的首先，應(yīng)當(dāng)被檢測(cè)的最長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)大約小于800nm，且優(yōu)選地小于730nm，這是因?yàn)楦卟ㄩL(zhǎng)信號(hào)的檢測(cè)受由儀器加熱部分所產(chǎn)生的推定的紅外線輻射的可能背景的影響。此外，現(xiàn)有技術(shù)中已知的長(zhǎng)波長(zhǎng)紅外線染料具有亞最適的量子產(chǎn)率，不穩(wěn)定，因此更難偶聯(lián)到所期望的雜交探針上。
結(jié)果，不同檢測(cè)通道應(yīng)當(dāng)在500和800nm之間，優(yōu)選地在520和730nm之間具有中心檢測(cè)最大值。在這個(gè)上下文中，圖2顯示根據(jù)本發(fā)明可使用的不同熒光染料的發(fā)射光譜。
在500和800nm的范圍內(nèi)，可通過選擇適當(dāng)?shù)臑V色片確切地定義檢測(cè)通道，光束必須先通過所述濾色片然后再進(jìn)入各自的光電二極管。對(duì)于適當(dāng)?shù)倪x擇，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了應(yīng)當(dāng)考慮的下列參數(shù)首先，應(yīng)當(dāng)根據(jù)將主要檢測(cè)的那些熒光染料的發(fā)射光譜的最大值選擇每個(gè)通道的中心波長(zhǎng)檢測(cè)最大值。根據(jù)拇指規(guī)則，對(duì)于適當(dāng)?shù)臋z測(cè)靈敏度，將被檢測(cè)染料的熒光發(fā)射的最大值與每個(gè)通道中中心檢測(cè)波長(zhǎng)相差不應(yīng)當(dāng)超過+/-10nm。
此外，所有檢測(cè)通道應(yīng)當(dāng)能檢測(cè)不連續(xù)的發(fā)射，即，光譜重疊應(yīng)當(dāng)盡可能最小。在這點(diǎn)上，如果每個(gè)通道的半帶寬是40nm或更小，則是有利的。更有利地是，每個(gè)通道的半帶寬是20nm或更小。
優(yōu)選地，在鄰近通道中將被檢測(cè)的熒光團(tuán)的相互干擾(crosstalk)小于70％，更優(yōu)選地小于50％，最優(yōu)選地小于30％。在這點(diǎn)上，另一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)是封閉值(blocking value)，其指示在通道(濾色片)的指定透射范圍外檢測(cè)到的最大強(qiáng)度。優(yōu)選地，這個(gè)值小于10-3。
基于這些標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)證明如果根據(jù)本發(fā)明的5-6個(gè)通道中的每一個(gè)的中心檢測(cè)波長(zhǎng)相互之間相隔超過25nm，優(yōu)選地甚至超過30nm則是有利的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述中心檢測(cè)波長(zhǎng)選自520-540nm、545-565nm、570-590nm、600-620nm、630-650nm、660-680nm和700-720nm的波長(zhǎng)范圍。
此外，在一個(gè)由6個(gè)檢測(cè)器通道組成的具體實(shí)施方案中，所述通道的中心檢測(cè)波長(zhǎng)為大約530、580、610、640、670和710nm+/-5nm或530、555、610、640、670和710nm+/-5nm或者優(yōu)選地+/-2nm。
在另一個(gè)由5個(gè)檢測(cè)器通道組成的具體實(shí)施方案中，所述通道的中心檢測(cè)波長(zhǎng)為大約530、610、640、670和710nm+/-5nm或者優(yōu)選地+/-2nm。
在由4個(gè)檢測(cè)器通道組成的第三個(gè)具體實(shí)施方案中，所述通道的中心檢測(cè)波長(zhǎng)為大約610、640、670和710nm+/-5nm或者優(yōu)選地+/-2nm。
作為一個(gè)實(shí)例，圖3顯示優(yōu)選實(shí)施方案的6個(gè)檢測(cè)通道以及根據(jù)本發(fā)明可使用的不同熒光染料的發(fā)射光譜。在這個(gè)實(shí)施方案中，使6個(gè)通道相隔至少25nm光譜距離以使每個(gè)報(bào)道染料進(jìn)入鄰近檢測(cè)通道進(jìn)行的相互干擾最小。檢測(cè)單元在具有中心波長(zhǎng)檢測(cè)最大值為大約530nm的通道中能檢測(cè)SybrGreenI和TaqMan報(bào)道染料熒光素/FAM。另外，該系統(tǒng)優(yōu)選能在大約560nm的第二通道中檢測(cè)HEX/VIC。更長(zhǎng)波長(zhǎng)的檢測(cè)通道能檢測(cè)HybProbe受體染料以及任選地檢測(cè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的SLP報(bào)道染料。
通過多叉(multiple-leg)纖維束連接激發(fā)單元和檢測(cè)單元。使用光導(dǎo)管將反應(yīng)容器(例如，玻璃毛細(xì)管)發(fā)射的光均勻分配并且傳送到6個(gè)玻璃纖維束中。這些50μm的單一玻璃纖維束將光傳送到6個(gè)檢測(cè)通道中的每一個(gè)。
