專利名稱：針對丙型肝炎病毒e1e2復(fù)合體的抗體、hcv顆粒的組合物和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗HCV的新構(gòu)象(conformational)抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發(fā)明還涉及易于(liable)被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆?；蚣兓腍CV有包膜的完整病毒顆粒，以及制備它們的方法。
丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，并且可導(dǎo)致肝細(xì)胞癌。世界范圍內(nèi)約200百萬人慢性感染HCV，這種疾病已經(jīng)作為一種嚴(yán)重的全球健康問題顯現(xiàn)出來。HCV是一種有包膜的RNA病毒，屬于黃病毒科的肝炎病毒屬。其基因組是9.6kb正極性單鏈RNA，具有作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)起作用的5’非翻譯區(qū)(UTR)，編碼大約3,000個(gè)氨基酸的多蛋白(polyprotein)的單一可讀框以及3′UTR(Bartenschlager等，2000)。這種多蛋白在翻譯同時(shí)和之后通過宿主細(xì)胞肽酶切割產(chǎn)生包括核心蛋白及包膜糖蛋白E1和E2的結(jié)構(gòu)蛋白，以及通過病毒蛋白酶產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)2-5B(Bartenschlager等，2000)。與相關(guān)的正鏈RNA病毒類似，通過負(fù)鏈RNA中間體的方式發(fā)生復(fù)制并且由NS蛋白催化，其形成質(zhì)膜附著的復(fù)制酶復(fù)合體。
患者血漿樣品中存在的HCV顆粒的水平低以及缺乏支持有效HCV復(fù)制或顆粒裝配的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)妨礙了表征與病毒體相關(guān)的糖蛋白。當(dāng)前關(guān)于HCV包膜糖蛋白的知識是基于利用病毒或非病毒表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)物瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。這些研究已經(jīng)顯示了E1和E2糖蛋白相互作用形成復(fù)合體(Dubuisson，2000中的綜述)。存在非離子去污劑時(shí)，檢測到兩種形式的E1E2復(fù)合體通過非共價(jià)相互作用穩(wěn)定的E1E2異二聚體和異質(zhì)的二硫鍵連接的聚集物，后者被認(rèn)為代表錯(cuò)誤折疊的復(fù)合體。以前，通過用合成肽或重組抗原免疫已經(jīng)獲得了包膜糖蛋白特異性抗體。然而，構(gòu)象敏感性E2反應(yīng)性單克隆抗體(mAb)(H2)-其識別被認(rèn)為是HCV糖蛋白異二聚體的天然萌芽前(prebudding)形式的非共價(jià)連接的E1E2異二聚體-不與血清來源的HCV RNA陽性顆粒反應(yīng)(Deleersnyder等，1997)。此外，WO 92/07001公開了通過用從感染的黑猩猩中提取的HCV顆粒制劑免疫小鼠而制備的抗體，然而這些抗體未曾在天然HCV顆粒(即，源自感染患者)上進(jìn)行測試。此外，WO00/05266公開了從感染患者B細(xì)胞制備的抗體，然而這些抗體是根據(jù)它們結(jié)合重組E2蛋白的能力選擇的。因此，所有這些抗體的應(yīng)用都有限，或者用于診斷目的，或者用于治療或預(yù)防目的，因此它們是用非天然HCV或其部分生產(chǎn)或選擇的，而且未顯示出可與天然HCV顆粒相互作用。
缺乏含有足夠量和濃度的天然有包膜的HCV顆粒的HCV制劑，是迄今為止無法獲得易于識別天然HCV顆粒的抗體的原因之一。實(shí)際上，血漿樣品中低水平的HCV顆粒使表征和顯現(xiàn)觀察這種病毒變得困難。先前已經(jīng)顯示了在感染的急性期從自然感染患者的血漿中回收的病毒在蔗糖中具有大約1.06g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。相比之下，體外復(fù)制后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的HCV在蔗糖中具有1.12g/ml的浮力密度(Yoshikura等，1996)。最后，從慢性感染個(gè)體中回收的HCV在蔗糖中具有大約1.17g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。血清來源病毒的低密度歸因于其結(jié)合血清低密度脂蛋白(Thomssen等，1992)。已經(jīng)顯示高密度病毒與抗原-抗體復(fù)合物中結(jié)合到病毒的抗體有關(guān)(Kanto等，1995)。盡管有這些數(shù)據(jù)，但是仍然沒有表明這些不同HCV群的蛋白組成，以及是否低密度級分(＜1.0g/ml)含有包膜、RNA和核殼作為完整病毒體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與天然HCV顆粒反應(yīng)的抗體。
本發(fā)明的另一方面是提供天然HCV顆粒的組合物，其量和濃足以允許有效免疫抗體產(chǎn)生動(dòng)物。
本發(fā)明的另一方面是提供缺乏感染性，易于用作藥物組合物的活性物質(zhì)的特定HCV組合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合天然HCV病毒包膜的構(gòu)象抗體。
措辭“構(gòu)象抗體”指識別具有由其分子環(huán)境所限定的三維結(jié)構(gòu)的表位的抗體。
措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合到基本上僅在形成天然HCV病毒包膜的元件之一上發(fā)現(xiàn)的表位，也就是說，基本上不存在抗體與除形成天然HCV包膜的元件外的元件的結(jié)合。例如，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法檢驗(yàn)抗體的結(jié)合特異性，如Western印跡實(shí)驗(yàn)，其中生物樣品在凝膠上通過電泳遷移，然后轉(zhuǎn)移到膜上并且與所述抗體共孵育，其然后通過二抗檢測。如果實(shí)質(zhì)上所檢測的所有電泳條帶都含有靶化合物或其部分，則稱所述抗體“特異性結(jié)合”所述生物樣品中包含的靶化合物。
“HCV”意思是“丙型肝炎病毒”，其具體描述于Choo等(1989，1991)中。HCV特別地包括RNA、由核心蛋白構(gòu)成的衣殼以及包含脂質(zhì)和蛋白特別是糖蛋白的包膜。
“HCV病毒包膜”由脂質(zhì)和蛋白特別是糖蛋白如HCV蛋白E1和E2構(gòu)成(Clarke，1997)。
“天然的”意思是HCV，或其部分，是如同在生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，可能地是如同從生物樣品中分離的以及-如果需要的話-純化的。這種樣品可以是感染HCV的患者的血液、血漿或者血清。特別地，“天然的”指HCV，或其部分，其不是通過重組方法，或者通過使用細(xì)胞系或動(dòng)物生產(chǎn)的，并且不同于在例如Schalich等(1996)，Blanchard等，(2002)或WO 92/07001中所描述的HCV元件。
本發(fā)明更特別地涉及能特異性結(jié)合天然HCV E2蛋白的構(gòu)象抗體。
HCV E2特別地描述于Dubuisson(2000)和Op De Beeck等(2001)中。其作為多蛋白(3012個(gè)氨基酸)產(chǎn)生，經(jīng)過切割產(chǎn)生E2(384到714位氨基酸)。
措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合基本上僅在HCV E2蛋白上發(fā)現(xiàn)的表位，或其部分。特別地，在其中抗體-E2復(fù)合物與其它蛋白共同存在的競爭試驗(yàn)中，不能將該抗體從HCV E2蛋白上脫離下來。
措辭“天然HCV E2蛋白”意思是該蛋白是如同在感染HCV患者的生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，特別地天然HCV E2蛋白不是重組蛋白。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，其能夠中和患者中的HCV感染。
