專利名稱：瓊脂分解酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及瓊脂分解酶及其應(yīng)用，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及比以往的瓊脂分解酶活性更高、耐熱性更強(qiáng)的新型瓊脂分解酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瓊脂是從石花菜、發(fā)菜等紅藻類中得到的多糖類物質(zhì)，其主要成分是瓊脂糖。另外瓊脂中還存在少量被總稱為瓊脂膠的多糖，瓊脂膠是瓊脂糖與硫酸、硫酸丙酮酸等成酯而形成的。
用瓊脂分解酶β-瓊脂糖酶水解瓊脂糖可以得到新瓊脂寡聚糖(ネオアガロオリグ糖)，此物質(zhì)以其防止淀粉老化作用強(qiáng)、經(jīng)加熱處理會(huì)產(chǎn)生抑菌作用、熱量低等方面的特點(diǎn)在食品領(lǐng)域作為高性能食品的原料非常有用(例如，參照河野敏明，《瓊脂寡聚糖(新瓊脂寡聚糖)》，食品包裝，(1990)，22(1)100-105)。而且，用β-瓊脂糖酶水解海藻成分得到的寡聚糖中具有的免疫功能活性(例如，參照Yoshizawa Y.，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，(1995)，59(10)1933-1937.)、美白和保濕皮膚的效果(例如，參照Kobayashi R.，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，(1997)，61(1)162-162.)已得到確認(rèn)。
另一方面，作為未開發(fā)的海洋生物資源的新型有效應(yīng)用，人們期待使用瓊脂分解酶分解海藻類的堅(jiān)固的細(xì)胞組織以提取具有生理活性的物質(zhì)，或是利用使用該酶制得的原生質(zhì)體(例如，參照Araki T.，et al.，J.Mar.Biotechnol.，(1998)，6(3)193-197.)來(lái)開發(fā)海藻的有用品種。
然而，由于以往大家知道的瓊脂分解酶(例如，參照特開平6-284888號(hào)公報(bào))生產(chǎn)率低且價(jià)格高，因而存在難以應(yīng)用于工業(yè)的問(wèn)題，并且其酶活性及耐熱性不充分，不能廣泛應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)界。
因此，本發(fā)明的課題在于提供一種瓊脂分解酶，其比以往的瓊脂分解酶具有更出色的瓊脂分解能力及耐熱性，并且能夠大量生產(chǎn)；還提供能夠利用基因工程技術(shù)制造該酶的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題，專心研究了自然界中產(chǎn)生瓊脂分解酶的微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從海底的土壤中分離的新型微球根菌屬(Microbulbifer)微生物具有極高的瓊脂分解能力，并能產(chǎn)生耐熱性等也很出色的瓊脂分解酶。并且，克隆了該微生物的瓊脂分解酶基因，發(fā)現(xiàn)了利用該基因通過(guò)基因重組技術(shù)能夠大量生產(chǎn)瓊脂分解酶，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的第一目的在于提供具有如下性質(zhì)的瓊脂分解酶。
(1)作用水解瓊脂糖的β-1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖(ネオアガロオリゴ糖)；(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有上述骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖；(3)溫度的影響于大于或等于54℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后活性仍殘留。
本發(fā)明的第二目的在于提供來(lái)源于微球根菌屬的微生物的所述瓊脂分解酶。
本發(fā)明的第三目的在于提供上述瓊脂分解酶，其中，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8320的微球根菌屬sp.1325-A7，所述瓊脂分解酶于大于或等于54℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的25％或其以上。
本發(fā)明的第四目的在于提供上述瓊脂分解酶，其中，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8319的微球根菌屬sp.1325-A3，所述瓊脂分解酶于大于或等于60℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的20％以上。
本發(fā)明的第五目的在于提供上述瓊脂分解酶，其中，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8321的微球根菌屬sp.A94，所述瓊脂分解酶于大于或等于60℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的7％以上。
并且，本發(fā)明的其他目的在于提供上述瓊脂分解酶。該分解酶具有下述氨基酸序列序列號(hào)1、5或9所表示的氨基酸序列、或上述氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入而形成的序列。
還有，本發(fā)明的其他目的在于提供一種多核苷酸、具有該多核苷酸的重組載體及用該重組載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的微生物。該多核苷酸編碼下述氨基酸序列序列號(hào)碼1、5或9所表示的氨基酸序列、或上述氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入而形成的序列。
另外，本發(fā)明的其他目的還在于提供瓊脂分解酶的制造方法，其特征是培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化了的微生物并從培養(yǎng)物中提取瓊脂分解酶；提供新瓊脂寡聚糖或原生質(zhì)體的制造方法，其中，通過(guò)使前述瓊脂分解酶作用于藻類而得到新瓊脂寡聚糖；提供回收瓊脂糖凝膠中DNA的方法，其特征是使所述瓊脂分解酶作用于加了DNA的瓊脂糖凝膠，從而回收瓊脂糖凝膠中的DNA。


圖1示意表示微球根菌屬sp.1325-A7的分類學(xué)位置。
圖2示意表示微球根菌屬sp.1325-A3的分類學(xué)位置。
圖3示意表示微球根菌屬sp.A94的分類學(xué)位置。
圖4示意表示RagaA7水解生成物的薄層色譜分析結(jié)果(P是用來(lái)源于P.atlantica的酶所制備的新瓊脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新瓊脂四聚糖(Neoagarotetraose)，NA6表示新瓊脂六聚糖(Neoagarohexaose))。
圖5示意表示RagaA7的酶活性與pH的關(guān)系。
圖6示意表示于40℃保溫30分鐘后RagaA7的酶活性與pH的關(guān)系。
圖7示意表示RagaA7的酶活性與溫度的關(guān)系。
圖8示意表示RagaA7及PSA的溫度穩(wěn)定性(●為RagaA7，○為PSA)。
圖9示意表示RagaA7及PSA對(duì)SDS的穩(wěn)定性(●為RagaA7，○為PSA)。
圖10示意表示RagaA3水解生成物的薄層色譜分析結(jié)果(P是用來(lái)源于P.atlantica的酶所制備的新瓊脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新瓊脂四聚糖，NA6表示新瓊脂六聚糖)。
圖11示意表示RagaA3的酶活性與pH的關(guān)系。
圖12示意表示于40℃保溫30分鐘后RagaA3的酶活性與pH的關(guān)系。
圖13示意表示RagaA3的酶活性與溫度的關(guān)系。
圖14示意表示RagaA3及PSA的溫度穩(wěn)定性(●為RagaA3，○為PSA)。
圖15示意表示RagaA3及PSA對(duì)SDS的穩(wěn)定性(●為RagaA3，○為PSA)。
圖16示意表示RagaB水解生成物的薄層色譜分析結(jié)果(P是用來(lái)源于P.atlantica的酶調(diào)制的新瓊脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新瓊脂四聚糖，NA6表示新瓊脂六聚糖)。
圖17示意表示RagaB的酶活性與pH的關(guān)系。
圖18示意表示于40℃保溫30分鐘后RagaB的酶活性與pH的關(guān)系。
圖19示意表示RagaB的酶活性與溫度的關(guān)系。
圖20示意表示RagaB及PSA的溫度穩(wěn)定性(●為RagaB，○為PSA)。
圖21示意表示RagaB及PSA對(duì)SDS的穩(wěn)定性(●為RagaB，○為PSA)。
另外，表1、表2、及表3中所翻譯的各細(xì)菌種屬名對(duì)應(yīng)的拉丁名如下鹽水沼棲微球根菌Microbulbifer salipuludis伸長(zhǎng)假單孢菌Pseudomonas elongata水解微球根菌Microbulbifer hydrolyticus微球根菌屬sp.2-40Microbulbifer sp.2-40綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa
大腸桿菌E.coli具體實(shí)施方式
與以往的瓊脂分解酶相比，本發(fā)明的瓊脂分解酶(下文稱為“本發(fā)明酶”)的瓊脂分解能力及耐熱性顯著提高，優(yōu)選來(lái)源于微球根菌屬微生物的瓊脂分解酶。另外，所謂“來(lái)源于微球根菌屬微生物”僅是指本發(fā)明酶的存在首先在微球根菌屬微生物中被發(fā)現(xiàn)，利用編碼從微球根菌屬微生物提取到的本發(fā)明酶的多核苷酸在其他微生物中產(chǎn)生的本發(fā)明酶、或是從屬于其他屬的微生物中得到的具有同樣性質(zhì)的瓊脂分解酶也屬于本發(fā)明的酶。
作為本發(fā)明酶的代表例，可以例舉為微球根菌屬sp.1325-A7所產(chǎn)生的瓊脂分解酶(被命名為RagaA7)；微球根菌屬sp.1325-A3所產(chǎn)生的瓊脂分解酶(被命名為RagaA3)；以及微球根菌屬sp.A94所產(chǎn)生的瓊脂分解酶(被命名為RagaB)。下面依次對(duì)此進(jìn)行說(shuō)明。
(A1)RagaA7的特性(1)作用水解瓊脂糖的β-1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖；(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類以及具有同樣骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖；(3)溫度的影響作用溫度為15℃～70℃，最佳作用溫度為45℃～55℃。于54℃進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的35％或35％以上，優(yōu)選40％或40％以上；70℃時(shí)為25％或25％以上，優(yōu)選35％或35％以上；80℃時(shí)也為25％或25％以上，優(yōu)選35％或35％以上。
(4)表面活性劑的影響不被1％的多聚仙梨醇P40(Nonidet P40)、粹通X-100(Triton X 100)、吐溫20(Tween 20)及十二烷基磺酸鈉(SDS)抑制。
(5)對(duì)SDS的穩(wěn)定性于40℃、1.5％的SDS中處理1小時(shí)后保持與未處理時(shí)同樣的活性。
(6)比活性大于等于100U/mg，優(yōu)選大于等于200U/mg。
(7)pH穩(wěn)定性及作用最佳pH在pH4～10的范圍中穩(wěn)定。作用pH范圍為3～10，最佳pH為5～7.5。
(8)分子量30～49kDa(以SDS-PAGE測(cè)定)。
(9)金屬鹽等的影響受Hg2+、Pb3+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。在1M的NaCl中保持約80％的活性。于40℃在100mM的EDTA中處理1小時(shí)后保持約60％的活性。
(10)等電點(diǎn)3.5～4.5(11)對(duì)化學(xué)試劑的耐性受0.1mM的N-溴代丁二酰亞胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及對(duì)(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基順丁烯二酰亞胺、10mM的二硫蘇糖醇及2-巰基乙醇的抑制。
產(chǎn)生所述RagaA7的微球根菌屬sp.1325-A7，具有以下的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)。
(A2)微球根菌屬sp.1325-A7的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)<形態(tài)>
在Marine broth 2216培養(yǎng)液(Difco公司制造)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。
細(xì)胞的形態(tài)桿菌細(xì)胞的大小0.5μm～0.8μm×1.5μm～5.0μm運(yùn)動(dòng)性有鞭毛有革蘭氏染色性陰性胞子形成無(wú)<生長(zhǎng)狀態(tài)>
在液體培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀態(tài)。
最適溫度于10℃～43℃生長(zhǎng)良好食鹽濃度于0.5％～10％生長(zhǎng)良好<生理學(xué)性質(zhì)>
O-F測(cè)試F過(guò)氧化氫酶測(cè)試陽(yáng)性氧化酶測(cè)試陽(yáng)性凝膠分解性能有淀粉分解性能有ONPG測(cè)試陰性尿素酶產(chǎn)生無(wú)硫化氫產(chǎn)生無(wú)吲哚產(chǎn)生無(wú)硝酸還原性能無(wú)利用特性(L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)有(B1)RagaA3的特性(1)作用水解瓊脂糖的β-1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖；(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖；(3)溫度的影響作用溫度為5℃～70℃，最佳作用溫度為50℃～60℃。于60℃進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的40％或40％以上，優(yōu)選50％或50％以上；80℃時(shí)為20％或20％以上，優(yōu)選30％或30％以上。
(4)表面活性劑的影響不被1％的Nonidet P40、Triton X100、Tween20及SDS抑制。
(5)對(duì)SDS的穩(wěn)定性于40℃、至少1％的SDS中處理1小時(shí)后，保持未處理時(shí)40％的活性。
(6)比活性大于等于300U/mg，優(yōu)選大于等于350U/mg。
(7)pH穩(wěn)定性及作用最佳pH在pH5～10的范圍中穩(wěn)定。作用pH范圍為3.5～9.5，最佳pH為6.5～7.5。