與在WO97/46712中所公開的光學(xué)單元相比，激發(fā)單元和檢測(cè)單元位于單獨(dú)殼內(nèi)的這種布置提供兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)將發(fā)射的光均勻分配到所有6個(gè)檢測(cè)通道內(nèi)以及激發(fā)單元和檢測(cè)單元的機(jī)械去偶合。這能使激發(fā)單元朝向要進(jìn)行監(jiān)控的反應(yīng)容器高度精確定位(例如，毛細(xì)管頂端)，而不用移動(dòng)檢測(cè)單元。此外，使必需的分色鏡的數(shù)目最小。在圖4中顯示了這種布置的一個(gè)實(shí)例，其公開了本發(fā)明的一個(gè)可能的實(shí)施方案。如可見到的，激發(fā)單元和檢測(cè)單元位于不同的殼內(nèi)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)包括如在US6,197,520中詳細(xì)公開的顏色補(bǔ)償工具，將其全文并入本申請(qǐng)中作為參考。相應(yīng)的軟件使得能夠測(cè)量整個(gè)溫度范圍的熒光并且校正上述所公開的6個(gè)檢測(cè)器通道的溫度依賴性光譜重疊。
大體上這是通過下列步驟實(shí)現(xiàn)的a)提供在將進(jìn)行的多重實(shí)驗(yàn)中摻入的每個(gè)熒光實(shí)體的校準(zhǔn)溶液b)為了測(cè)定不同通道之間溫度依賴性的相互干擾量，在每個(gè)檢測(cè)器通道中監(jiān)控每個(gè)所述溶液的溫度依賴性熒光，和c)產(chǎn)生包含校正值的顏色補(bǔ)償數(shù)據(jù)集。
B)檢驗(yàn)形式和染料的選擇在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“多重PCR”應(yīng)當(dāng)被理解為以通過在同一PCR反應(yīng)中使用2對(duì)或更多對(duì)擴(kuò)增引物的方法產(chǎn)生2個(gè)或更多個(gè)不同擴(kuò)增產(chǎn)物為特征的PCR反應(yīng)。
同樣地在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“多色實(shí)時(shí)PCR”定義為以通過不同標(biāo)記的雜交探針檢測(cè)在多重PCR或在單重PCR(僅使用1對(duì)擴(kuò)增引物)中所產(chǎn)生的1個(gè)或多個(gè)不同擴(kuò)增產(chǎn)物為特征的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。
本發(fā)明的主要方面是基于使用不同標(biāo)記的雜交試劑的，每種試劑包含1對(duì)包括根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理相互作用的兩種熒光染料對(duì)的FRET雜交探針。根據(jù)本發(fā)明，可選擇適當(dāng)?shù)娜玖嫌糜跇?biāo)記可在至少3個(gè)或4個(gè)，優(yōu)選地盡可能多的檢測(cè)通道中用于檢測(cè)的雜交試劑。
更確切地，這種雜交試劑由兩個(gè)相鄰的雜交寡核苷酸組成，適當(dāng)進(jìn)行標(biāo)記以便它們可根據(jù)如在WO97/46707、WO97/46712和WO97/46714中所公開的FRET-HybProbe檢測(cè)形式一起起作用。在許多情況中，如果雜交試劑由單個(gè)寡核苷酸組成或在FRET HybProbe形式的情形中，由作為供體探針和受體探針一起起作用的寡核苷酸對(duì)組成，則是足夠的。然而，在其它情況中，在需要檢測(cè)的靶序列中可能存在許多其它序列變體。因此不可能通過僅使用一對(duì)FRET寡核苷酸雜交探針檢測(cè)所有成員的序列。
對(duì)于那些情況，雜交試劑可由1、2或更多個(gè)雜交探針組成，其相似于并且結(jié)合同源序列，但是相互之間由于1、2、3或更多個(gè)單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸交換、缺失或添加而不同。假使雜交試劑是一對(duì)FRET雜交探針，那么所述的雜交試劑可由1、2、3或更多個(gè)FRET供體寡核苷酸探針和/或1、2、3或更多個(gè)受體寡核苷酸探針組成。在這種情況中，所有供體探針可能相似，但是相互之間由于單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸交換、缺失或添加而不同。同樣，所有受體探針可能相似，但相互之間由于單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸交換、缺失或添加而不同。
另外，如果進(jìn)行多色FRET檢測(cè)，其中用如在Bernard，P.S.，等，Analytical Biochemistry 255(1998)101-107中所公開的適當(dāng)標(biāo)記的引物替換所述標(biāo)記的雜交探針對(duì)中的一個(gè)成員，那么其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，如果不是監(jiān)控到各自FRET受體化合物的熒光發(fā)射增加，而是監(jiān)控到一個(gè)、幾個(gè)或者所有FRET供體部分的熒光發(fā)射降低作為指示存在將要檢測(cè)的靶核酸，那么其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
除了進(jìn)行基于FRET原理的多色檢測(cè)的各種可能性之外，本發(fā)明的系統(tǒng)也允許進(jìn)行其它檢測(cè)形式，如通過SybrGreenI、使用不同標(biāo)記的分子信標(biāo)的多重檢測(cè)、單標(biāo)記探針或雙色TaqMan檢測(cè)的方法檢測(cè)靶核酸。如在現(xiàn)有技術(shù)中已知的，雙色TaqMan測(cè)定可能基于使用作為猝滅劑化合物的Cy5(Amersham)，其與作為第一標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道染料的FAM和作為第二報(bào)道化合物的HEX或可選擇地VIC組合。