“中和HCV感染”意思是該抗體能夠改善感染HCV患者的健康，例如，可通過血液、血漿或血清中檢測到的HCV的減少得到證實(shí)，或者該抗體能預(yù)防個(gè)體被HCV感染。
可在模型動(dòng)物中監(jiān)測所述抗體中和HCV感染的能力，如黑猩猩或小鼠，特別是人源化小鼠，其慢性感染HCV，或者其在所述抗體存在時(shí)首先感染(primo-infected)HCV。所監(jiān)測的抗體應(yīng)當(dāng)能夠分別誘導(dǎo)減少HCV相關(guān)的病毒血癥或者預(yù)防HCV感染。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠沉淀在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的HCV E1E2復(fù)合體。
HCV E1E2復(fù)合體可以是非共價(jià)的，也就是說，E1和E2通過弱鍵的方式結(jié)合，如氫鍵，離子鍵，范德瓦耳斯鍵或疏水鍵；或所述復(fù)合體可以是共價(jià)的，也就是說E1和E2通過共價(jià)鍵的方式結(jié)合，例如二硫鍵。在Deleersnyder等(1997)中特別地描述或提出了E1E2復(fù)合體的共價(jià)和非共價(jià)形式。
“沉淀”意思是抗體可致使HCV E1E2復(fù)合體不溶。例如可根據(jù)Dubuisson和Rice(1996)所述發(fā)生沉淀。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E1蛋白。
特別地在Dubuisson(2000)和Op De Beeck等(2001)中描述了HCV E1。其作為多蛋白產(chǎn)生(3012個(gè)氨基酸)，經(jīng)過切割產(chǎn)生E1(192到383位氨基酸)。
措辭“特異性結(jié)合”意思是抗體結(jié)合基本上僅在HCV E1蛋白上發(fā)現(xiàn)的表位，或其部分。特別地在其中抗體-E1復(fù)合物與其它蛋白一起存在的競爭試驗(yàn)中，不能將該抗體從HCV E1蛋白上脫離下來。
措辭“天然HCV E1蛋白”意思是蛋白如在感染HCV患者的生物樣品中發(fā)現(xiàn)的，特別是該天然HCV E1蛋白不是重組蛋白。
本發(fā)明更具體地涉及構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E1蛋白，結(jié)合天然HCV E2蛋白，并且能沉淀在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的HCVE1E2復(fù)合體。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由至少下列序列之一構(gòu)成的表位HCV蛋白E1的297到306位氨基酸；HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合-呈現(xiàn)(presenting)包含HCV蛋白E1的297到306位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)；和/或-呈現(xiàn)包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)；和/或-呈現(xiàn)包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽的分子，對應(yīng)以下序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)可通過合成含有任何前述序列的肽以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法例如ELISA或EIA測定抗體結(jié)合所述合成肽的能力，檢驗(yàn)所述抗體與至少一種前述序列的結(jié)合。
首字母縮略詞“ELISA”意思是酶聯(lián)免疫吸附測定。
首字母縮略詞“EIA”意思是酶免疫測定。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的每一個(gè)構(gòu)成的表位HCV蛋白E1的297到306位氨基酸；HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合呈現(xiàn)表位的分子，所述的表位包含
-包含HCV蛋白E1的297到306位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)；和-包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)；和-包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽，對應(yīng)下列序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如ELISA或EIA，通過測定抗體結(jié)合一種分子，特別是包含序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)的蛋白，結(jié)合一種分子，特別是包含序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)的蛋白，以及結(jié)合一種分子，特別是包含序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)的蛋白的能力，檢驗(yàn)所述抗體與包含每種前述序列的表位的結(jié)合。
本發(fā)明涉及如上所定義的構(gòu)象抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
措辭“單克隆抗體”意思是所述抗體實(shí)質(zhì)上僅結(jié)合一個(gè)表位，或結(jié)合所述表位的部分。
可從來源于永生化抗體分泌細(xì)胞例如雜交瘤的單克隆細(xì)胞系獲得單克隆抗體。
單克隆細(xì)胞系來源于獨(dú)特細(xì)胞的培養(yǎng)。
可根據(jù)例如Kohler和Milstein(1975)或者根據(jù)Buttin等(1978)，通過抗體分泌細(xì)胞如B細(xì)胞與永生細(xì)胞的融合生產(chǎn)雜交瘤。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，如上所定義的單克隆抗體由根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale deCulture de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2983的雜交瘤分泌。
所述單克隆抗體特別地結(jié)合天然HCV病毒包膜，結(jié)合天然HCV E2蛋白，結(jié)合天然HCV E1蛋白，并且能夠沉淀在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的HCV E1E2復(fù)合體，并能夠結(jié)合由至少一種或者由所有上述定義序列構(gòu)成的表位。所述的單克隆抗體此后特別地稱作D32.10。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，如上所定義的單克隆抗體由根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale deCulture de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2982的雜交瘤分泌。
所述單克隆抗體特別地結(jié)合天然HCV病毒包膜并且結(jié)合HCV E2蛋白。所述單克隆抗體此后特別地稱作D4.12.9。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明抗體的片段或衍生物。本發(fā)明抗體的片段特別地包括Fab、F(ab′)2或scFv(單鏈Fv)片段，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。本發(fā)明抗體的衍生物包括-如果適當(dāng)?shù)脑?人源化抗體。人源化抗體例如可以是嵌合抗體，其中-如果適當(dāng)?shù)脑?用人抗體的相應(yīng)部分例如Fc片段置換根據(jù)本發(fā)明抗體的部分?？蛇x擇地，可將根據(jù)本發(fā)明的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體，例如根據(jù)在美國專利5,824,307中所述。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2983的雜交瘤。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2982的雜交瘤。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含至少一種上述所定義的抗體作為活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