(8)分子量30～66kDa(以SDS-PAGE測(cè)定)。
(9)金屬鹽等的影響受Hg2+、Cu2+、Pb3+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制。略受Fe2+的抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。
在1M的NaCl中保持約90％的活性。
于40℃、100mM的EDTA中處理1小時(shí)后保持約80％的活性。
(10)等電點(diǎn)3.5～4.5(11)對(duì)化學(xué)試劑的耐性受0.1mM的N-溴代丁二酰亞胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及對(duì)(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基順丁烯二酰亞胺、10mM的二硫蘇糖醇及2-巰基乙醇的抑制。
產(chǎn)生所述RagaA3的微球根菌屬sp.1325-A3，具有以下的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)。
(B2)微球根菌屬sp.1325-A3的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)<形態(tài)>
在Marine broth 2216培養(yǎng)液(Difco公司制造)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。
細(xì)胞的形態(tài)桿菌細(xì)胞的大小0.4μm～0.6μm×4.0μm～8.0μm運(yùn)動(dòng)性無(wú)鞭毛無(wú)革蘭氏染色性陰性胞子形成無(wú)<生長(zhǎng)狀態(tài)>
在液體培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀態(tài)。
最適溫度于15℃～35℃生長(zhǎng)良好食鹽濃度于1％～5％生長(zhǎng)良好<生理學(xué)性質(zhì)>
O-F測(cè)試F過(guò)氧化氫酶測(cè)試陽(yáng)性氧化酶測(cè)試陽(yáng)性凝膠分解性能有淀粉分解性能有ONPG測(cè)試陽(yáng)性尿素酶產(chǎn)生無(wú)硫化氫產(chǎn)生無(wú)吲哚產(chǎn)生無(wú)硝酸還原性能有利用特性(L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)有(C1)RagaB的特性(1)作用水解瓊脂糖的β-1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖；(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖；(3)溫度的影響作用溫度為10℃～70℃，最佳作用溫度為50℃～60℃。于60℃進(jìn)行30分鐘的熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的25％或25％以上，優(yōu)選30％或30％以上；80℃時(shí)為7％或7％以上，優(yōu)選10％或10％以上。
(4)表面活性劑的影響不被1％的Nonidet P40、Triton X 100、Tween20及SDS抑制。
(5)對(duì)SDS的穩(wěn)定性于40℃、2.0％的SDS中處理1小時(shí)后保持與未處理時(shí)同樣的活性。于40℃、0.4％的SDS中處理1小時(shí)后，具有未處理時(shí)2倍的活性。
(6)比活性大于等于400U/mg，優(yōu)選大于等于450U/mg。
(7)pH穩(wěn)定性及作用最佳pH在pH8～9的范圍中穩(wěn)定。在pH4～10的范圍中殘留約50％的活性。作用最佳pH為6.5～7.5。
(8)分子量30～49kDa(以SDS-PAGE測(cè)定)。
(9)金屬鹽等的影響受Hg2+、Cu2+、Pb3+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制。略受Fe2+的抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。在1M的NaCl中保持約90％的活性。于40℃、100mM的EDTA中處理1小時(shí)后約保持74％的活性。
(10)等電點(diǎn)3.7～5.2(11)對(duì)化學(xué)試劑的耐性受0.1mM的N-溴代丁二酰亞胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及對(duì)(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基順丁烯二酰亞胺、10mM的二硫蘇糖醇及2-巰基乙醇的抑制。
產(chǎn)生所述RagaB的微球根菌屬sp.A94，具有以下的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)。
(C2)微球根菌屬sp.A94的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)<形態(tài)>
在Marine broth 2216培養(yǎng)液(Difco公司制造)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。
細(xì)胞的形態(tài)桿菌細(xì)胞的大小0.6μm～0.8μm×3.0μm～6.0μm運(yùn)動(dòng)性有鞭毛有革蘭氏染色性陰性胞子形成無(wú)<生長(zhǎng)狀態(tài)>
在液體培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀態(tài)。
最適溫度于20℃～52℃生長(zhǎng)良好食鹽濃度于1％～5％生長(zhǎng)良好<生理學(xué)性質(zhì)>
O-F測(cè)試F過(guò)氧化氫酶測(cè)試陽(yáng)性氧化酶測(cè)試陽(yáng)性凝膠分解性能有淀粉分解性能有ONPG測(cè)試陰性尿素酶產(chǎn)生無(wú)硫化氫產(chǎn)生無(wú)吲哚產(chǎn)生無(wú)硝酸還原性能有利用特性(L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)有含有所述微生物的產(chǎn)生本發(fā)明酶的微生物能夠以如下方法得到，當(dāng)然并不僅限于如下方法。首先，在含有瓊脂或瓊脂糖的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)提取到的微生物群，挑選具有分解瓊脂能力的微生物。此培養(yǎng)基既可以是在含有瓊脂的培養(yǎng)基里適量含有氮源、無(wú)機(jī)化合物等營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，也可以使用天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基的任意一種。
所述微球根菌屬sp.1325-A7、微球根菌屬sp.1325-A3及微球根菌屬sp.A94的每一種都是發(fā)明人從相模灣、駿河灣的海底的淤泥中得到的微球根菌屬微生物。
然后，用CLUSTAL×多重序列排列程序(Multiple SequenceAlignment Program，version 1.81)測(cè)定各微球根菌屬菌株的16S rDNA序列，解析分類學(xué)的位置。基于鄰位相連法(neighbor-joiningmethod)于圖1、圖2及圖3表示記載了解析結(jié)果的系統(tǒng)樹。從其結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，微球根菌屬sp.1325-A7、微球根菌屬sp.1325-A3及微球根菌屬sp.A94是微球根菌屬的新型種。
另外，由于微球根菌屬sp.1325-A7及微球根菌屬sp.A94具有運(yùn)動(dòng)性，它們也可能屬于微球根菌屬以外的新型屬，但為了方便將其歸為關(guān)系最近的微球根菌屬的新型種。
于是，本申請(qǐng)人將其分別命名為1325-A7、1325-A3及A94，并于2003年3月6日將其保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)進(jìn)行國(guó)際保藏(保藏號(hào)為FERM BP-8319～8321)。
從包含所述微球根菌屬sp.1325-A7、1325-A3及A94的產(chǎn)生本發(fā)明酶的微生物中提取本發(fā)明酶時(shí)，例如可以按常規(guī)方法培養(yǎng)該微生物，然后從培養(yǎng)物中回收本發(fā)明酶。
為了得到本發(fā)明酶，可以使用如下的方法培養(yǎng)微生物，當(dāng)然并不僅限于如下方法。將菌株接種至培養(yǎng)基，然后可以按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基最好含有瓊脂或瓊脂糖、瓊脂分解物等作為碳源。另外，培養(yǎng)基中也可以適量含有本菌株能夠利用的碳源及氮源。瓊脂和瓊脂糖可以單獨(dú)或混合使用市面上出售的商品、或是加工精制之前的紅藻類。對(duì)于其他的碳源及氮源沒(méi)有特殊限制，作為氮源可以例舉為牛肉浸膏、酵母浸膏、酪蛋白分解物、胰蛋白胨、蛋白胨等，優(yōu)選使用酵母浸膏和蛋白胨。這些氮源也可以用作瓊脂、瓊脂糖以外的碳源。并且，作為鹽類可以組合使用氯化鈉、枸櫞酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫鈉等。還可以向含有瓊脂、瓊脂糖以外的所述成分的Marine broth 2216(Difco公司制造)中添加含有瓊脂或瓊脂糖的物質(zhì)來(lái)使用。并且，還可以使用含有適量所述鹽類的人工海水，在其中添加有蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂或瓊脂糖等物質(zhì)，將其用作培養(yǎng)基。優(yōu)選瓊脂或瓊脂糖的濃度為0.1％～1.5％，此時(shí)通過(guò)任意改變瓊脂或瓊脂糖的濃度可以分別制作固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；以生產(chǎn)酶為目的時(shí)，優(yōu)選濃度為0.1％～0.4％的液體培養(yǎng)基；以保存菌株為目的時(shí)，優(yōu)選濃度為1.2％～1.5％的固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件根據(jù)培養(yǎng)基的構(gòu)成稍有不同，培養(yǎng)溫度為10℃～43℃，優(yōu)選25℃～39℃；培養(yǎng)時(shí)間為15小時(shí)～48小時(shí)，優(yōu)選18小時(shí)～24小時(shí)。
可以按照一般提取酶的方式從如此得到的培養(yǎng)物中回收目的物質(zhì)瓊脂分解酶。回收方法不僅限于如下方法，可以例舉為，用超聲波破碎法、法式壓濾(French press)法、玻璃珠破碎法、ダイノミル破碎法等菌體破碎法得到菌體破碎物，通過(guò)離心過(guò)濾該菌體破碎物或培養(yǎng)物等的操作，將分離得到的培養(yǎng)液上清液用作粗酶液。
該粗酶液，既可以直接使用，也可以根據(jù)需要，結(jié)合使用鹽析法、沉淀法、超濾法等分離手段以及離子交換色譜法、等電點(diǎn)色譜法、疏水性色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法、吸附色譜法、親和性色譜法、逆相色譜法等眾所周知的方法，進(jìn)一步分離精制后的酶液進(jìn)行使用。
另外，作為得到本發(fā)明酶的其他方法，還可以例舉為，從微球根菌屬sp.1325-A7、微球根菌屬sp.1325-A3、微球根菌屬sp.A94等產(chǎn)生本發(fā)明酶的微生物中提取編碼本發(fā)明酶的基因后，用基因工程技術(shù)制作重組微生物，然后培養(yǎng)該重組微生物。具體地說(shuō)就是，從所述菌株中提取編碼本發(fā)明酶氨基酸序列的核苷酸序列，之后將此核苷酸序列導(dǎo)入合適的載體，然后用此載體對(duì)大腸桿菌等宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)此細(xì)胞以生產(chǎn)本發(fā)明酶，再?gòu)呐囵B(yǎng)物中提取本發(fā)明酶。
下面對(duì)使用基因工程技術(shù)制造本發(fā)明酶的方法進(jìn)行具體說(shuō)明。
在本發(fā)明酶中，RagaA7為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列表中序列號(hào)1所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)1所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列、或與所述序列號(hào)1所表示的序列具有56％或其以上同源性的氨基酸序列。優(yōu)選RagaA7為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列號(hào)1所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)1所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的序列。
因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造與RagaA7相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明酶時(shí)，需要使用與其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。另外，可以例舉所述同源性大于等于56％，優(yōu)選大于等于80％，更優(yōu)選大于等于95％。
編碼RagaA7的氨基酸序列的核苷酸序列具體可以例舉為從如下(a1)～(d1)中選出的多核苷酸。
(a1)編碼具有如序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b1)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；(c1)具有如序列表的序列號(hào)2所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d1)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)2所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
同樣的，在本發(fā)明酶中，RagaA3為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列號(hào)5所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)5所表示的該氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列、或與所述序列號(hào)1所表示的序列具有56％或其以上同源性的氨基酸序列。優(yōu)選RagaA3為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列號(hào)5所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)5所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的序列。