原則上，存在熒光染料組合的多種可能性，其可能作為FRET對(duì)一起起作用(綜述Resonance Energy Transfer EditorsMeer，B Wiebvan der等，VCH Publishers INC.，1994)。然而，基于儀器的先決條件，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，開發(fā)以影響各自實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)的靈敏度和/或特異性的方式組合多個(gè)互不干擾的FRET雜交試劑的多色試驗(yàn)不是沒有意義。
關(guān)于適當(dāng)FRET雜交探針對(duì)的選擇，例如用于FRET供體和FRET受體的染料不能是任意選擇的，而是需要滿足至少下列要求·足夠的溶解度和能夠偶聯(lián)到寡核苷酸上·染料在PCR熱循環(huán)條件下的穩(wěn)定性·充分和可重復(fù)的發(fā)射強(qiáng)度以及量子產(chǎn)率·發(fā)射強(qiáng)度的低溫度依賴性·在不同的化學(xué)條件下基本上沒有光譜移動(dòng)·當(dāng)偶聯(lián)到不同寡核苷酸序列上時(shí)基本上沒有光譜移動(dòng)·不連續(xù)的光譜發(fā)射最大值·可利用適當(dāng)?shù)呐渑俭w染料進(jìn)行FRET過程結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明系統(tǒng)的一個(gè)重要的方面集中到鑒定可以以HybProbe形式用于盡可能多檢測(cè)通道的多個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)染料對(duì)。已經(jīng)在圖1-3中顯示了能建立4或5重多色檢測(cè)的染料FRET染料對(duì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。將在下面描述可供選擇的方法。
在這點(diǎn)上，下表總結(jié)了迄今為止成功地用于在所示檢測(cè)通道中進(jìn)行4色FRET雜交探針測(cè)定或雙色TaqMan測(cè)定的各種FRET受體染料和TaqMan報(bào)道染料表1
然而，對(duì)于上面所示的幾種不同的報(bào)道實(shí)體而言，不同的FRET供體部分(供體)和TaqMan猝滅劑化合物(Q)必須依賴于由于存在一種、兩種或三種不同LEDs而得到的激發(fā)波長(zhǎng)而分別使用。因此，在下面更全面的表中總結(jié)了適當(dāng)?shù)腇RET對(duì)或TaqMan組合的不同可能性表2
獲得上述表中所提到的染料的途徑如下LC-Red-705和LC Red-640可從Roche Applied Science(Cat.No.2 015 161和2 157 594)買到根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用如在US5,750,409，化合物II中所公開的熒光染料，合成LC-Red 610在EP0 747 447的實(shí)施例1中公開了JA286。對(duì)于這種染料，如果將這種染料通過5個(gè)核苷酸殘基的長(zhǎng)非雜交間隔區(qū)部分與雜交寡核苷酸相連，則是有利的。
Cy-5NHS-酯可從Amersham(Cat.No.PA 15100)買到，且Cyc5.5亞磷酰胺也可從Amersham(Cat.No 27179901)買到。
Bodipy 650/665NHS-酯和Alexa 647NHS酯可從MolecularProbes(Cat.Nos D1 0001和A2 0006)買到。
Atto 425-NHS酯可從Attotec(Cat.No.AD 425-3)買到。
WI343是香豆素343的衍生物(Aldrich，Cat.No.55 804 654)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將其與接頭(β氨基丙酸(beta alanin))偶聯(lián)并轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺酰酯 另外，可從本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同供應(yīng)商，例如Molecularprobes中買到所有TaqMan染料。
BlackHole猝滅劑(BHQ)可從Biosearch Technologies(Cat.No.BHQ1-3)買到。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法對(duì)寡核苷酸進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)記。特別是，可使用包括活化的NHS酯的熒光化合物或連接到亞磷酰胺上的熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記，從而可在寡核苷酸本身從頭合成期間進(jìn)行標(biāo)記。此外，可通過使用熒光素控制的孔的玻璃顆粒作為寡核苷酸合成的固體支持物(Roche Applied Science Cat.No.3 138 178)制備熒光素標(biāo)記的探針。
C)方法和試劑盒在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過使用上述所公開的系統(tǒng)、儀器和組合物的所有不同實(shí)施方案進(jìn)行多重PCR的方法。
特別是，本發(fā)明涉及擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)靶DNA序列的方法，包括·提供根據(jù)本發(fā)明的組合物或反應(yīng)混合物，·使所述的反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)方案，以便可發(fā)生所述多個(gè)靶序列的擴(kuò)增，和·在許多擴(kuò)增循環(huán)后至少一次監(jiān)控所述每對(duì)FRET雜交探針的雜交。