藥學(xué)上可接受的載體特別是如在Remington′s PharmaceuticalSciences第16版/Mack Publishing Co.中所定義。
可在上述定義的組合物中包括其它化合物，特別是抗病毒化合物，如其它抗HCV抗體及其片段或衍生物、干擾素、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑或解旋酶抑制劑。
可以單劑量或多劑量施用上面所提到的藥物組合物。假設(shè)是單劑量，該組合物可包括從每公斤體重約0.1mg抗體到每公斤體重約1g抗體，特別地從約1mg/kg到約100mg/kg。假設(shè)是多劑量，可以每天每公斤體重約0.1mg抗體到每天每公斤體重約1g抗體的劑量，特別是從約1mg/kg/天到約100mg/kg/天，施用該組合物。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及至少一種如上所定義的抗體用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物的用途。
可使用根據(jù)本發(fā)明的抗體用于檢測傾向于含有HCV的生物樣品中的HCV病毒顆粒。可從感染HCV或者處于受HCV感染危險(xiǎn)的患者中獲得這些樣品，特別地包括血液、血漿或血清樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用抗體檢測病毒的任何方法，如ELISA或EIA，可以以本發(fā)明的抗體應(yīng)用。
可使用根據(jù)本發(fā)明的抗體用于制備向感染或未感染HCV的患者施用以中和HCV感染的藥物。可通過預(yù)防HCV接觸靶細(xì)胞進(jìn)行HCV感染中和，例如通過使抗體結(jié)合包膜分子，如E1或E2，其結(jié)合靶細(xì)胞膜受體，從而阻止HCV-靶細(xì)胞結(jié)合。
可向感染HCV的患者施用該抗體以防止HCV病毒顆粒感染細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞，或者促進(jìn)免疫系統(tǒng)細(xì)胞捕獲包被所述抗體的HCV。
可特別地在移植手術(shù)之前、期間或者之后，向接受移植器官特別是肝臟的患者施用該抗體，以中和可能在移植的器官中含有的HCV病毒顆粒。
本發(fā)明也涉及能結(jié)合至少一種上述所定義抗體的有包膜的病毒顆粒。
措辭“有包膜的病毒顆?！碧貏e地代表HCV病毒體，或者HCV病毒體的一部分，其含有包膜，所述包膜包含脂質(zhì)和/或蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結(jié)合(associated in leaflets)。
本發(fā)明也涉及結(jié)合有包膜病毒顆粒的抗體，所述病毒顆粒能結(jié)合至少一種上述所定義抗體。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及來源于人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的HCV RNA拷貝的濃度高約100到1000倍，特別是高于約107個(gè)拷貝/ml。
高濃度的根據(jù)本發(fā)明的組合物允許用所述的組合物有效免疫動(dòng)物。
HCV RNA特別是HCV基因組RNA。
可通過RT-PCR，特別是定量RT-PCR測量樣品的HCV RNA含量，例如用AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)。
可選擇地，也可使用NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù)(Damen等，1999)測量樣品的HCV RNA含量。
可以以所述樣品中HCV RNA分子的拷貝數(shù)目表示樣品的HCV RNA含量，一個(gè)拷貝等于一個(gè)國際單位(UI)。
樣品的HCV RNA含量指示所述樣品中所含有的HCV病毒體的量。
含有高于約107個(gè)拷貝/ml的HCV RNA的組合物允許用所述組合物有效地免疫動(dòng)物。
本發(fā)明更具體地涉及如上所定義的組合物，其中HCV RNA拷貝的數(shù)目是從每毫克蛋白約108到約109UI。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法評價(jià)組合物的蛋白含量，特別是通過Lowry測定(Lowry等，1951)如Biorad蛋白測定(BioradLaboratories)。
這種測量代表組合物的特異活性，其指示組合物的純度；每毫克蛋白中HCV RNA拷貝數(shù)目越高，含有HCV的組合物的純度就越高。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所定義的組合物，其中所述組合物的體積是從約0.1ml到約10ml。
約0.1ml到約10ml的組合物體積相當(dāng)于含有至少106HCV RNA拷貝的上述所定義的組合物。
這種組合物對于動(dòng)物的免疫有用。例如，如在實(shí)施例中所描述的，對小鼠的有效免疫需要施用含有高于約106HCV RNA拷貝的HCV病毒顆粒組合物。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及分離的實(shí)質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
術(shù)語“分離的”意思是顆粒已經(jīng)從其天然環(huán)境中提取出來，特別地其已經(jīng)與其它HCV病毒顆?；蚱浜蠬CV RNA和/或HCV核心蛋白的部分分離。
措辭“實(shí)質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白”意思是含有上述所定義的亞病毒顆粒的溶液含有如用AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)測量的低于104UI/ml的HCVRNA，以及如用Ortho-Clinical Diagnostics試驗(yàn)(Aoyagi等，1999)測量的低于1pg/ml的核心蛋白。
例如可用由在CNCM保藏的登錄號為I-2983的雜交瘤所分泌的抗體，此后稱作D32.10，或者由在CNCM保藏的登錄號為I-2982的雜交瘤所分泌的抗體，此后稱作D4.12.9，通過EIA或ELISA試驗(yàn)評估包膜的存在。
措辭“HCV有包膜的亞病毒顆?！币馑际窃擃w粒實(shí)質(zhì)上上僅含有HCV病毒體的包膜部分，也就是說脂質(zhì)和蛋白，特別是糖蛋白，在小葉中結(jié)合。迄今分離的HCV病毒顆粒含有HCV RNA和/或HCV核心蛋白。
本發(fā)明更具體地涉及如上所定義的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易于結(jié)合任何上述所定義的抗體。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印跡，評價(jià)上述所定義的亞病毒顆粒與本發(fā)明抗體的結(jié)合。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCVRNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜，并易于結(jié)合上述所定義的任何一種抗體。
本發(fā)明更特別地涉及包含純化的天然HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
措辭“HCV有包膜的完整病毒顆粒”意思是HCV病毒體含有HCV基因組RNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜。在現(xiàn)有技術(shù)中一直沒有關(guān)于含有這三種成分的HCV病毒顆粒的報(bào)道。
可通過使用如上所定義的方法評估是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜。