因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造與RagaA3相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明酶時(shí)，需要使用與其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。另外，可以例舉所述同源性大于等于56％，優(yōu)選大于等于80％，更優(yōu)選大于等于95％。
編碼RagaA3的氨基酸序列的核苷酸序列可以具體例舉為從如下(a2)～(d2)中選出的多核苷酸。
(a2)編碼具有如序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b2)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；(c2)具有如序列表的序列號(hào)6所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d2)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)6所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
并且，在本發(fā)明酶中，RagaB為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列表中序列號(hào)9所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)9所表示的該氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列、或與所述序列號(hào)9所表示序列具有63％或其以上同源性的氨基酸序列。優(yōu)選RagaB為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列為以序列號(hào)9所表示的氨基酸序列、或所述序列號(hào)9所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的序列。
因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造與RagaA3相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明酶時(shí)，需要使用與其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。另外，可以例舉所述同源性大于等于63％，優(yōu)選大于等于80％，更優(yōu)選大于等于95％。
編碼RagaB的氨基酸序列的核苷酸序列可以具體例舉為從如下(a3)～(d3)中選出的多核苷酸。
(a3)編碼具有如序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b3)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)9所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；
(c3)具有如序列表的序列號(hào)10所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d3)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)10所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
生產(chǎn)本發(fā)明酶的重組微生物可以結(jié)合多種公認(rèn)的方式進(jìn)行制造。即，可利用該領(lǐng)域既成的方法，從所述微球根菌屬sp.1325-A7、微球根菌屬sp.1325-A3、微球根菌屬sp.A94中提取編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，并擴(kuò)增該核苷酸序列，然后將核苷酸序列導(dǎo)入載體，再以此基因?qū)λ拗鬟M(jìn)行轉(zhuǎn)化。
其中，制造重組微生物可以使用例如如下所示的方法，當(dāng)然并不只限于此方法。用鳥槍克隆法、或是使用特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從產(chǎn)生瓊脂分解酶的細(xì)菌中得到瓊脂分解酶基因。將此基因?qū)胍訣K系的E.coli(大腸桿菌)等為代表的革蘭氏陰性菌或以BS系的B.subtilis(枯草芽孢桿菌)等為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌，得到重組體。進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，可以將質(zhì)粒等核外基因用作載體，或是利用宿主細(xì)菌原來(lái)就具有的DNA吸收能力來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
而且，也可以按照前述方法、公知的方法、或是基于這些方法的方法，來(lái)培養(yǎng)如上制造的重組微生物、從培養(yǎng)物中提取本發(fā)明酶、并且精制該酶。
另外，本發(fā)明中，若不作特殊表示，則以0.2％精制瓊脂(Nacalai公司制造)作為底物時(shí)，酶的活性是在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中測(cè)定的。以3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶反應(yīng)生成的還原糖。因此，本發(fā)明中，將每分鐘生成相當(dāng)于1μmol的D-半乳糖的量的還原糖的酶活性表示為1個(gè)單位(U)。
與以往的瓊脂分解酶相同，如上得到的本發(fā)明酶，可以用于以藻類破碎物或是提取物為原料的來(lái)源于瓊脂的寡聚糖的制造(其中，藻類破碎物或提取物包含具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖)，還可以作為研究用試劑在電泳后從凝膠中回收點(diǎn)樣在瓊脂糖中的DNA。并且本發(fā)明酶還能用于從藻類、特別是紅藻類制造原生質(zhì)體，或是提取有用的物質(zhì)。
具體地說(shuō)就是，來(lái)源于瓊脂的寡聚糖可以用如下方法制造，當(dāng)然并不只限于此方法。將本發(fā)明的瓊脂分解酶混合在藻類的破碎物或提取物中(其中，藻類破碎物或提取物包含具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖)，通過(guò)在pH4～10、30℃～50℃的條件下保溫，能夠生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖等寡聚糖。
如此得到的來(lái)源于瓊脂的寡聚糖等寡聚糖可以具有如下用途，當(dāng)然并不限于以下用途。例如，可以用作低熱量食品、對(duì)加熱處理后產(chǎn)生的某種微生物具有抑菌作用或是具有防止淀粉老化作用的食品改良劑、具有藥理作用(例如，調(diào)節(jié)免疫功能、降血壓、抗癌、促進(jìn)腸蠕動(dòng)等)的醫(yī)藥品或功能性食品、或具有保濕美白作用的化妝品成分等。
另外，例如可以用如下方法從電泳后的瓊脂糖凝膠中回收點(diǎn)樣在凝膠中的DNA，當(dāng)然并不只限于此方法。電泳分離DNA后，向含有目的DNA片段的瓊脂糖片段中添加本發(fā)明酶，進(jìn)行溶解。溶解后，還可以根據(jù)需要對(duì)含有DNA片段的溶液進(jìn)一步進(jìn)行精制處理，例如單獨(dú)或并用苯酚處理、乙醇沉淀、以柱層析或樹脂精制等方法。
并且，可以按如下順序以藻類為原料來(lái)制造原生質(zhì)體(其中，藻類的細(xì)胞組織成分中具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類)，當(dāng)然不只限于此方法。在含有0.7M甘露醇的MES緩沖液(pH7.5)中用木瓜蛋白酶作用于海藻試樣，之后使用含有0.7M甘露醇的MES緩沖液(pH7.5)，將上述處理后的海藻試樣于40μm的尼龍網(wǎng)上進(jìn)行過(guò)濾清洗，然后用刀片將洗凈的葉片切成數(shù)毫米的碎片。將碎片于含有本發(fā)明酶和市售的纖維素酶Onozuka RS及マイセロチ一ムR-10的含有0.7M甘露醇的MES緩沖液(pH6.0)中震蕩，能夠得到原生質(zhì)體。
如此得到的原生質(zhì)體可以有如下用途，當(dāng)然不止限于以下用途。例如，可用于提取海藻中的生理活性物質(zhì)等有用物質(zhì)、培養(yǎng)海藻組織、研究海藻細(xì)胞的生化及生理學(xué)性質(zhì)、開發(fā)利用了細(xì)胞融合或基因?qū)氲鹊暮Ｔ逵杏闷贩N。
實(shí)施例下面舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不只限于這些在如下實(shí)施例中，分別按照Saito等(Saito H，Miura K.，BiochemBiophys Acta，72619-629，(1963))及Birnboim等(Birnboim HC，Doly J.，Nucreic Acids Res.，71513-1523，(1979))記述的方法制備染色體DNA和質(zhì)粒DNA。其他的基本基因操作按照Sambrook等(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.，Molecular Cloninga Laboratory Manual，2nd edn Cold SpringHarbor Larboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，(1982))記述的方法進(jìn)行。并且，按照Hanahan等(Hanahan D.，J.Mol.Gen.Genet.，166557-580，(1983))記述的方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，按照Chang等(Chang S.，Cohen SN.，Mol.Gen.Genet.，168111-115，(1979))記述的方法進(jìn)行了對(duì)枯草桿菌的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1瓊脂分解細(xì)菌的篩選用Marine broth 2216培養(yǎng)液(Difco公司制造)適度稀釋保存于海洋科學(xué)技術(shù)中心的海底土壤樣品后，接種于Marine瓊脂平板培養(yǎng)基，在15℃～55℃的各種溫度下培養(yǎng)16～48小時(shí)。將分解了菌落周圍的瓊脂并在所應(yīng)用的平板培養(yǎng)基上形成有凹陷的細(xì)菌再接種于另外的Marine瓊脂平板培養(yǎng)基，在適合該細(xì)菌的溫度條件下培養(yǎng)。然后，在同樣的培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行劃線培養(yǎng)以分離瓊脂分解細(xì)菌。
在如上篩選得到的瓊脂分解細(xì)菌中得到了1325-A7菌株、1325-A3菌株及A94菌株，這些菌株是能夠產(chǎn)生比以往被人們所知的瓊脂分解酶活性更高的瓊脂分解酶的微生物。用CLUSTAL×多重序列排列程序(Multiple Sequence Alignment Program，version 1.81)測(cè)定這些菌株的16SrDNA序列，解析分類學(xué)的位置后我們認(rèn)為，1325-A7菌株、1325-A3菌株及A94菌株都很可能是微球根菌屬的新型種。然而，由于1325-A7菌株及A94菌株具有運(yùn)動(dòng)性，也不排除其屬于微球根菌屬以外的的新型屬的可能性。
實(shí)施例2(1)瓊脂糖酶基因的解析(1)用HindIII和EcoRI消化微球根菌屬sp.1325-A7菌株(下文省略為“1325-A7菌株”)的染色體DNA，得到DNA片段。用高純度PCR產(chǎn)品純化試劑盒(Roche公司制造)精制該DNA片段，得到精制DNA片段。用DNA連接試劑盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)將此精制DNA片段和預(yù)先用HindIII和EcoRI消化過(guò)的質(zhì)粒載體pUC18(TaKaRa公司制造)連接起來(lái)。用此連接混合液對(duì)E.coli HB101(F’supE44 hsdS20 recA13 ara-14 proA2lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5mtl-1 leuB6 thi-1)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以此制備轉(zhuǎn)化體。
將如上制作的轉(zhuǎn)化體接種至瓊脂培養(yǎng)基，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上形成有凹陷的菌落作為具有瓊脂分解活性的克隆體。將挑選出的具有瓊脂分解活性的克隆在LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化鈉、7.5μg/ml的四環(huán)素或50μg/ml的氨芐青霉素)上劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)一夜。之后，用碘溶液染色培養(yǎng)基，將在菌體的周圍形成了被認(rèn)為是生成了源自瓊脂的還原糖的透明光環(huán)的菌落視為目的克隆體。將如此得到的克隆體培養(yǎng)在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，再?gòu)呐囵B(yǎng)得到的細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pUA7。
用與pUC18的多克隆位點(diǎn)的上游及下游序列相對(duì)應(yīng)的如下引物，對(duì)所得重組質(zhì)粒pUA7的插入片段的核苷酸序列進(jìn)行解析。
引物15’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’引物25’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’確定此重組質(zhì)粒pUA7的插入片段的核苷酸序列(序列號(hào)3)后，發(fā)現(xiàn)插入片段的大小為2747bp，G+C含量為55％，其中有1326bp的開放閱讀框(ORF)。此開放閱讀框編碼由441個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。并且在起始密碼子的8bp上游存在有被推斷為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在64bp上游存在有被推斷為大腸桿菌(E.coli)σ70型的啟動(dòng)子序列5’-TTCAAA-3’(-35區(qū)域)和5’-TAACCT-3’(-10區(qū)域)(經(jīng)GENETYX-MAC 10.1啟動(dòng)子檢索，啟動(dòng)子值為50.9)。在終止密碼子的36bp下游處存在有反向重復(fù)序列，推測(cè)其起到轉(zhuǎn)錄終止子的作用。