在具體的實(shí)施方案中，至少一次監(jiān)控溫度依賴性方式的雜交。
組合物或反應(yīng)混合物主要包括至少3對(duì)，優(yōu)選地4-5對(duì)，最優(yōu)選地確切地是4對(duì)FRET雜交探針，每對(duì)雜交探針都由攜帶FRET供體部分的FRET供體探針和攜帶具有550和710nm之間的發(fā)射最大值的FRET受體部分的FRET受體探針組成。
另外，根據(jù)本發(fā)明的這種組合物或反應(yīng)混合物可包括選自下列列表中的一個(gè)或幾個(gè)或者優(yōu)選地所有化合物和試劑·緩沖液，可用于聚合酶鏈反應(yīng)·脫氧核苷三磷酸·模板依賴性DNA聚合酶，優(yōu)選耐熱的·至少一對(duì)或幾對(duì)擴(kuò)增引物在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括至少第一組擴(kuò)增引物和至少3、4或5對(duì)FRET雜交探針的試劑盒。
另外，根據(jù)本發(fā)明這種試劑盒可包括選自下列列表中的一個(gè)或幾個(gè)其它化合物和試劑·緩沖液，可用于聚合酶鏈反應(yīng)·脫氧核苷三磷酸·模板依賴性DNA聚合酶，優(yōu)選耐熱的·至少一對(duì)或多對(duì)擴(kuò)增引物這種試劑盒也可包括內(nèi)部對(duì)照DNA，其可使用用于檢測(cè)任何靶核酸的相同的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。可將上述所公開的每種成分貯藏在單個(gè)貯藏容器中。然而，也可能在同一容器中貯藏任意組合的成分。
D)發(fā)明的最佳方式在本發(fā)明的申請(qǐng)日時(shí)發(fā)明人已知的本發(fā)明的最佳方式如下在這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)提供具有一個(gè)或兩個(gè)激發(fā)源和6個(gè)檢測(cè)通道的光度計(jì)。將藍(lán)色(470nm)和任選地紫外光(410nm)發(fā)光二極管與具有在530、555、610、640、670和710nm的中心檢測(cè)波長(zhǎng)的檢測(cè)通道組合。
改良的實(shí)時(shí)PCR儀的光度計(jì)包括兩個(gè)獨(dú)立的光學(xué)單元。如在圖4中所公開的，激發(fā)單元和檢測(cè)單元位于不同的殼中。
(I)具有一個(gè)或兩個(gè)LED’s的激發(fā)單元一個(gè)在470nm發(fā)射的藍(lán)色LED和任選地在415nm發(fā)射的紫色LED。藍(lán)色LED能激發(fā)SybrGreenI和熒光素。在HybProbe形式中熒光素用作供體染料，與4個(gè)不同受體(報(bào)道)染料組合Red610、Red640、Cy5、Red705。此外，在雙色TaqMan測(cè)定中藍(lán)色LED激發(fā)報(bào)道染料FAM和HEX或VIC。另外，熒光素在單標(biāo)記探針(SLP)形式中用作報(bào)道染料?？梢砸訦ybProbe形式中使用任選的紫色LED以激發(fā)與555nm的報(bào)道染料(Rh6G)組合的短波長(zhǎng)供體染料(Atto425)。
(II)具有6個(gè)通道的檢測(cè)單元，其使用光電二極管作為檢測(cè)器。6個(gè)通道相隔至少25nm光譜距離以便將每種報(bào)道染料進(jìn)入相鄰檢測(cè)通道的相互干擾減到最小。該檢測(cè)單元能在530nm通道中檢測(cè)SybrGreenI和熒光素/FAM。另外，該系統(tǒng)能在555nm通道中檢測(cè)HEX/VIC和RH6G。長(zhǎng)波長(zhǎng)檢測(cè)通道(610、640、670、710nm)能檢測(cè)HybProbe受體染料和任選地用于檢測(cè)長(zhǎng)波長(zhǎng)SLP報(bào)道染料。
通過6叉纖維束連接激發(fā)單元和檢測(cè)單元。使用光導(dǎo)管將玻璃毛細(xì)管的發(fā)射光均勻分配并且傳送到6個(gè)玻璃纖維束內(nèi)。這些50μm單一玻璃纖維束將光傳送到6個(gè)檢測(cè)通道中的每一個(gè)。這種裝置與LC1.2光學(xué)單元相比提供兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)發(fā)射的光均勻分配到所有6個(gè)檢測(cè)通道內(nèi)以及激發(fā)單元和檢測(cè)單元的機(jī)械去偶合。這能使激發(fā)單元朝向毛細(xì)管頂端高度精確定位，而不用移動(dòng)檢測(cè)單元。有效的顏色補(bǔ)償功能允許在不同通道中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶。
組合這些硬件和軟件特性，為了進(jìn)行多重FRET雜交探針檢測(cè)，已經(jīng)建立了系統(tǒng)的多色能力。另外，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)允許其它非FRET-HybProbe檢測(cè)形式。
基于雜交探針檢測(cè)形式，系統(tǒng)能進(jìn)行至少4色多重實(shí)時(shí)定量和進(jìn)行解鏈曲線分析?？紤]到每個(gè)通道6個(gè)解鏈峰的解鏈曲線的解析，使用根據(jù)本發(fā)明的光度計(jì)最多可辨別24個(gè)不同PCR產(chǎn)物。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，已經(jīng)為中心發(fā)射波長(zhǎng)在610和670nm的檢測(cè)通道開發(fā)了新的以前未知的FRET受體染料。另外，任選的410nmLED提供了一種使用與在555nm發(fā)射的受體染料組合的短波長(zhǎng)供體染料的選擇，因此提供了第五個(gè)HybProbe檢測(cè)通道。在圖1和2中顯示特別有用染料的激發(fā)和發(fā)射光譜。