術(shù)語“純化的”意思是上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒已經(jīng)與其它化合物，如HCV有包膜的亞病毒顆粒分離。特別地，例如可通過電子顯微鏡術(shù)評價(jià)組合物含有比HCV有包膜的完整病毒顆粒少90％的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印跡評價(jià)上述所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒與根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法(clarifiedplasmapheresis)得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
可以以例如約190,000g到約220,000g，優(yōu)選地210,000g的速度，進(jìn)行超速離心約3小時(shí)到約5小時(shí)，優(yōu)選地4小時(shí)。
優(yōu)選的離心條件導(dǎo)致病毒顆粒沉淀，如HCV病毒顆粒，而不沉淀在澄清的血漿中含有的其它化合物。
術(shù)語“血漿取出法”意思是將患者的血液進(jìn)行過濾以獲得血漿，而將血液的剩余部分重新注射回患者。
術(shù)語“澄清的”意思是將從血漿取出法獲得的血漿以低速特別地以3000g離心30分鐘。
超速離心前血漿取出法的最初的體積有利地是大約1升。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及HCV病毒顆粒的組合物，如根據(jù)上面所提到的制備HCV病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份(element)根據(jù)它們的密度分成級分(fraction)；-回收實(shí)質(zhì)上不含HCV RNA、實(shí)質(zhì)上不含HCV核心蛋白以及含有能結(jié)合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉淀的超速離心可以從約190,000g到約220,000g，優(yōu)選地210,000g，進(jìn)行約40小時(shí)到約50小時(shí)，優(yōu)選地48小時(shí)，蔗糖梯度可有利地是從約10％到約60％w/w、從約20到約50％w/w、從約25％到約45％w/w，或者從約30％到約45％w/w。
檢驗(yàn)所獲得的所有級分是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和/或能結(jié)合D32.10或D4.12.9的顆粒。
當(dāng)通過AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)測量的HCV RNA的含量少于約104UI/ml時(shí)，稱該級分實(shí)質(zhì)上不含有HCV RNA。
當(dāng)通過Ortho-Clinical Diagnostics試驗(yàn)(Aoyagi等，1999)測量的HCV核心蛋白的含量少于約1pg/ml時(shí)，稱該級分實(shí)質(zhì)上不含有HCV核心蛋白。
使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為I-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32.10。
如果顆粒能在以下EIA試驗(yàn)中被檢驗(yàn)為陽性，則稱該顆粒能夠結(jié)合上面所提到的單克隆抗體用從10-1到10-4稀釋的不同級分包被96孔聚苯乙烯平板(Falcon；Becton Dickinson France S.A，Le Pont de Claix)。在4℃C過夜孵育平板，然后用含有5％(w/v)牛血清蛋白(BSA)的Tris-NaCl(TN)緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5和100mM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩沖液和50％正常人血清(NHS)的混合液中以5μg/ml的濃度稀釋的mAb D32.10加到每個(gè)孔中，并在37℃孵育2小時(shí)。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(1/5,000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結(jié)合的抗體。用ELISA讀板器(MRX，Dynex)在450nm或在490nm測定光密度(OD)。當(dāng)超過截止值(相當(dāng)于陰性對照的均值乘以2.1)時(shí)，則認(rèn)為結(jié)果是陽性的。
回收的級分特別地具有大約1.13到1.15g/ml的蔗糖密度。
可選擇地，首先檢驗(yàn)該級分中是否存在能結(jié)合D32.10和/或D4.12.9的顆粒，如果實(shí)質(zhì)上不存在這種顆粒，則不進(jìn)行其它的檢驗(yàn)，如果存在這種顆粒，則然后進(jìn)行HCV RNA檢驗(yàn)和/或HCV核心蛋白檢驗(yàn)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據(jù)上述制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法所獲得的。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；回收含有每毫升從約5.105到約106UI的HCV RNA、每毫升從約50到約100pg的HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
在蔗糖密度梯度中重懸的富集HCV的沉淀的超速離心可以從約190,000g到約220,000g，優(yōu)選地210,000g，進(jìn)行約40小時(shí)到約50小時(shí)，優(yōu)選地48小時(shí)，蔗糖梯度可有利地是從約10％到約60％w/w、從約20到約50％w/w、從約25％到約45％w/w或者從約30％到約45％w/w。
如上所示測量HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及顆粒的結(jié)合能力。
所使用的單克隆抗體特別地是由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體D32.10。
通過這種方法獲得的組合物特別地含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒并且特別地實(shí)質(zhì)上缺乏HCV有包膜的亞病毒顆粒。特別地，例如其可通過電子顯微鏡術(shù)評價(jià)組合物含有比HCV有包膜的完整病毒顆粒少90％的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
所回收的級分特別地具有大約1.17到1.21g/ml的蔗糖密度，更特別地具有大約1.17到1.20g/ml、大約1.19到1.21g/ml、大約1.17到1.19g/ml或者大約1.19到1.20g/ml的蔗糖密度。
可選擇地，首先檢驗(yàn)級分中是否存在HCV RNA，如果存在高于105拷貝/ml的HCV RNA，則然后進(jìn)行HCV核心蛋白的檢驗(yàn)，如果存在高于50pg/ml的核心蛋白，則然后檢驗(yàn)是否存在能結(jié)合D32.10和/或結(jié)合D4.12.9的顆粒；如果存在少于105拷貝/ml的HCV RNA，則不進(jìn)行其它檢驗(yàn)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，如根據(jù)上述相應(yīng)的方法所獲得的。
本發(fā)明也涉及制備由在CNCM保藏的登錄號為1-2983的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用本發(fā)明的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)本發(fā)明所制備的組合物免疫動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，并回收所產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中含有的HCV病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體。