并且，對(duì)所述ORF(下文稱為“AgaA7”)編碼的氨基酸序列進(jìn)行了FASTA同源性檢索(http//ddbj.nig.ac.jp)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部氨基酸(441個(gè)氨基酸)與源自假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)ND137菌株、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)B9菌株、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2種)、微顫菌屬(Microscillasp.)PRE1菌株、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的β-瓊脂糖酶分別有55.3％、54.3％、52.6％、47.5％、41.2％、37.5％、34.5％的部分具有一致性。
(2)瓊脂糖酶的表達(dá)及精制(1)將編碼AgaA7的DNA片段導(dǎo)入表達(dá)用載體pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，將得到的重組質(zhì)粒命名為pA7AG。用pA7AG轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101。將得到的轉(zhuǎn)化體于LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)一夜后，通過(guò)瓊脂上的凹陷來(lái)確認(rèn)在大腸桿菌HB101中重組體的瓊脂糖酶活性。
另外，還以革蘭氏陽(yáng)性菌中的枯草桿菌(B.subtilis)ISW1214(leuA8metB5 hsrM1)為宿主對(duì)重組瓊脂糖酶進(jìn)行了高表達(dá)。用pA7AG轉(zhuǎn)化枯草桿菌ISW1214，用CSL培養(yǎng)基(10％谷物浸提液、0.5％魚肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氫鉀、0.02％七水硫酸鎂、0.05％氯化鈣、6％麥芽糖、15μg/ml四環(huán)素、pH6.8)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體72小時(shí)，得到82.5ml的培養(yǎng)物上清液。
于4℃或以下進(jìn)行所述培養(yǎng)物上清液的精制。首先，以6500×g的轉(zhuǎn)速離心培養(yǎng)物上清液10分鐘，分離菌體和培養(yǎng)物上清液。向得到的培養(yǎng)物上清液中緩緩添加硫酸銨，使其達(dá)到60％的飽和。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心回收生成的鹽析物，再用少量20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)重懸沉淀物，用前述的緩沖液進(jìn)行一夜透析。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘除去不溶殘?jiān)?，將其吸附在預(yù)先用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M層析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述緩沖液清洗層析柱后，用50mM～500mMNaCl的直線濃度梯度法(總?cè)艹隽繛?00ml)進(jìn)行了酶的溶出。合并具有瓊脂糖酶活性的溶出成分，用超濾膜PM-10(Amicon公司制造)進(jìn)行濃縮，再用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行緩沖液交換，得到5ml的酶溶液。將此酶溶液加入預(yù)先用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡化后的羥基磷灰石層析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性幾乎都在流出的部分中被檢測(cè)到。接著，用超濾膜PM-10對(duì)該活性部分進(jìn)行濃縮。再用50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)對(duì)得到的濃縮液進(jìn)行一夜透析，得到6.3ml的酶液。
以0.2％的精制瓊脂(Nacalai公司制造)為底物，在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行瓊脂糖酶活性的測(cè)定。以3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶反應(yīng)生成的還原糖。將每分鐘生成相當(dāng)于1μmol D-半乳糖的量的還原糖的酶活性表示為1個(gè)單位(U)。并且，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC蛋白檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad公司制造)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的定量。
如下表1所示，經(jīng)過(guò)了陰離子交換色譜及羥基磷灰石色譜后的活性成分的酶比活性(217U/mg蛋白)比培養(yǎng)物上清液的比活性上升了310倍，活性收率為53.8％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中只有一條條帶，由此斷定酶精制得很純凈。
表1

(3)精制瓊脂糖酶的性質(zhì)(1)對(duì)如上精制的瓊脂糖酶(下文稱為“RagaA7”)的下述性質(zhì)進(jìn)行研究。另外，除了特殊記述外，均以瓊脂作底物。
<作用>
用TLC(薄層色譜)分析了以通用性瓊脂糖(Agarose L 03TaKaRa公司制造)為底物時(shí)RagaA7的反應(yīng)生成物的經(jīng)時(shí)變化(圖4)。通過(guò)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明酶是催化瓊脂糖的β-1，4鍵分解為末端型的反應(yīng)的β-瓊脂糖酶。
<底物特異性>
調(diào)查了RagaA7的底物特異性后發(fā)現(xiàn)，其作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖，但是不分解具有與瓊脂糖相同的2糖重復(fù)單位且該糖的一部分被硫酸基取代了的多糖類，如ι、κ、λ-卡拉膠。
<pH穩(wěn)定性及作用最佳pH>
在pH3～pH9.5之間用50mM Britton-Robinson(BR)廣域緩沖液測(cè)定了RagaA7的作用最佳pH，其在中性的pH范圍內(nèi)具有活性，最佳pH為pH5～pH7.5(圖5)。并且，通過(guò)在pH3～pH12之間用Britton-Robinson廣域緩沖液測(cè)定了于40℃分別保溫30分鐘后的殘留活性，測(cè)定了RagaA7的pH穩(wěn)定性。其在pH4～pH10之間保持了最大活性的50％或50％以上(圖6)。
<分子量>
以SDS-PAGE測(cè)定的RagaA7的表觀分子量約為39kDa。該值小于AgaA7基因編碼的成熟蛋白質(zhì)的推定分子量47kDa。推測(cè)是RagaA7受到宿主枯草桿菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。測(cè)定了RagaA7的N末端氨基酸序列，該序列為Met-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Gly-Thr-Pro-Val，此序列相當(dāng)于RagaA7的第18～第27的氨基酸序列。
<溫度的影響>
為了調(diào)查RagaA7的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了以50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)在各種溫度下保溫之后的殘留活性，該酶在15℃～70℃中穩(wěn)定，作用最佳溫度為45℃～55℃(圖7)。而且，于54.8℃進(jìn)行30分鐘熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的43％，62.3℃時(shí)為42.6％，71.9℃時(shí)為37.9％，80.0℃時(shí)為37.9％。該酶的耐熱性比PSA高(圖8)。
<金屬鹽等的影響>
考慮到產(chǎn)生RagaA7的微生物是從海洋分離得到，因此海水中含有的各種離子的濃度可能會(huì)影響酶活性，于是調(diào)查了RagaA7對(duì)這些離子的活性特性。首先調(diào)查了NaCl對(duì)本發(fā)明酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RagaA7的瓊脂分解活性中并非必須有NaCl，也幾乎觀察不到依賴于NaCl濃度的活性變化。即使在添加有更高濃度的NaCl(1M)時(shí)也保持了80％的活性。
而且，也幾乎沒(méi)有觀察到由海水中主要金屬離子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的變化(100％～108％)。另外，還調(diào)查了被認(rèn)為是海水中含有的微量金屬離子對(duì)RagaA7活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RagaA7受濃度為1mM的Hg2+、Pb2+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制(0％～20％)，略微受濃度為1mM的Cu2+、Fe2+的抑制(56％～89％)。另外，不受Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制(101％～108％)。并且，由此可以認(rèn)為，RagaA7的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的結(jié)構(gòu)的維持是重要的。
另外還進(jìn)行了EDTA抑制酶活性的試驗(yàn)，通過(guò)在40℃處理1小時(shí)，該酶活性受到抑制，所述抑制與EDTA的濃度成比例，不過(guò)即使在100mM的EDTA中處理后仍保持60％的活性。由此可以認(rèn)為，并不是2價(jià)金屬離子與RagaA7的活性中心有關(guān)，而是部分2價(jià)金屬離子在維持其結(jié)構(gòu)上是必須的。
<等電點(diǎn)>
按照等電點(diǎn)電泳法，用Multiphore II凝膠電聚焦系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠盤及廣范圍等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)測(cè)定了RagaA7的等電點(diǎn)，結(jié)果為3.5～5.5。
<表面活性劑的影響>
按如下表A2所示的種類及濃度調(diào)查了表面活性劑對(duì)RagaA7的影響。分別向RagaA7中添加了0.1％及1％的非離子性表面活性劑NonidetP40(NacalaiTesque公司制造)和Triton X100(NacalaiTesque公司制造)以及陰離子性表面活性劑Tween 20(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)和SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaA7的殘留活性為不添加任何表面活性劑時(shí)的100％或其以上。
表2

<對(duì)SDS的穩(wěn)定性>
調(diào)查了RagaA7對(duì)SDS的穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn)，于40℃、1.5％的SDS中處理1小時(shí)后保持了與未處理時(shí)同樣的活性。并且，以0.5％的SDS進(jìn)行同樣處理后，活性上升至未添加SDS時(shí)的1.5倍。RagaA7對(duì)SDS的耐性比PSA高(圖9)。
<對(duì)化學(xué)試劑的耐性>
按如下表A3所示的種類及濃度調(diào)查了RagaA7對(duì)化學(xué)試劑的耐性。RagaA7受0.1mM N-溴代丁二酰亞胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(關(guān)東化學(xué)會(huì)社制造)及對(duì)(氯汞)苯甲酸(NacalaiTesque公司制造)、1mM N-乙基順丁烯二酰亞胺(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)、10mM二硫蘇糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巰基乙醇(NacalaiTesque公司制造)的抑制。
表3

*包含5％的二甲基亞砜實(shí)施例3(1)瓊脂糖酶基因的解析(2)用HindIII消化微球根菌屬sp.1325-A3菌株(下文省略為“1325-A3菌株”)的染色體DNA，得到DNA片段。用高純度PCR產(chǎn)品純化試劑盒(Roche公司制造)精制該DNA片段，得到精制DNA片段。用DNA連接試劑盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)將此精制DNA片段和預(yù)先用HindIII消化、并經(jīng)過(guò)蝦的堿性磷酸酶(Roche公司制造)處理的質(zhì)粒載體pUC18(TaKaRa公司制造)連接起來(lái)。用此連接混合液對(duì)E.coliHB101(F’supE44 hsdS20 recA13 ara-14proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5mtl-1 leuB6 thi-1)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以此制作轉(zhuǎn)化體。
將如上制作的轉(zhuǎn)化體接種至瓊脂培養(yǎng)基，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上形成有凹陷的菌落作為具有瓊脂分解活性的克隆體。將挑選出的具有瓊脂分解活性的克隆體在LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化鈉、7.5μg/ml的四環(huán)素或50μg/ml的氨芐青霉素)上劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)一夜。之后，用碘溶液染色培養(yǎng)基，將在菌體的周圍形成了被認(rèn)為是生成了源自瓊脂的還原糖的透明光環(huán)的菌落視為目的克隆體。將如此得到的克隆體培養(yǎng)在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，再?gòu)呐囵B(yǎng)得到的細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pUA3。