使用熒光素作為FRET供體染料，可鑒定在610nm通道(Red610)和在670nm通道(Cy5)中分別可檢測(cè)到的兩個(gè)新的FRET受體染料。當(dāng)以HybProbe FRET形式使用時(shí)，兩個(gè)染料都顯示高信號(hào)動(dòng)力學(xué)。另外，染料的光譜性質(zhì)完全符合上面所公開的光度計(jì)，因此將進(jìn)入不同檢測(cè)通道中的相互干擾減到最小。使用靈活的多通道顏色補(bǔ)償算法，顯示了來自單個(gè)反應(yīng)的所有4種FRET受體染料(包括已有的染料LCRed640和LCRed705)的特異性檢測(cè)在40℃到95℃的溫度范圍內(nèi)是可行的。
當(dāng)試圖鑒定用于555nm通道的第五種FRET受體染料時(shí)，結(jié)果好的FRET信號(hào)動(dòng)力學(xué)被兩個(gè)效應(yīng)抑制(I)熒光素供體染料顯示進(jìn)入555nm通道的高相互干擾，因此掩蓋了在PCR過程中潛在FRET受體染料的增加的信號(hào)。
(II)在555nm發(fā)射的FRET受體染料本身直接由470nm LED激發(fā)，因而顯著增加了背景熒光，所以降低了檢測(cè)靈敏度。
發(fā)現(xiàn)這些缺點(diǎn)的解決方案是通過使用410nm紫外光LED激發(fā)與適當(dāng)555nm受體染料(Rh6G)組合的短波長(zhǎng)供體染料(Atto425)。在這種組合中，將從供體進(jìn)入555nm檢測(cè)通道的相互干擾和FRET受體的直接激發(fā)減少到最低，并且在顏色補(bǔ)償后獲得充分的信號(hào)動(dòng)力學(xué)。
此外，結(jié)果是短波長(zhǎng)供體Atto 425甚至可與所有長(zhǎng)波長(zhǎng)受體染料組合使用。出乎意料地，與Atto 425組合的長(zhǎng)波長(zhǎng)受體的FRET信號(hào)動(dòng)力學(xué)與熒光素組合使用時(shí)的信號(hào)動(dòng)力學(xué)相當(dāng)。這種觀察數(shù)據(jù)提供了一種僅使用一種供體染料將多色特征擴(kuò)大到5通道形式的選擇。
使用TaqMan檢測(cè)形式，可進(jìn)行基于標(biāo)準(zhǔn)TaqMan報(bào)道染料FAM(在530nm檢測(cè))和HEX或VIC(在560nm檢測(cè))的雙色應(yīng)用，而不用較多修改現(xiàn)有技術(shù)中已知的TaqMan化學(xué)方法。所獲得的檢測(cè)靈敏度與COBAS TaqMan儀(RocheMolecularSystems)相當(dāng)。
此外，可在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)內(nèi)應(yīng)用用于解鏈曲線分析的單標(biāo)記探針(SLP’s)形式(WO02/14555)。這種形式是基于與其靶序列雜交后探針標(biāo)記的猝滅或者各自去猝滅的。該形式僅需要一種用單一染料末端標(biāo)記的探針。與HybProbe或TaqMan形式相比，SLP’s因此使得能夠有用于單核苷酸多態(tài)(SNP’s)綜合分析的顯著低花費(fèi)的測(cè)定裝置。通過報(bào)道解鏈溫度，可在一個(gè)反應(yīng)中明確地區(qū)別SLP的不同等位基因。通過使用不同的報(bào)道染料提供多種選擇。
在下表中總結(jié)了在上面所公開的儀器中實(shí)時(shí)多色PCR檢測(cè)的可能性表3
提供下列實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和附圖用于幫助理解本發(fā)明，在所附權(quán)利要求中闡述了本發(fā)明的真實(shí)范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是可不偏離本發(fā)明的精神而在所闡述的方法中進(jìn)行修改。


圖1本發(fā)明的FRET供體和受體染料的激發(fā)光譜。
圖2本發(fā)明的FRET供體和受體染料的發(fā)射光譜。
圖3本發(fā)明的FRET供體和受體染料的發(fā)射光譜以及檢測(cè)通道。
圖4光度計(jì)裝置圖5實(shí)施例1的4色實(shí)時(shí)PCR定量實(shí)驗(yàn)圖6實(shí)施例2的引物/探針設(shè)計(jì)圖7實(shí)施例2的4色實(shí)時(shí)PCR解鏈曲線實(shí)驗(yàn)圖8實(shí)施例3的雙色TaqMan實(shí)時(shí)PCR定量實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1使用用不同熒光化合物標(biāo)記的不同F(xiàn)RET雜交探針對(duì)的因子VDNA的定量實(shí)時(shí)PCR對(duì)于因子VDNA片段的擴(kuò)增，建立如下的4種不同100μl實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)混合物含有因子V基因的質(zhì)粒的106個(gè)拷貝3mM MgCl2各500nM的引物200nM根據(jù)Seq.A的FRET 3’雜交探針200nM分別根據(jù)Seq.B1、B2、B3或B4的FRET 5’雜交探針另外，使用LightCycler DNA Hyb探針試劑盒(Roche AppliedScience，Cat.No.2158825)的PCR組分。