可如下獲得HCV病毒顆粒的組合物-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
可用如上述所定義的間接EIA檢驗(yàn)對所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行選擇，用本發(fā)明的HCV病毒顆粒的組合物包被平板。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備由在CNCM保藏的登錄號為I-2982的雜交瘤所分泌的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用本發(fā)明的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)本發(fā)明制備的組合物免疫動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，以及回收所產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中含有的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
可如下獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；-回收含有每毫升從約5.105到約106UI的HCV RNA、每毫升從約50到約100pg的HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
可如上所述進(jìn)行選擇步驟。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備針對HCV特別是HCV有包膜的亞病毒顆粒的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用本發(fā)明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，或者根據(jù)本發(fā)明所制備的組合物免疫動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，并回收所產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物中含有的HCV有包膜的亞病毒顆粒的能力選擇單克隆抗體。
可如下獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物
-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀，以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分成級分；-回收實(shí)質(zhì)上不含HCV RNA、實(shí)質(zhì)上不含HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合以上定義為D32.10或D4.12.9的單克隆抗體的顆粒的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
可如上所述進(jìn)行選擇步驟。
本發(fā)明更特別地涉及針對本發(fā)明的HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體。
本發(fā)明也涉及包含至少一種針對HCV有包膜的亞病毒顆粒的抗體作為活性物質(zhì)以及藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含作為活性物質(zhì)的如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
可向藥物組合物中添加另外的佐劑，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences第16版/Mack Publishing Co.中所定義，佐劑可以是例如不完全弗氏佐劑、鋁鹽或氫氧化鋁。
例如可以以包含從1mg到1g的HCV有包膜的亞病毒顆粒的單劑量施用組合物。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用于誘導(dǎo)抗所述HCV有包膜的亞病毒顆?；蚩谷缟纤x的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應(yīng)。
措辭“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”意思是可激活分泌抗HCV病毒顆粒的抗體的B細(xì)胞或者可激活破壞感染HCV的細(xì)胞的T細(xì)胞。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及如上所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的用途，或者包含上述所定義的HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的用途，用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物。
可使用HCV有包膜的亞病毒顆粒，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，在免疫測定如EIA、ELISA中，評估是否存在針對HCV的抗體。
可使用HCV有包膜的亞病毒顆粒用于制備抗丙型肝炎的疫苗，特別是治療性疫苗。
措辭“治療性疫苗”意思是該疫苗能改善感染HCV患者的情況，例如通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HCV的抗體。
附圖的簡要說明

圖1A、圖1B、圖1C、圖1D和圖1E圖1A、1B、1C、1D和1E表示抗體沉淀的35S標(biāo)記細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。泳道1、2、3、4、5、6和7分別對應(yīng)于抗體C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12、C7.24.19、C7.14.41和C1.9.3。MW對應(yīng)于分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。在凝膠的右邊給出與分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物對應(yīng)的條帶的大小。如果可能，在凝膠的左邊將條帶鑒定為E1、E2或Agg(對于聚集的)。
圖1A表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的對照細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在還原條件下。
圖1B表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達(dá)HCV E1蛋白的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在還原條件下。
圖1C表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達(dá)HCV E2蛋白的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在還原條件下。
圖1D表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達(dá)HCV E1E2蛋白的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在還原條件下。
圖1E表示抗體沉淀的35S標(biāo)記的表達(dá)HCV E1E2蛋白的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE，在非還原條件下。