用與pUC18的多克隆位點(diǎn)的上游及下游序列相對(duì)應(yīng)的如下引物，對(duì)所得重組質(zhì)粒pUA3的插入片段的核苷酸序列進(jìn)行解析。
引物35’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’引物45’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’此重組質(zhì)粒pUA3的插入片段的大小約為3.9kb。測(cè)定pUA3的插入片段的堿基序列，比較此基因片段編碼的氨基酸序列和已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果顯示，此基因片段編碼的氨基酸序列中的一部分與源自其他微生物的瓊脂糖酶具有同源性，因此此基因片段編碼瓊脂糖酶的一部分。但是認(rèn)為，被推測(cè)編碼了部分瓊脂糖酶的堿基序列中不包含終止密碼子，瓊脂糖酶的C末端部分缺失。于是通過(guò)反向PCR法及盒式連接PCR(cassette ligation PCR)測(cè)定了此片段下游區(qū)域的堿基序列。序列號(hào)7顯示了pUA3的插入片段及其下游區(qū)域的堿基序列。在其中檢測(cè)出由1809bp組成的的開放閱讀框(ORF)。此開放閱讀框編碼由602個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。并且在開始密碼子的6bp上游存在有被推斷為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在136bp上游存在有被推斷為大腸桿菌的σ70型的啟動(dòng)子序列5’-TTGTTA-3’(-35區(qū)域)和5’-TATTAT-3’(-10序列)(經(jīng)GENETYX-MAC 10.1啟動(dòng)子檢索，啟動(dòng)子值為50.9)。在終止位點(diǎn)的15bp下游處存在有反向重復(fù)序列，推測(cè)其起到轉(zhuǎn)錄終止子的作用。
并且，對(duì)所述ORF(下文稱為“AgaA3”)編碼的氨基酸序列進(jìn)行了FASTA同源性檢索(http//ddbj.nig.ac.jp)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部氨基酸(602個(gè)氨基酸)與源自大西洋假交替單胞菌、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)B9菌株、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2種)、假單胞菌屬ND137菌株、天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)菌株、微顫菌屬PRE1菌株的β-瓊脂糖酶分別有55.3％、54.3％、49.8％、36.8％、45.8％、34.6％、33.0％的部分具有一致性。
(2)瓊脂糖酶的表達(dá)及精制(2)將編碼AgaA3的DNA片段導(dǎo)入表達(dá)用載體pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，將得到的重組質(zhì)粒命名為pA3AG。用pA3AG轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。將得到的轉(zhuǎn)化體于LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)一夜后，通過(guò)瓊脂上的凹陷來(lái)確認(rèn)在大腸桿菌HB101中重組體的瓊脂糖酶活性。
另外，還以革蘭氏陽(yáng)性菌中的枯草桿菌ISW1214(leuA8 metB5 hsrM1)為宿主對(duì)重組瓊脂糖酶進(jìn)行了高表達(dá)。用pA3AG轉(zhuǎn)化枯草桿菌ISW1214，用CSL培養(yǎng)基(10％谷物浸提液、0.5％魚肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氫鉀、0.02％七水硫酸鎂、0.05％氯化鈣、6％麥芽糖、15μg/ml四環(huán)素、pH6.8)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體72小時(shí)，得到82.5ml的培養(yǎng)物上清液。
于4℃或以下進(jìn)行所述培養(yǎng)物上清液的精制。首先，以6500×g的轉(zhuǎn)速離心培養(yǎng)物上清液10分鐘，分離菌體和培養(yǎng)物上清液。向得到的培養(yǎng)物上清液中緩緩添加硫酸銨，使其達(dá)到90％的飽和。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心25分鐘回收生成的鹽析物，再用少量20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)重懸沉淀物，用前述的緩沖液進(jìn)行一夜透析。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘除去不溶殘?jiān)?，將其吸附在預(yù)先用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M層析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述緩沖液清洗層析柱后，用50mM～500mMNaCl的直線濃度梯度法(總?cè)艹隽繛?00ml)進(jìn)行了酶的溶出?；旌暇哂协傊敲富钚缘娜艹龀煞郑贸瑸V膜PM-10(Amicon公司制造)進(jìn)行濃縮，再用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行緩沖液交換，得到5ml的酶溶液。將此酶溶液加入預(yù)先用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石層析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性幾乎都在流出的部分中被檢測(cè)到。接著，用超濾膜PM-10對(duì)該活性部分進(jìn)行濃縮。再用50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)對(duì)得到的濃縮液進(jìn)行一夜透析，得到2.0ml的酵母液。
以0.2％的精制瓊脂(Nacalai公司制造)為底物，在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行瓊脂糖酶活性的測(cè)定。以3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶反應(yīng)生成的還原糖。將每分鐘生成相當(dāng)于1μmol D-半乳糖的量的還原糖的酶活性表示為1個(gè)單位(U)。并且，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC蛋白檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad公司制造)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的定量。
如下表4所示，經(jīng)過(guò)了陰離子交換層析及羥基磷灰石層析后的活性成分的酶比活性(364U/mg蛋白)比培養(yǎng)物上清液的比活性上升了530倍，活性收率為64.9％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中具有非常接近的分子量，包含3個(gè)具有瓊脂糖酶活性的蛋白質(zhì)。
表4

(3)精制瓊脂糖酶的性質(zhì)(2)對(duì)如上精制的瓊脂糖酶(下文稱為“RagaA3”)的下述性質(zhì)進(jìn)行研究。另外，除了特殊記述外，均以瓊脂作底物。
<作用>
用TLC分析了以通用性瓊脂糖(Agarose L 03TaKaRa公司制造)為底物時(shí)RagaA3的反應(yīng)生成物的經(jīng)時(shí)變化(圖10)。通過(guò)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明酶是催化瓊脂糖的β-1，4鍵分解為末端型的反應(yīng)的β-瓊脂糖酶。
<底物特異性>
調(diào)查了RagaA3的底物特異性后發(fā)現(xiàn)，其作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖，但不分解具有與瓊脂糖相同的2糖重復(fù)單位且該糖的一部分被硫酸基取代了的多糖類，如ι、κ、λ-卡拉膠。
<pH穩(wěn)定性及作用最佳pH>
在pH3～pH9.5之間用50mM Britton-Robinson廣域緩沖液測(cè)定了RagaA3的作用最佳pH，其在中性的pH范圍內(nèi)具有活性，最佳pH為pH6.5～pH7.5(圖11)。并且，通過(guò)在pH3～pH12之間用Britton-Robinson廣域緩沖液測(cè)定了于40℃分別保溫30分鐘后的殘留活性，測(cè)定了RagaA3的pH穩(wěn)定性。其在pH4～pH10.5之間保持了最大活性的50％或以上(圖12)。
<分子量>
以SDS-PAGE測(cè)定的RagaA3的表觀分子量約為34kDa。該值小于AgaA3基因編碼的成熟蛋白質(zhì)的推定分子量47kDa。推測(cè)是RagaA3受到宿主枯草桿菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。測(cè)定了RagaA3的N末端氨基酸序列，該序列為Ala-Leu-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Asn-Ile-Pro，此序列相當(dāng)于RagaA3的第17～第26的氨基酸序列。
<溫度的影響>
為了調(diào)查RagaA3的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了以50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)在各種溫度下保溫之后的殘留活性，該酶在50℃以下穩(wěn)定，作用最佳溫度為50℃～60℃(圖13)。而且，于50℃進(jìn)行30分鐘熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的96.3％，64℃時(shí)為52.3％，74℃時(shí)為39.5％，83℃時(shí)為32.6％。該酶的耐熱性比PSA高(圖14)。
<金屬鹽等的影響>
考慮到產(chǎn)生RagaA3的微生物是從海洋分離得到，因此海水中含有的各種離子的濃度可能會(huì)影響酶活性，于是調(diào)查了RagaA3對(duì)這些離子的活性特性。首先調(diào)查了NaCl對(duì)本發(fā)明酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RagaA3的瓊脂分解活性中并非必須有NaCl，也幾乎觀察不到依賴于NaCl濃度的活性變化。即使在添加有更高濃度的NaCl(1M)時(shí)也保持了90％的活性。
而且，也幾乎沒(méi)有觀察到由海水中主要金屬離子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的變化(107％～121％)。然后又調(diào)查了被認(rèn)為是海水中含有的微量金屬離子對(duì)RagaA3活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RagaA3受濃度為1mM的Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制(殘留活性0％～13％)，略受Fe2+的抑制(53％)。另外，不受Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制(101％～111％)。并且，由此可以認(rèn)為，RagaA3的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的結(jié)構(gòu)的維持是重要的。
另外還進(jìn)行了EDTA抑制酶活性的試驗(yàn)，通過(guò)在40℃處理1小時(shí)，該酶活性受到抑制，所述抑制與EDTA的濃度成比例，不過(guò)即使在100mM的EDTA中處理后仍保持80％的活性。由此可以認(rèn)為，并不是2價(jià)金屬離子與RagaA3的活性中心有關(guān)，而是部分2價(jià)金屬離子在維持其結(jié)構(gòu)上是必須的。
<等電點(diǎn)>
按照等電點(diǎn)電泳法，用Multiphore II凝膠電聚焦系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠盤及廣范圍等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)測(cè)定了RagaA3的等電點(diǎn)，結(jié)果為3.5～4.5。
<表面活性劑的影響>
按如下表5所示的種類及濃度調(diào)查了表面活性劑對(duì)RagaA7的影響。分別向RagaA3中添加了0.1％及1％的非離子性表面活性劑NonidetP40(NacalaiTesque公司制造)和Triton X100(NacalaiTesque公司制造)以及陰離子性表面活性劑Tween 20(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)和0.1％的SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaA7的殘留活性為不添加任何表面活性劑時(shí)的100％以上。不過(guò)，添加了1％的SDS時(shí)的殘留活性約為不添加任何表面活性劑時(shí)的50％。
表5

<對(duì)SDS的穩(wěn)定性>
調(diào)查了RagaA3對(duì)SDS的穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn)，于40℃、至少1％的SDS中處理1小時(shí)后保持了未處理時(shí)48％的活性。RagaA3對(duì)SDS的耐性比PSA高(圖15)。
<對(duì)化學(xué)試劑的耐性>
按如下表6所示的種類及濃度調(diào)查了RagaA3對(duì)化學(xué)試劑的耐性。RagaA3受0.1mM N-溴代丁二酰亞胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(關(guān)東化學(xué)會(huì)社制造)及對(duì)(氯汞)苯甲酸(Nacalai Tesque公司制造)、1mM N-乙基順丁烯二酰亞胺(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)、10mM二硫蘇糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巰基乙醇(Nacalai Tesque公司制造)的抑制。
表6