使用的引物和探針如下因子V的引物，正向的5′-GAGAGACATCGCCTCTGGGCTA-3′(22聚體)(Seq.ID.No1)因子V的引物，反向的5′-TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA-3′(20聚體)(Seq.ID.No2)A3’熒光素標(biāo)記的雜交探針5′-AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-3′(23聚體)(SEq.Id.No3)B15’Red610雜交探針5′-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3′(36聚體)B25’Red640雜交探針5′-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3′(36聚體)B35’Cy5雜交探針5′-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3′(36聚體)B45’Red705雜交探針
5′-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3′(36聚體)(B1-B4Seq.Id.NO4)根據(jù)下列熱循環(huán)方案，在上述公開的作為本發(fā)明最好方式的LightCycler儀中進(jìn)行擴(kuò)增

用和不用顏色補(bǔ)償算法，且使用通過在45個(gè)循環(huán)期間測(cè)量檢測(cè)通道中的熒光信號(hào)的第二衍生閾值方法，以及使用用于最初熒光背景強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化的算術(shù)背景校正來進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。
結(jié)果顯示于圖5a-5d中。如可在圖中看到的，顏色補(bǔ)償后可在相應(yīng)的610、640、670和710nm檢測(cè)通道中獲得所有使用的FRET受體染料的特異和定量擴(kuò)增信號(hào)。此外，當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)顏色補(bǔ)償時(shí)，顯示相鄰?fù)ǖ乐械牟煌玖系墓庾V重疊不影響特異性和定量信號(hào)。
實(shí)施例24色解鏈曲線分析用特異性引物擴(kuò)增含有編碼N-乙酰-轉(zhuǎn)移酶同工酶的人NAT-2基因片段的特定質(zhì)粒的479bp片段，并且通過熒光進(jìn)行檢測(cè)，其中使用4對(duì)不同特異性的FRET雜交探針。其中3個(gè)探針在3’端用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，4個(gè)檢測(cè)探針用Light-Cycler-Red 610、640、705或Cy5在5’端進(jìn)行標(biāo)記并在3’端通過磷酸化作用進(jìn)行修飾。在圖6中顯示了這個(gè)實(shí)驗(yàn)安排的示意圖。如可從圖中推斷出的，有4個(gè)不同標(biāo)記的FRET受體探針，但是僅有三個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)。這導(dǎo)致兩個(gè)檢測(cè)探針退火的競(jìng)爭(zhēng)。
測(cè)定條件與在實(shí)施例1中公開的基本上相同，改動(dòng)的是使用3×106個(gè)拷貝的靶DNA。
正向引物5‘-TGC CTT GCA TTT TCT GCT T-3‘(19聚體)(Seq.Id.No5)反向引物5‘-GAG TTG GGT GAT ACA TAC A-3‘(19聚體)(Seq.Id.No6)3’-熒光素HybProbe 15‘-GAA ATT CTT TGT TTG TAA TAT ACT GCT CTC TC-Fluos-3‘(32聚體)(Seq.Id.No7)5’-Red610 HybProbe la5‘-Red610-TGA TTT GGT CCA CGT ACC-3‘(18聚體)(Seq.Id.No8)5’-Red640HybProbe lb5‘-Red640-TGA TTT GGT CCA AGT ACC C-3‘(19聚體)(Seq.Id.No9)3’-熒光素HybProbe 25‘-GTT GGA GAC GTC TGC AGG TAT GTA TTC ATA GAC TCA A-Fluos-3‘(37聚體)(Seq.Id.No10)5’-Red705HybProbe 25‘-Red705-ATC TTC AAT TGT TCG AGG TT-3‘(20聚體)(Seq.Id.No11)3’-熒光素HybProbe 3
5‘-ATT TCC TTG GGG AGA AAT CTC GTG CCC A-Fluos-3‘(28聚體)(Seq.Id.No12)5’-Red5 HvbProbe 35‘-Cy5-ACC TGG TGA TGA ATC CCT TAC TAT TTA GAA TAA GGA AC-3‘(37聚體)(Seq.Id.No13)根據(jù)下列熱循環(huán)方案，在上述公開的作為本發(fā)明最好方式的LightCycler儀中進(jìn)行擴(kuò)增和隨后的解鏈曲線分析

結(jié)果顯示于圖7中。如可從圖中推斷出的，可使用適當(dāng)?shù)念伾a(bǔ)償方法，使用具有4種不同受體染料的雜交探針進(jìn)行4色解鏈曲線分析。然后可檢測(cè)雜交探針特異性解鏈峰，而不受任何顯著的相互干擾影響。
實(shí)施例3雙色TaqMan檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明最好方式的LightCycler儀提供用于雙色TaqMan測(cè)定的靈敏檢測(cè)的所有方法。用470nm LED完全激發(fā)公認(rèn)的TaqMan染料FAM和HEXs，并且在使用該儀器的顏色補(bǔ)償功能后可在具有高靈敏度的530nm和560nm檢測(cè)通道中進(jìn)行差異地鑒定。通過向確定的測(cè)定條件中補(bǔ)充BSA，簡(jiǎn)單地將雙色TaqMan測(cè)定方案轉(zhuǎn)移到根據(jù)本發(fā)明的儀器中。