圖2圖2表示HCV病毒顆粒的Western印跡，使用D32.10單克隆抗體，在非還原和還原條件下。從左到右，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在非還原條件下，在凝膠的左邊指示其條帶的大小(以kDa表示)，泳道1代表使用D32.10單克隆抗體在非還原條件下HCV病毒顆粒的Western印跡，第二個(gè)泳道M代表在還原條件下的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道2代表使用D32.10單克隆抗體在還原條件下2,5μg HCV病毒顆粒的Western印跡，泳道3代表使用D32.10單克隆抗體在還原條件下5μg HCV病毒顆粒的Western印跡。在凝膠的右邊，指示泳道3的幾個(gè)條帶的大小(以kDa表示)，一些對應(yīng)于HCV蛋白E2(60和68)或者對應(yīng)于HCV蛋白E1(34和31)。
圖3A和圖3B圖3A和圖3B表示經(jīng)受糖苷酶A(圖3A)和內(nèi)切糖苷酶H(圖3B)去糖基化的HCV病毒顆粒的Western印跡。
在圖3A中，泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中3個(gè)的大小(以kDa表示)；泳道1、2、3和4分別代表糖苷酶濃度為20、10、5和0mU/ml。在凝膠的右邊，指示HCV蛋白E2和E1的位置，以及蛋白E1的主要去糖基化形式(E1*)的位置和對應(yīng)于E1或E2的去糖基化形式的幾個(gè)條帶的大小(以kDa表示)，以及E2的主要去糖基化形式(41*)。
在圖3B中，泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左邊指示其條帶中4個(gè)的大小(以kDa表示)；泳道1和2分別代表無內(nèi)切糖苷酶H進(jìn)行的對照去糖基化實(shí)驗(yàn)和存在內(nèi)切糖苷酶H時(shí)進(jìn)行的去糖基化實(shí)驗(yàn)。在凝膠的右邊代表對應(yīng)于E2和E1的完全糖基化形式以及對應(yīng)于E2(50、48、46和42kDa)和E1(28和24kDA)的去糖基化形式的主要條帶。通過星號標(biāo)記E2(50*)和E1(28*)的占優(yōu)勢的去糖基化形式。
圖4圖4表示通過對HCV病毒顆粒制劑的蔗糖密度梯度離心所得到級分的表征。已經(jīng)測量了3個(gè)參數(shù)，HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及對D32.10單克隆抗體的反應(yīng)性。水平軸代表接受表征的級分的編號。左邊的垂直軸代表HCV RNA濃度(×105UI/ml)和通過間接EIA測量(在450nm的OD)的對D32.10反應(yīng)性的測量值。右邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黑點(diǎn)對應(yīng)的曲線代表級分對D32.10的反應(yīng)性，與白色三角形對應(yīng)的曲線代表級分核心蛋白含量，虛線代表級分HCV RNA含量。
圖5A、圖5B和圖5C圖5A、圖5B和圖5C分別代表HCV病毒顆粒制劑、HCV有包膜的完整病毒顆粒制劑以及HCV有包膜的亞病毒顆粒制劑的透射電子顯微鏡照片。
在圖5A中，水平條代表200nm長的刻度。較大的圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒，較小的圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。
在圖5B中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的完整病毒顆粒。
在圖5C中，水平條代表50nm長的刻度。圓形成分代表HCV有包膜的亞病毒顆粒。
圖6圖6表示使用D4.12.9單克隆抗體的HCV病毒顆粒的Western印跡。泳道M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，在凝膠的左側(cè)和右側(cè)指示其4個(gè)條帶(75、50、37、25)的大小(以kDa表示)。泳道1和2代表分別用糖苷酶A和用內(nèi)切糖苷酶H消化HCV病毒顆粒的結(jié)果，泳道3和4代表用蛋白酶胰蛋白酶和V8蛋白水解消化HCV病毒顆粒的結(jié)果，泳道5代表用NP-40溶解的結(jié)果，在泳道6中沒有進(jìn)行先前的處理。在凝膠的右邊，指示未消化的E2蛋白的兩種主要形式(68和48)(以kDa表示)，在凝膠的左邊表示E2的主要去糖基化形式(E2*)。
圖7圖7表示對HCV病毒顆粒制劑的蔗糖密度梯度離心所獲得級分的基于D4.12.9的表征。除了級分對D4.12.9的反應(yīng)性，還測量了級分核心蛋白含量。水平軸代表接受表征的級分的編號。右邊的垂直軸代表通過間接EIA(在450nm的OD)測量的對D4.12.9反應(yīng)性的測量值。左邊的垂直軸代表HCV核心蛋白濃度(以pg/ml表示)。與黑色正方形對應(yīng)的曲線代表級分對D4.12.9的反應(yīng)性，與黑色菱形對應(yīng)的曲線代表級分核心蛋白含量。
圖8A、圖8B和圖8C圖8A、圖8B和圖8C表示3種生物素化肽，分別包含第290-317位氨基酸(圖8A)、第417-500位氨基酸(圖8B)以及第605-629位氨基酸(圖8C)，對健康個(gè)體(11份血清，在水平軸上編號為T1到T11)和HCV感染患者(44份血清，在水平軸上編號為A1到A44)的55份血清的免疫反應(yīng)性。垂直軸代表通過ELISA(在490nm的OD值乘以1000)測定的血清對三種肽的反應(yīng)性。白色條形代表健康個(gè)體的血清的反應(yīng)性，灰色條形代表感染患者的血清的反應(yīng)性。水平線代表截止值，在其之上的血清反應(yīng)被認(rèn)為是陽性。在圖8A中，截止值是0.691，在圖8B中是0.572，在圖8C中是0.321。
圖9A和圖9B通過Ortho Clinical Diagnostics的總HCV核心抗原測定對HCV-Fan沉淀和來自上述1型的從30到45％蔗糖梯度的級分中的HCV核心蛋白進(jìn)行定量(圖9A)并通過Western印跡進(jìn)行分析(圖9B)。(圖9A)以1∶2稀釋檢驗(yàn)所有級分。檢驗(yàn)1∶25、1∶50和1∶100稀釋的HCV-Fan沉淀，發(fā)現(xiàn)含有332pg/ml。所有稀釋都用TNE緩沖液進(jìn)行。截止值是1.4pg/ml。(圖9B)對HCV-Fan沉淀和來自30-45％蔗糖梯度的第4、8、12和13級分進(jìn)行SDS-12.5％PAGE。使用抗核心、7G12A8、2G9A7和19D9D6單克隆抗體的混合物(每種5μg/ml)檢測HCV核心蛋白。使用Amersham的ECL Plus系統(tǒng)使印跡顯影。左邊的數(shù)字指示以千道爾頓(kDa)表示的標(biāo)準(zhǔn)參照物(M)的分子量，右邊指示HCV核心蛋白。
圖10通過定量RT-PCR Amplicor HCV Monitor test version 2.0(Roche Diagnostics)在所有來自最初10到60％蔗糖梯度的級分中分析HCV RNA。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明進(jìn)行檢驗(yàn)。通過使用QS國際單位(IU)計(jì)算每個(gè)PCR的結(jié)果，其對每批都是特異的，并且以IU HCVRNA/ml表示。
圖11A和圖11B通過電子顯微鏡術(shù)(EM)對血清來源的HCV有包膜的顆粒進(jìn)行分析。通過使用MAb D32.10(5μg)(a、b、c和d組)或不相關(guān)的Mab(e組)對HCV-Fan沉淀(2μg)進(jìn)行免疫沉淀，通過超速離心沉淀后的免疫復(fù)合物吸附到格柵上并用1％乙酸雙氧鈾(pH 4.5)染色。使用JEOL 100CX電子顯微鏡觀察該制劑。(圖11A)顆粒直徑(用nm表示)有些變化，對156個(gè)病毒顆粒(VPs)繪制直方圖。顆粒大小分布顯示在35nm處集中的峰。(圖11B)電子顯微鏡照片。a、b、c和e組中的條帶指示50nm。
圖12A和圖12B用D32.10免疫沉淀、在格柵上吸附以及染色后，通過電子顯微鏡術(shù)分析來自蔗糖梯度峰1(圖12A)和2(圖12B)的HCV-Fan顆粒。(圖12A)對41個(gè)病毒顆粒繪制直方圖。在峰1中占主要的種類(85.4％)是直徑約20nm的球形顆粒，所謂的《小顆?！贰?圖12B)對89個(gè)病毒顆粒繪制直方圖。峰2中最普遍的形式(77.5％)平均直徑約41nm。峰2似乎在大小上有點(diǎn)更不均勻，并且主要由直徑35和50nm的顆粒組成，所謂的《大顆?！?。條形指示50nm。
圖13有包膜的HCV顆粒的間接免疫金標(biāo)記。將用D32-10-免疫復(fù)合物(HCV沉淀，20μg；MAb D32.10，5μg)包被的顯微鏡格柵與作為二抗的1∶50稀釋的偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG的膠體金顆粒(10nm)孵育。根據(jù)IgG的空間位阻(在EM中約15nm)，僅有少數(shù)金顆?？设b定抗體結(jié)合。在病毒顆粒外沒有觀察到金顆粒。在所有圖形中的條形都指示20nm。