*包含5％的二甲基亞砜實(shí)施例4(1)瓊脂糖酶基因的解析(3)用PstI消化微球根菌屬sp.A94菌株(下文省略為“A94菌株”)的染色體DNA，得到DNA片段。用高純度PCR產(chǎn)品純化試劑盒(Roche公司制造)精制該DNA片段，得到精制DNA片段。用DNA連接試劑盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)將此精制DNA片段和預(yù)先用PstI消化、并經(jīng)過(guò)蝦的堿性磷酸酶(Roche公司制造)處理的過(guò)的質(zhì)粒載體pUC18(TaKaRa公司制造)連接起來(lái)。用此連接混合液對(duì)E.coli HB101(F’supE44 hsdS20recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 leuB6 thi-1)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以此制作轉(zhuǎn)化體。
將如上制作的轉(zhuǎn)化體接種至瓊脂培養(yǎng)基，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上形成有凹陷的菌落作為具有瓊脂分解活性的克隆體。將挑選出的具有瓊脂分解活性的克隆體在LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化鈉、7.5μg/ml的四環(huán)素或50μg/ml的氨芐青霉素)上劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)一夜。之后，用碘溶液染色培養(yǎng)基，將在菌體的周圍形成了被認(rèn)為是生成了源自瓊脂的還原糖的透明光環(huán)的菌落視為目的克隆體。將如此得到的克隆體培養(yǎng)在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，再?gòu)呐囵B(yǎng)得到的細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pUB。
用與pUC18的多克隆位點(diǎn)的上游及下游序列相對(duì)應(yīng)的如下引物，對(duì)所得重組質(zhì)粒pUB的插入片段的核苷酸序列進(jìn)行解析。
引物55’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’
引物65’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’確定此重組質(zhì)粒pUB的插入片段的核苷酸序列后(序列號(hào)11)，發(fā)現(xiàn)插入片段的大小為3910bp，G+C含量為51％，其中有1302bp的開放閱讀框(ORF)。此開放閱讀框編碼由433個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。并且在ATG(起始密碼子)的9bp上游存在有被推斷為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在起始密碼子42bp上游存在有與大腸桿菌的啟動(dòng)子保守序列5’-TTGACA-3’(-35區(qū)域)和5’-TATAAT-3’(-10區(qū)域)具有同源性的序列區(qū)域5’-TTGTAG-3’(-35序列)和5’-TATGGT-3’(-10區(qū)域)(經(jīng)GENETYX-MAC 10.1啟動(dòng)子檢索，啟動(dòng)子值為56.2)。在終止密碼子的48bp下游處存在有反向重復(fù)序列，推測(cè)其起到轉(zhuǎn)錄終止子的作用。
并且，對(duì)所述ORF(下文稱為“AgaB”)編碼的氨基酸序列進(jìn)行了FASTA同源性檢索(http//ddbj.nig.ac.jp)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部氨基酸(433個(gè)氨基酸)與源自假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)ND137菌株、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)B9菌株、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2種)、微顫菌屬(Microscillasp.)PRE1菌株、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的β-瓊脂糖酶分別有61.8％、54.3％、52.1％、55.0％、44.6％、36.5％、37.5％的部分具有一致性。
(2)瓊脂糖酶的表達(dá)及精制(3)將編碼AgaB的DNA片段導(dǎo)入表達(dá)用載體pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，將得到的重組質(zhì)粒命名為pBAG1。用pBAG1轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。將得到的轉(zhuǎn)化體于LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)一夜后，通過(guò)瓊脂上的凹陷來(lái)確認(rèn)在大腸桿菌HB101中重組體的瓊脂糖酶活性。
另外，還以革蘭氏陽(yáng)性菌中的枯草桿菌ISW1214(leuA8 metB5 hsrM1)為宿主對(duì)重組瓊脂糖酶進(jìn)行了高表達(dá)。用pBAG1轉(zhuǎn)化枯草桿菌ISW1214，用CSL培養(yǎng)基(10％谷物浸提液、0.5％魚肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氫鉀、0.02％七水硫酸鎂、0.05％氯化鈣、6％麥芽糖、15μg/ml四環(huán)素、pH6.8)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體72小時(shí)，得到669ml的培養(yǎng)物上清液。
于4℃或以下進(jìn)行所述培養(yǎng)物上清液的精制。首先，以6500×g的轉(zhuǎn)速離心培養(yǎng)物上清液10分鐘，分離菌體和培養(yǎng)物上清液。向得到的培養(yǎng)物上清液中緩緩添加硫酸銨，使其達(dá)到80％的飽和。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心25分鐘回收生成的鹽析物，再用少量20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)重懸沉淀物，用前述的緩沖液進(jìn)行一夜透析。以8000×g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘除去不溶殘?jiān)?，將其吸附在預(yù)先用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M層析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述緩沖液清洗層析柱后，用50mM～500mMNaCl的直線濃度梯度法(總?cè)艹隽繛?00ml)進(jìn)行了酶的溶出。混合具有瓊脂糖酶活性的溶出成分，用超濾膜PM-10(Amicon公司制造)進(jìn)行濃縮，再用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行緩沖液交換，得到5ml的酶溶液。將此酶溶液加入預(yù)先用2.5mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石層析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性幾乎都在流出的部分中被檢測(cè)到。接著，用超濾膜PM-10對(duì)該活性部分進(jìn)行濃縮。再用50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)對(duì)得到的濃縮液進(jìn)行一夜透析，得到0.6ml的酵母液。
以0.2％的精制瓊脂(Nacalai公司制造)為底物，在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行瓊脂糖酶活性的測(cè)定。以3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶反應(yīng)生成的還原糖。將每分鐘生成相當(dāng)于1μmol D-半乳糖的量的還原糖的酶活性表示為1個(gè)單位(U)。并且，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC蛋白檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad公司制造)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的定量。
如下表7所示，經(jīng)過(guò)了陰離子交換層析及羥基磷灰石層析后的活性成分的酶比活性(459U/mg蛋白)比培養(yǎng)物上清液的比活性上升了219倍，活性收率為9.0％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中只有一條條帶，由此斷定酶精制得很純凈。
表7

(3)精制瓊脂糖酶的性質(zhì)(3)對(duì)如上精制的瓊脂糖酶(下文稱為“RagaB”)的下述性質(zhì)進(jìn)行研究。另外，除了特殊記述外，均以瓊脂作底物。
<作用>
用TLC分析了以通用性瓊脂糖(Agarose L 03TaKaRa公司制造)為底物時(shí)RagaB的反應(yīng)生成物的經(jīng)時(shí)變化(圖16)。通過(guò)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明酶是催化瓊脂糖的β-1，4鍵分解為末端型的反應(yīng)的β-瓊脂糖酶。
<底物特異性>
調(diào)查了RagaB的底物特異性后發(fā)現(xiàn)，其作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖，但不分解具有與瓊脂糖相同的2糖重復(fù)單位且該糖的一部分被硫酸基取代了的多糖類，如ι、κ、λ-卡拉膠。
<pH穩(wěn)定性及作用最佳pH>
在pH3～pH11之間用50mM Britton-Robinson廣域緩沖液測(cè)定了RagaB的作用最佳pH，其在中性的pH范圍內(nèi)具有活性，最佳pH為pH6.5～pH7.5(圖17)。并且，通過(guò)在pH3～pH12之間用Britton-Robinson廣域緩沖液測(cè)定了于40℃分別保溫30分鐘后的殘留活性，測(cè)定了RagaB的pH穩(wěn)定性。其在pH4～pH10之間保持了最大活性的50％以上(圖18)。
<分子量>
以SDS-PAGE測(cè)定的RagaA7的表觀分子量為32kDa。該值小于以AgaB基因編碼的成熟蛋白質(zhì)的推定分子量47kDa。推測(cè)是RagaB受到宿主枯草桿菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。測(cè)定了RagaB的N末端氨基酸序列，該序列為Tyr-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Gly-Val-Pro-Val，此序列相當(dāng)于RagaB的第19～第28的氨基酸序列。
<溫度的影響>
為了調(diào)查RagaB的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了以50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)在各種溫度下保溫之后的殘留活性，該酶在50℃或其以下穩(wěn)定，作用最佳溫度為50℃～60℃(圖19)。而且，于50℃進(jìn)行30分鐘熱處理后的殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的88.0％，64℃時(shí)為17.6％，74℃時(shí)為15.1％，83℃時(shí)為11.3％。該酶的耐熱性比PSA高(圖20)。
<金屬鹽等的影響>
考慮到產(chǎn)生RagaB的微生物是從海洋分離得到，因此海水中含有的各種離子的濃度可能會(huì)影響酶活性，于是調(diào)查了RagaB對(duì)這些離子的活性特性。首先調(diào)查了NaCl對(duì)本發(fā)明酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RagaA7的瓊脂分解活性中并非必須有NaCl，也觀察不到依賴于NaCl濃度的活性變化。即使在添加有更高濃度的NaCl(1M)時(shí)也保持了90％的活性。
而且，也幾乎沒(méi)有觀察到由海水中主要金屬離子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的變化(96％～114％)。還調(diào)查了被認(rèn)為是海水中含有的微量金屬離子對(duì)RagaB活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RagaB受濃度為1mM的Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的強(qiáng)烈抑制(0％～35％)。另外，不受Al3+、Co2+、Cs+、Fe2+、Fe3+、Li+、Mn2+、Ni2+的抑制(101％～108％)。并且，由此可以認(rèn)為，RagaB的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的結(jié)構(gòu)的維持是重要的。
另外還進(jìn)行了EDTA抑制酶活性的試驗(yàn)，通過(guò)在40℃處理1小時(shí)，該酶活性受到抑制，所述抑制與EDTA的濃度成比例，不過(guò)即使在100mM的EDTA中處理后仍保持74％的活性。由此可以認(rèn)為，并不是2價(jià)金屬離子與RagaB的活性中心有關(guān)，而是部分2價(jià)金屬離子在維持其結(jié)構(gòu)上是必須的。
<等電點(diǎn)>
按照等電點(diǎn)電泳法，用Multiphore II凝膠電聚焦系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠盤及廣范圍等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)測(cè)定了RagaB的等電點(diǎn)，結(jié)果為3.7～5.2。
<表面活性劑的影響>
按如下表8所示的種類及濃度調(diào)查了表面活性劑對(duì)RagaB的影響。分別向RagaB中添加了0.1％及1％的非離子性表面活性劑NonidetP40(NacalaiTesque公司制造)和Triton X100(NacalaiTesque公司制造)以及陰離子性表面活性劑Tween 20(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)和SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaB的殘留活性為不添加任何表面活性劑時(shí)的100％或其以上。
表8

<對(duì)SDS的穩(wěn)定性>
調(diào)查了RagaB對(duì)SDS的穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn)，于40℃、2.0％的SDS中處理1小時(shí)后保持了與未處理時(shí)同樣的活性。并且，以0.4％的SDS進(jìn)行同樣處理后，活性上升至未添加SDS時(shí)的2.0倍。RagaB對(duì)SDS的耐性比PSA高(圖21)。
<對(duì)化學(xué)試劑的耐性>