在圖8中顯示了成功地進(jìn)行雙色擴(kuò)增和檢測(cè)的不同實(shí)例。圖8a顯示在使用FAM或HEX的單色實(shí)驗(yàn)中，獲得了雙色TaqMan測(cè)定的約1個(gè)拷貝/μl的檢測(cè)靈敏度。(PCR反應(yīng)后，僅陰性對(duì)照沒有產(chǎn)生熒光顯著增加)。圖8b顯示雙色實(shí)驗(yàn)，其中總是使用Hex標(biāo)記的TaqMan探針檢測(cè)第一個(gè)靶DNA的500個(gè)拷貝，且在同一反應(yīng)中使用FAM標(biāo)記的TaqMan探針檢測(cè)不同量(100-106拷貝)的第二個(gè)靶DNA。
動(dòng)態(tài)范圍(用于指示將要檢測(cè)的兩個(gè)靶濃度的相對(duì)差異)是約103。
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<221>misc_feature<223>因子V的引物，正向的<400>1gagagacatc gcctctgggcta 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>因子V的引物，反向的<400>2
tgttatcaca ctggtgctaa 20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>3’熒光素標(biāo)記的雜交探針<400>3aatacctgta ttcctcgcct gtc 23<210>4<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>5’Red610雜交探針<220>
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<221>misc_feature<223>5’Red705雜交探針<400>4agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt 36
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<221>misc_feature<223>正向引物<400>5tgccttgcat tttctgctt 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>反向引物<400>6gagttgggtg atacataca 19<210>7<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>3’-熒光素HybProbe 1<400>7gaaattcttt gtttgtaata tactgctctc tc 32
<210>8<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
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<221>misc_feature<223>5’-Red640 HybProbe 1b<400>9tgatttggtc caagtaccc19<210>10<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>3’-熒光素HybProbe 2<400>10gttggagacg tctgcaggta tgtattcata gactcaa37<210>11<211>20
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<221>misc_feature<223>5’-Red705 HybProbe 2<400>11atcttcaatt gttcgaggtt 20<210>12<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>3’-熒光素HybProbe 3<400>12atttccttgg ggagaaatct cgtgccca 28<210>13<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<223>5’-RedCy5 HybProbe 3<400>13acctggtgat gaatccctta ctatttagaa taaggaac 38
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行多色實(shí)時(shí)PCR的組合物或反應(yīng)混合物，其包括至少3對(duì)、優(yōu)選地4-5對(duì)，最優(yōu)選地確切地4對(duì)FRET雜交探針，每對(duì)雜交探針由攜帶FRET供體部分的FRET供體探針和攜帶具有550和710nm之間的發(fā)射最大值的FRET受體部分的FRET受體探針組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物或反應(yīng)混合物，其中至少3個(gè)、優(yōu)選地至少4個(gè)，最優(yōu)選地確切地4個(gè)FRET供體部分相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物或反應(yīng)混合物，其中所有FRET供體部分都相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物或反應(yīng)混合物，其中至少3個(gè)、優(yōu)選地至少4個(gè)，最優(yōu)選地確切地4個(gè)FRET供體部分是熒光素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物或反應(yīng)混合物，其中所有FRET供體部分都是熒光素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的組合物或反應(yīng)混合物，其中至少一個(gè)另外的FRET供體部分選自Atto425和WI343。