圖14A、圖14B、圖14C和圖14D圖14A和14B表示來自基因型1b的分離物HCV-L的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中等密度離心的結(jié)果。
圖14A表示離心后所獲得級分(水平軸)的密度(左側(cè)的垂直軸，g/ml)和E1E2-D 32.10反應(yīng)性(右側(cè)的垂直軸，A490nm)。
圖14B表示第6、8、10、12和14級分的Western印跡，使用抗E1E2 MAb D32.10。左側(cè)的數(shù)字指示以千道爾頓(kDa)表示的標(biāo)準(zhǔn)參照物(M)的分子量，右側(cè)指示HCV E1和E2蛋白。
圖14C和14D表示來自基因型1a/2a的分離物HCV-Fan的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中等密度離心的結(jié)果。圖14C表示離心后所獲得級分(水平軸)的密度(左側(cè)的垂直軸，g/ml)和E1E2-D 32.10反應(yīng)(右側(cè)垂直軸，A490nm)。
圖14D表示第6、8、10、12和14級分的Western印跡，使用抗E1E2 MAb D32.10。
對于EIA，將每個(gè)級分稀釋1/10000(圖4A和4C)，對于Western印跡每個(gè)泳道使用5μl所選級分(圖4B和4D)。通過折光測定法測定級分的密度并以g/ml表示。在490nm測定吸光度(A)。當(dāng)超過截止值(對應(yīng)于陰性對照(至少3個(gè)值)的均值乘以2.1)時(shí)，則認(rèn)為EIA的結(jié)果是陽性的。使用Amersham的ECL Plus系統(tǒng)顯示印跡。
圖15A、圖15B和圖15CHCV-Fan沉淀在1型30到45％蔗糖梯度(2ml 30％、3ml 35％、3ml 40％、2ml 45％)中的等密度離心(圖15A)。將來自蔗糖梯度(30-45％)峰1(級分8)和2(級分12和13)的顆粒個(gè)別單獨(dú)地進(jìn)行第二次平衡離心(分別是圖15B和15C)。將峰1在2型30到45％蔗糖梯度(3ml 30％、3ml 35％、2ml 40％、2ml 45％)中進(jìn)行離心(圖15B)。將峰2在3型30到45％蔗糖梯度(2ml 30％、2ml 35％、3ml40％、3ml 45％)中進(jìn)行離心(圖15C)。通過折光測定法測定級分的密度，以g/ml表示。如前面所述通過間接EIA分析E1E2-D32.10反應(yīng)性。
實(shí)施例1獲得針對天然HCV病毒包膜的單克隆抗體HCV病毒顆粒制備為了獲得良好供應(yīng)的病毒材料，通過血漿取出法進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。所選擇的患者在由于丙型病毒性肝硬化而進(jìn)行部分肝移植后，發(fā)展成慢性活動(dòng)性丙型肝炎，12個(gè)月后與高丙球蛋白血癥相關(guān)的多發(fā)性骨髓瘤是血漿置換的原因。患者表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)水平異常升高，并且抗HCV抗體陽性?；颊邔λ蠬BV和HIV標(biāo)記均陰性。最初材料的HCV RNA含量是6×105拷貝/ml(AmplicorTMHCVMonitorTM，Roche Diagnostics，Meylan，F(xiàn)rance)，基因型是1b(INNO-LIPA試驗(yàn)，Innogenetics，Gent，Belgium)。
使用澄清的血漿取出法通過在4℃，210,000g連續(xù)兩次超速離心4小時(shí)制備富集HCV的沉淀。在1ml Tris-NaCl-EDTA(TNE)緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)(240倍濃度)中重懸最終的沉淀，并貯藏在-80℃。這種材料的HCV RNA含量是3×107拷貝/ml(Monitor，Roche)，蛋白濃度是5mg/ml(即，每毫克蛋白約107個(gè)HCV RNA拷貝)。
雜交瘤制備為了產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，用處于完全弗氏佐劑中的100μg(106個(gè)HCV RNA拷貝)HCV-沉淀的材料接種BALB/c小鼠，1周后用處于不完全弗氏佐劑中的100μg病毒接種。三只經(jīng)免疫的小鼠產(chǎn)生較高的抗HCV的血清抗體效價(jià)，通過間接酶免疫測定(EIA)檢測。三周后，用50μg處于磷酸緩沖鹽水(PBS)中的病毒對小鼠進(jìn)行強(qiáng)化。5天后重復(fù)注射，3天后取出脾，通過Buttin等(1978)所描述的操作與X63骨髓瘤細(xì)胞融合。使用免疫原作為固相(5μg/ml)以及偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(Amersham，F(xiàn)rance)作為顯示二抗(Petit等，1987)，通過間接EIA篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液中是否存在HCV特異性抗體。稀釋液含有50％正常人血清(NHS)以消除針對可能與HCV病毒顆粒相關(guān)的NHS蛋白的非特異性反應(yīng)性。然后通過限制性稀釋再克隆對HCV產(chǎn)生最強(qiáng)信號(P/N＞10)的雜交體并且進(jìn)一步測定它們的特異性。選出7個(gè)克隆(C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12、C7.24.19、C7.14.41和Cl.9.3)，將4個(gè)克隆(D32.10、C2.22.1、C9.19.16和D3.20.12)通過注射到降植烷致敏的BALB/c小鼠中以產(chǎn)生腹水而進(jìn)行增殖，然后通過用50％飽和的(NH4)2SO4沉淀，隨后在瓊脂糖凝膠-蛋白G(Pharmacia，F(xiàn)rance)中通過親和層析進(jìn)行純化。以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過ELISA測定同種型。所分析的7個(gè)克隆產(chǎn)生IgGl同種型抗體。
單克隆抗體表征使用間接EIA評價(jià)上面所提到的單克隆抗體與病毒顆粒的相互作用。用從10-1到10-6稀釋(對應(yīng)于100μg/ml到1ng/ml)的HCV制劑(每毫升1mg蛋白)包被96孔聚苯乙烯板(Falcon；BectonDickinson France S.A，Le Pont de Claix)。平板在4℃過夜孵育，然后用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Tris-NaCl(TN)緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5和100mM NaCl)飽和。將在TN/BSA緩沖液和50％正常人血清(NHS)的混合物中以5μg/ml濃度稀釋的mAbD32.10添加到每個(gè)孔中，并且在37℃孵育2小時(shí)。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(1/5,000稀釋；Immunotech)以及用鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)作為底物，檢測結(jié)合的抗體。用ELISA讀板器(MRX，Dynex)在450nm測定光密度(OD)。當(dāng)超過截止值(對應(yīng)于陰性對照的均值乘以2.1)時(shí)，則認(rèn)為結(jié)果是陽性的。所獲得的7種抗體的確識別病毒顆粒。
為了建立mAb的天然多肽特異性，使用免疫原作為抗原探針進(jìn)行免疫印跡(Petit等，1987)。在還原條件下(2％SDS+5％2-ME)，在12.5％凝膠上進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，對在50％NHS中稀釋的mAb(2到5μg/ml)作為一抗進(jìn)行檢驗(yàn)，通過與作為二抗的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀釋，IMMUNOTECH)孵育，檢測結(jié)合的IgG。通過Amersham的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL+)系統(tǒng)顯現(xiàn)條帶。