按如下表9所示的種類及濃度調(diào)查了RagaB對(duì)化學(xué)試劑的耐性。RagaB受0.1mM N-溴代丁二酰亞胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(關(guān)東化學(xué)會(huì)社制造)及對(duì)(氯汞)苯甲酸(NacalaiTesque公司制造)、1mM N-乙基順丁烯二酰亞胺(和光純藥工業(yè)會(huì)社制造)、10mM二硫蘇糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巰基乙醇(NacalaiTesque公司制造)的抑制。
表9

*包含5％的雙甲基亞砜工業(yè)上的可利用性由本發(fā)明提供具有耐熱性的新型瓊脂分解酶及編碼所述瓊脂分解酶的核苷酸序列。
應(yīng)用此酶可以提供在工業(yè)中大量生產(chǎn)源自瓊脂的寡聚糖的生產(chǎn)方法，該寡聚糖在醫(yī)藥品、化妝品、食品領(lǐng)域中有用。
并且，通過(guò)將此酶作用于海藻，可以用于從海藻中提取具有生理活性等的有用物質(zhì)、并可用于開發(fā)藻類的有用品種。
并且，通過(guò)基因工程技術(shù)利用所述核苷酸序列，能夠簡(jiǎn)單、高效地生產(chǎn)制造本發(fā)明的瓊脂分解酶。
序列表<110>獨(dú)立行政法人海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)<120>瓊脂分解酶及其應(yīng)用<130>FCI05JP2002<150>JP2003-98284<151>2003-04-01<150>JP2003-98285<151>2003-04-01<150>JP2003-98286<151>2003-04-01<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>441<212>PRT<213>瓊脂分解酶(RagaA7)<220>
<223>發(fā)明人大田優(yōu)佳莉；秦田勇二；能木裕一；伊藤進(jìn)；掘越弘毅<400>1Met Lys Thr Thr Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Phe Ser Thr Pro1 5 10 15Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly20 25 30Pro Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr
35 40 45Ser Ala Pro Ala Ser Gly Lys Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser50 55 60Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr65 70 75 80Gly Pro Asn Ser Ser Val Glu Ser Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser85 90 95Arg Lys Ala Gly Thr Thr LysIle His Ala Gly Ala Ile His Ser Asn100105 110Glu Ser Val Thr Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Val Gln Val Thr115 120 125Asn Leu Thr Met Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr130 135 140Gln Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu145 150 155 160Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg165 170 175Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Pro180 185 190Asn Pro Asn Gly Gly Thr Trp Arg Asp Gln Trp Ile Arg Ile Gly Thr195 200 205
Tyr Trp Val Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His210 215 220Val Arg Thr Val Thr Gly Pro Ser Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr225 230 235 240Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu245 250 255His Gln Pro Trp Arg Asp Thr Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu260 265 270Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg275 280 285Phe Tyr Lys Pro Val Pro Asp Thr Asn Gly Gly Gly Pro Gly Asn Gly290 295 300Ser Ile Ser Val Glu Lys Glu Ala Glu Asp Phe Asp Asn Val Gly Gly305 310 315 320Tyr Phe Ser Asp Gly Gln Ser Gln Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Gly325 330 335Ala Thr Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Arg Glu Asp Tyr Ala Asp Tyr340 345 350Thr Val Thr Val Pro Glu Asp Arg Ile Tyr Asn Ile Thr Tyr Asn Ile355 360 365Ser Ser Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ile Asp Phe Leu Val Asn Glu Ser
370 375 380Gly Thr Trp Ser Asn Lys Thr Gln Thr Ala Val Pro Asn Ala Gly Trp385 390 395 400Asn Asn Phe Gln Pro Leu Ser Gly Gly Thr Val Tyr Leu Glu Ala Gly405 410 415Thr His Thr Val Arg Leu Tyr Gly Ala Gly Thr His Asp Trp Gln Trp420 425 430Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu Ser Asn435 440<210>2<211>1326<212>DNA<213>瓊脂分解酶(RagaA7)<400>2atgaaaacca ctcagtgcgc cctggcggcg ctcgtgttta gtacccccct gatggccgcc 60gactgggacg gcactccggt tccagccgat gcgggccccg gcaacacctg ggagctacac 120ccgctctctg atgacttcaa ctactcggca ccagcttccg gtaagagcgc cacattcttc 180gagcgctgga gcgaaggctt tatcaacccc tggctaggcc cgggcgaaac cgagtactac 240ggcccaaact cctcggtaga aagcggtaac ctggtcatta aagccagccg caaggccgga 300accaccaaga ttcatgccgg cgctatccac tccaatgaaa gcgtcaccta ccccctgtat 360atggaagcgc gcgttcaggt caccaacctc accatggcca acgccttctg gttgctgagc 420tctgattcca cccaggaaat cgacgtactg gaatcctacg gcagtgaccg tcccagcgag 480acctggttcg atgagcgcct gcacctcagc catcacgtgt ttatccgcga gccgttccag 540
gactaccagc ccaaagatga cggcagctgg tacccaaacc ccaatggcgg cacctggcgc 600gatcaatgga ttcgaatcgg cacctactgg gtagatccct ggacactgga gtactacgtc 660aacggcgagc acgtacgcac tgtcaccggc ccgagtatga tcgaccccta cggctataca 720ggcggcacgg gcctcagcaa accgatgcag gtaatcttcg acgcagaaca ccaaccctgg 780cgcgatacgc agggcacagc gccgccgaca gatgaagaac tggccgatcc gagccgaaac 840aaattcctgg ttgactgggt tcgcttttat aaacccgtgc ctgataccaa tggcggtggc 900cccggcaatg ggagcatcag tgtcgagaaa gaggcggaag atttcgataa cgttggaggc 960tatttttcag acggccaatc gcaagccatt agcacctaca caacgggagc tacgacagcg 1020atcaattacg tgaatcgcga agactatgca gactataccg tcaccgtgcc tgaagatcgc 1080atctacaaca ttacctataa catcagtagc ggtattaccg gtggacgtat tgacttcctt 1140gtcaatgaaa gtggaacctg gagcaacaag acacagacag cggtacctaa tgccggctgg 1200aacaatttcc aaccattaag cggaggtacg gtttatctcg aagccggtac acatactgtg 1260agactttacg gggcaggtac acacgactgg cagtggaatc tcgacaaatt tacgttgagc 1320aactga 1326<210>3<211>2747<212>DNA<213>Microbulbifer sp.1325-A7<220>
<221>-35_信號(hào)<222>(782)..(787)<223>
<220>
<221>-10_信號(hào)
<222>(805)..(810)<223>
<220>
<221>RBS<222>(861)..(866)<223>
<220>
<221>信號(hào)肽<222>(874)..(930)<223>
<220>
<221>CDS<222>(874)..(2196)<223>
<400>3aagcttgcga ctggagaagg ccagacggat attgccccag ctcaccgccg cggaacgttc60accgacattt accgaagact tctgatcccg ctcttggctc gccgcagcgc caatgtcact 120ctcgggctca cgatacagcc agtaccagat cgccgcccag acgatgccga tcaccccaga 180gataataaac agcccgcgcc agccaaaaca ctcctgaatc aaagccagta ccggcatcaa 240aaatgcgaga ccgataaact gcccggaggt atacaccgca atcgcactgg cccgctcctg 300ctgagaaaac cattgggtaa cgatcttatt attcgcgggg taggacggcg cctcgaaaaa 360accgatcgcc atgcggcatc ccaccagcgc cgccagtgaa ctgaccagac cctgtacgat 420ggtcgccagc gaccaggcca ccagaatgaa gggatacagg atccgcacct tcaccacatc 480cacaatcatc ccaccgggaa tctgcatgat ggaataggtc caggcgaagg cagagaagat 540aatccccatc tgtacggatg tgaggctcag atcctcagaa atcgcattgg ccgccaccga 600gatattggtg cggtccatat agttgatcac cacactgata aagatcagtg ccagaacccc 660gaatttattg gctgctttca taccgctact gcatcgtcgt tgttatgtgg tcgcgacgcg 720
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Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr Gln Glu Ile Asp Val Leu Glu140 145 150tcc tac ggc agt gac cgt ccc agc gag acc tgg ttc gat gag cgc ctg 1374Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu155 160 165cac ctc agc cat cac gtg ttt atc cgc gag ccg ttc cag gac tac cag 1422His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln170 175 180ccc aaa gat gac ggc agc tgg tac cca aac ccc aat ggc ggc acc tgg 1470Pro Lys Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Pro Asn Pro Asn Gly Gly Thr Trp185 190 195cgc gat caa tgg att cga atc ggc acc tac tgg gta gat ccc tgg aca 1518Arg Asp Gln Trp Ile Arg Ile Gly Thr Tyr Trp Val Asp Pro Trp Thr200 205 210 215ctg gag tac tac gtc aac ggc gag cac gta cgc act gtc acc ggc ccg 1566Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His Val Arg Thr Val Thr Gly Pro220 225 230agt atg atc gac ccc tac ggc tat aca ggc ggc acg ggc ctc agc aaa 1614Ser Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys235 240 245ccg atg cag gta atc ttc gac gca gaa cac caa ccc tgg cgc gat acg 1662Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu His Gln Pro Trp Arg Asp Thr250 255 260cag ggc aca gcg ccg ccg aca gat gaa gaa ctg gcc gat ccg agc cga 1710Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg265 270 275aac aaa ttc ctg gtt gac tgg gtt cgc ttt tat aaa ccc gtg cct gat 1758Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr Lys Pro Val Pro Asp280 285 290 295acc aat ggc ggt ggc ccc ggc aat ggg agc atc agt gtc gag aaa gag 1806Thr Asn Gly Gly Gly Pro Gly Asn Gly Ser Ile Ser Val Glu Lys Glu300 305 310