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的組合物或反應(yīng)混合物，其中一個(gè)FRET受體部分選自LC-Red 705、Cy5.5和JA286。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的組合物或反應(yīng)混合物，其中至少一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)FRET受體部分選自Cy5、LC-Red 640和LC-Red 610。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的組合物或反應(yīng)混合物，其中一個(gè)FRET受體部分選自Rh6G和TAMRA。
10.一種進(jìn)行多色實(shí)時(shí)PCR的系統(tǒng)，其包括·實(shí)時(shí)PCR儀，和·根據(jù)權(quán)利要求1-9的組合物或反應(yīng)混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的系統(tǒng)，特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀包括·至少一個(gè)光源，優(yōu)選地是LED·至少4個(gè)，優(yōu)選地5-6個(gè)熒光檢測(cè)器實(shí)體，所述每個(gè)實(shí)體具有相互之間相差至少25，優(yōu)選地至少30nm的中心檢測(cè)波長(zhǎng)特征是所述檢測(cè)器實(shí)體能夠·同時(shí)檢測(cè)至少3個(gè)，優(yōu)選地4個(gè)，最優(yōu)選地5個(gè)不同標(biāo)記的FRET雜交探針對(duì)的最大熒光發(fā)射·同時(shí)檢測(cè)至少2個(gè)不同標(biāo)記的TaqMan雜交探針的最大熒光發(fā)射，和·檢測(cè)SybrGreenI的最大熒光發(fā)射·加熱和冷卻的裝置·容納反應(yīng)混合物的多個(gè)反應(yīng)容器。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的系統(tǒng)，特征是所述實(shí)時(shí)PCR儀確切地包括一個(gè)光源。
13.一種擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)靶DNA序列的方法，其包括a)提供根據(jù)權(quán)利要求1-9的組合物或反應(yīng)混合物，b)使所述反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)方案，以便可發(fā)生所述多個(gè)靶序列的擴(kuò)增，c)在許多擴(kuò)增循環(huán)后，至少一次監(jiān)控所述每對(duì)FRET雜交探針的雜交。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中至少一次監(jiān)控溫度依賴性方式的雜交。
15.一種實(shí)時(shí)PCR儀，其包括·至少一個(gè)光源，優(yōu)選地是LED·5-6個(gè)熒光監(jiān)測(cè)器實(shí)體，所述每個(gè)實(shí)體具有相互之間相差至少25，優(yōu)選地至少30nm的中心檢測(cè)波長(zhǎng)特征是所述檢測(cè)器實(shí)體能夠·同時(shí)檢測(cè)至少3個(gè)，優(yōu)選地4個(gè)，最優(yōu)選地5個(gè)不同標(biāo)記的FRET雜交探針對(duì)的最大熒光發(fā)射，·同時(shí)檢測(cè)至少2個(gè)不同標(biāo)記的TaqMan雜交探針的最大熒光發(fā)射，和·檢測(cè)SybrGreenI的最大熒光發(fā)射·加熱和冷卻的裝置·容納反應(yīng)混合物的多個(gè)反應(yīng)容器。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的實(shí)時(shí)PCR儀，其確切地包括一個(gè)光源。
17.根據(jù)權(quán)利要求15-16的儀器，特征是所述的中心檢測(cè)波長(zhǎng)選自520-540nm、545-565nm、570-590nm、600-620nm、630-650nm、660-680nm和700-720nm的波長(zhǎng)范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及進(jìn)行多色實(shí)時(shí)PCR的系統(tǒng)，包括靈活的實(shí)時(shí)PCR儀和用于進(jìn)行多重PCR的特殊的組合物或反應(yīng)混合物；特別是，本發(fā)明涉及包含至少3對(duì)，優(yōu)選地4－5對(duì)，最優(yōu)選地確切地4對(duì)FRET雜交探針的組合物或反應(yīng)混合物。所述每對(duì)雜交探針都由攜帶FRET供體部分的FRET供體探針和攜帶具有550和710nm之間的發(fā)射最大值的FRET受體部分的FRET受體探針組成。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1768151SQ200480009026
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者G·薩格納, I·貝希勒, J·博爾特, D·海因德爾, H·-P·約瑟爾, M·古特昆斯特, R·塞布爾, C·米勒 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司