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Phe Tyr Lys Pro Val Ala Asp Asn Asn Gly Gly Gly Asp Pro Asp Asn290 295 300Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly Asn Pro Gly Ser Gly Glu Thr Ile305 310 315 320Arg Val Glu Met Gly Ser Phe Ser Ala Thr Gly Lys Ala Gly Ala Ala325 330 335Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Gly Phe Asn Ser Asn Gly Asp Asn Ile340 345 350Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Gly Asp Tyr Thr Val Asn Phe Pro355 360 365Glu Ala Gly Asn Tyr Asn Val Glu Leu Leu Ala Ala Ser Pro Thr Thr370 375 380Ser Gly Ile Ala Ala Asp Val Gln Val Asp Gly Ser Tyr Val Gly Thr385 390 395 400Ile Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Trp Glu Leu Tyr Asn Thr Phe Thr405 410 415Leu Pro Ser Thr Ile Tyr Ile Ala Ser Ala Gly Asn His Thr Ile Arg420 425 430Val Gln Ser Ala Gly Gly Ser Ala Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile435 440 445
Arg Phe Thr Lys Thr Glu Asp Asp Asn Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala450 455 460Thr Gly Ala Thr Ile Asn Val Glu Ala Glu Ser Phe Ala Ser Val Gly465 470 475 480Gly Thr Tyr Ala Asp Gly Gln Ala Gln ProIle Ser Val Tyr Thr Thr485 490 495Asn Gly Ser Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Ala Gly Asp Phe Ala Asp500 505 510Tyr Thr Ile Asn Val Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Ala Ile Thr Tyr His515 520 525Val Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Ile Glu Phe Leu Val Asn Glu530 535 540Gly Gly Ser Trp Asn Ser Lys Thr Ala Thr Pro Val Pro Asn Gln Gly545 550 555 560Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asp Gly Gly Ser Val Tyr Leu Glu Ala565 570 575Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly Val Gly Ser Asn Asp Trp Gln580 585 590Trp Asn Leu Asp Lys Phe Val Leu Ser Asn595 600<210>6<211>1809
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325 330 335Lys Gly Asp Trp Ala Asp Tyr Thr Val Asn Leu Pro Ala Ala Gly Glu340 345 350Tyr Arg Val Asp Leu Val Ile Ala Ser Pro Met Ser Ser Gly Leu Gly355 360 365Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly Asn Ala Ala Lys Thr Val Thr Leu Ser370 375 380Asn Thr Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Gln Thr Phe Thr Leu Pro Gln Thr385 390 395 400Ile Ser Val Ser Ser Pro Gly Asn Tyr Asn Phe Arg Leu Lys Ser Thr405 410 415Gly Ser Ser Asn Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile Arg Phe Val Lys420 425 430Leu
權(quán)利要求
1.具有如下性質(zhì)的瓊脂分解酶；(1)作用水解瓊脂糖的β-1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖；(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖相互形成的β-1，4鍵和α-1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖；(3)溫度的影響于大于或等于54℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后活性仍有殘留。
2.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，來(lái)源于微球根菌屬的微生物。
3.如權(quán)利要求2所述的瓊脂分解酶，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8320的微球根菌屬sp.1325-A7，所述瓊脂分解酶于大于或等于54℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后，殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的25％或其以上。
4.如權(quán)利要求2所述的瓊脂分解酶，其中，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8319的微球根菌屬sp.1325-A3，所述瓊脂分解酶于大于或等于60℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后，殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的20％或其以上。
5.如權(quán)利要求2所述的瓊脂分解酶，其中，微球根菌屬微生物是保藏號(hào)為FERM BP-8321的微球根菌屬sp.A94，所述瓊脂分解酶于大于或等于60℃的溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后，殘留活性為未經(jīng)熱處理(0℃，30分鐘)時(shí)的7％或其以上。
6.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其具有下述氨基酸序列序列號(hào)1所表示的氨基酸序列、或序列號(hào)1所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入而形成的序列。
7.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其所具有的氨基酸序列與序列號(hào)1所表示的氨基酸序列有大于或等于56％的同源性。
8.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其具有下述氨基酸序列序列號(hào)5所表示的氨基酸序列、或序列號(hào)5所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入而形成的序列。
9.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其所具有的氨基酸序列與序列號(hào)5所表示的氨基酸序列有大于或等于56％的同源性。
10.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其具有下述氨基酸序列序列號(hào)9所表示的氨基酸序列、或序列號(hào)9所表示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入而形成的序列。
11.如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶，其所具有的氨基酸序列與序列號(hào)9所表示的氨基酸序列有大于或等于63％的同源性。
12.多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶的氨基酸序列，所述多核苷酸選自下述(a1)～(d1)組成的組(a1)編碼具有如序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b1)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)1所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；(c1)具有如序列表的序列號(hào)2所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d1)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)2所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
13.多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶的氨基酸序列，所述多核苷酸選自下述(a2)～(d2)組成的組(a2)編碼具有如序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b2)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；(c2)具有如序列表的序列號(hào)6所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d2)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)6所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
14.多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1所述的瓊脂分解酶的氨基酸序列，所述多核苷酸選自下述(a3)～(d3)組成的組(a3)編碼具有如序列表的序列號(hào)5所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b3)編碼具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)9所示的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、增加或插入的氨基酸序列；(c3)具有如序列表的序列號(hào)10所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d3)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列為序列表的序列號(hào)10所示的核苷酸序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換、增加或插入的核苷酸序列。
15.重組載體，其具有權(quán)利要求12至14的任意一項(xiàng)所述的多核苷酸的。
16.微生物，其以權(quán)利要求15所述的重組載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
17.瓊脂分解酶的制造方法，其特征在于，對(duì)權(quán)利要求16所述的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中提取瓊脂分解酶。
18.新瓊脂寡聚糖的制造方法，其特征在于，將權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所述的瓊脂分解酶作用于藻類，從而得到新瓊脂寡聚糖。
19.藻類原生質(zhì)體的制造方法，其特征在于，將權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所述的瓊脂分解酶作用于藻類，從而得到原生質(zhì)體。
20.回收瓊脂糖凝膠中DNA的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所述的瓊脂分解酶作用于施用了DNA的瓊脂糖凝膠，以此回收瓊脂糖凝膠中的DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有如下性質(zhì)的瓊脂分解酶。(1)作用水解瓊脂糖的β－1，4鍵，生成新瓊脂寡聚糖。(2)底物特異性至少作用于具有由瓊脂、瓊脂糖等D－半乳糖與3，6－脫水－L－半乳糖相互形成的β－1，4鍵和α－1，3鍵骨架的多糖類及具有相同骨架的寡聚糖，生成來(lái)源于瓊脂的寡聚糖。(3)溫度的影響于大于或等于54℃溫度進(jìn)行30分鐘的熱處理后活性仍殘留。與以往的瓊脂分解酶相比，此酶在高溫下仍有活性，因此能夠提高分解瓊脂的速度，利于在工業(yè)上應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1768136SQ20048000889
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者大田優(yōu)佳莉, 秦田勇二, 能木裕一, 伊藤進(jìn), 掘越弘毅 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)