除了D32.10外，所有被檢驗(yàn)的mAb在還原條件下與HCV多肽呈陰性反應(yīng)。值得注意的是除了C1.9.3和C7.24.19在EIA中與人IgG微弱地反應(yīng)(大約是陰性值的5倍)外，所選的mAb既不與人血清白蛋白也不與免疫球蛋白(Ig)的γ或μ鏈反應(yīng)。
還通過免疫沉淀檢查7種抗體的多肽特異性。根據(jù)以前所描述的方法(Dubuisson等，1996)用35S-Translabel(ICN)代謝性標(biāo)記由表達(dá)HCV蛋白(E1、E2或E1E2)的痘苗病毒重組體感染的HepG2細(xì)胞。用在10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，和2mM EDTA中的0.5％NP-40溶解細(xì)胞。沉淀用Laemmli樣品緩沖液處理并在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖1)。所檢驗(yàn)的單克隆抗體不顯示針對細(xì)胞成分的非特異性反應(yīng)性，除了C9.19.16(＞200kDa)、D3.20.12(在70、50和46kDa的3個(gè)強(qiáng)條帶)以及更微弱地，C2.22.1(70、50、46kDa)和D32.10(多個(gè)非常弱的條帶)(圖1A，對照載體)。當(dāng)兩個(gè)HCV糖蛋白分別表達(dá)時(shí)，所有抗體都特異性免疫沉淀E1(圖1B)和E2(圖1C)，以及當(dāng)這些蛋白共表達(dá)時(shí)沉淀E1E2異二聚體(圖1D)，。有趣地是，在非還原和還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE后的模式不同(圖1D、1E)。所有抗體都識別二硫鍵連接的E1E2聚集體，其在非還原條件下在凝膠的上部檢測到(圖1E)。發(fā)現(xiàn)一種mAb，D32.10，主要與聚集體反應(yīng)并且也與E1E2非共價(jià)連接的成熟復(fù)合體反應(yīng)(圖1E，非還原條件)。通過Western印跡分析，所有mAb都不識別在異種系統(tǒng)中表達(dá)的變性的重組E1或E2蛋白，提示它們識別HCV病毒顆粒上的構(gòu)象表位。歸納起來，這些結(jié)果表明這些mAb特異性識別在天然血清來源的HCV病毒顆粒表面表達(dá)的二硫鍵連接的E1E2復(fù)合體。這非常有可能是由于它們與E1和E2蛋白之間共享的構(gòu)象表位反應(yīng)。選擇與在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的E1E2復(fù)合體相互作用的單克隆抗體D32.10用于進(jìn)一步研究。
單克隆抗體D32.10抗原作圖為了檢驗(yàn)D32.10的HCV型特異性，根據(jù)已經(jīng)描述的方法，用從10-1到10-6稀釋(對應(yīng)于100μg/ml到1ng/ml)的4種不同HCV制劑(每毫升1毫克蛋白)進(jìn)行間接EIA。除了免疫原HCV制劑外，使用從同一患者中獲得的制劑，以及從患有慢性丙型肝炎的2名不同患者中獲得的兩種其它制劑，其中一名患者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在血清中攜帶不同的基因型，即HCV1a和HCV2a。發(fā)現(xiàn)D32.10能識別所有四種HCV制劑，因此表明其能識別不限于免疫原1b基因型的抗原決定簇。
為了評價(jià)D32.10的天然多肽特異性，進(jìn)行Western印跡分析。使用未處理的富集HCV的沉淀作為抗原探針，以不同濃度，從0.1到1mg/ml。將抗原在還原或非還原條件下(2％SDS±5％2-巰基乙醇(2-ME))在12.5％凝膠上進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，使用在50％NHS中稀釋的mAb D32.10(2到5μg/ml)作為一抗進(jìn)行免疫印跡。然后通過與作為二抗的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀釋；DAKO)孵育，檢測結(jié)合的小鼠IgG。通過Amersham的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL+)系統(tǒng)顯示蛋白條帶。根據(jù)以前Sato等(1993)所描述的方法對循環(huán)的HCV病毒體進(jìn)行糖苷酶消化。用在100mM檸檬酸/磷酸緩沖液(pH6.0)中的5、10或20mU/ml的糖苷酶A(肽-N-糖苷酶A或PNGase A；ROCHE)在37℃對富集HCV的沉淀(HCV-L，4μg)處理18小時(shí)。也通過在37℃在含有內(nèi)切糖苷酶H(Roche的endo H，5mU/μl)、20mM二硫蘇糖醇(DTT)和0.1％Triton X100的50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.5)中過夜孵育，對純化的HCV病毒顆粒進(jìn)行去糖基化。除了省略酶外，使用與PGNase A消化或endo H消化相同的條件進(jìn)行對照消化。然后用含有還原劑的電泳樣品緩沖液處理樣品并通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。
在圖2中顯示W(wǎng)estern印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。當(dāng)在還原條件下(2％SDS/5％2-ME)分析相同樣品的兩個(gè)濃度(2.5和5μg，分別是泳道2和3)時(shí)，mAb D32.10識別68kDa的主要條帶和31kDa的另一條帶，分別對應(yīng)于E2和E1。然而，在非還原條件下，mAb 32.10識別在凝膠的上部回收的二硫鍵連接的復(fù)合體(＞200kDa)。這些高分子量條帶(圖2，泳道1)非常有可能對應(yīng)于異二聚的E1E2復(fù)合體。
已經(jīng)顯示天冬酰胺連接的復(fù)合體類型糖鏈存在于HCV天然病毒體的表面(Sato等，1993)，因此檢查用不同濃度(20、10和5mU/ml)的糖苷酶(PNGase A)處理HCV制劑后D32.10mAb識別HCV特異性蛋白的能力。如在圖3A(分別是泳道1、2和3)中所示，D32.10與E1的去糖基化形式，特別是25kDa反應(yīng)，其在最高酶濃度累積。去糖基化后可通過D32.10清楚地檢測到E1相關(guān)產(chǎn)物，而處理后不能清楚地鑒定E2相關(guān)產(chǎn)物。內(nèi)切糖苷酶H(endo H)消化允許研究在天然HCV病毒顆粒上表達(dá)的E1E2復(fù)合體對endo H切割的敏感性。如在圖3B中所示，對于E2(從68到42kDa)和E1(從34到24kDa)蛋白都觀察到分子量遷移，提示E1和E2在血清來源的天然HCV病毒顆粒上具有復(fù)雜的糖基化，這可以解釋部分endo H抗性，如endo H抗性復(fù)合聚糖和敏感形式的混合物。
D32.10表位作圖a.肽文庫的篩選為了進(jìn)一步表征mAb D32.10識別的表位，使用該抗體篩選十二肽噬菌體展示文庫Ph.D.-12TM噬菌體展示肽文庫試劑盒購自New England BioLabsInc.。這是一種與M13噬菌體的小外殼蛋白(pIII)融合的組合肽12聚體。在pIII的N末端表達(dá)所展示的肽12聚體。該文庫由約1.9×109個(gè)電穿孔的序列構(gòu)成，擴(kuò)增一次在10μl所提供的噬菌體中產(chǎn)生約20個(gè)拷貝的每個(gè)序列。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，并作一些改動(dòng)，進(jìn)行3次生物淘選(biopanning)。簡而言之，將10μg生物素化的mAbD32.10偶聯(lián)到用40μg鏈霉抗生物素包被的35mm聚苯乙烯Petri平皿(Falcon)上。將平皿在4℃過夜孵育并用含有0.5％吐溫-20的50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5(TBS)(TBS-T)沖洗6次。在第一輪選擇中，允許來自最初文庫的4×1010個(gè)噬菌體與平皿結(jié)合的IgG在搖動(dòng)的條件下在4℃反應(yīng)4小時(shí)。通過用TBS-T重復(fù)沖洗除去未結(jié)合的噬菌體。然后用400μl洗脫緩沖液(0.1N HCl，用甘氨酸將pH調(diào)整到2.2，1mg/ml BSA)從平皿洗脫結(jié)合的噬菌體。用75μl 1MTris-HCl pH9.1中和后，然后根據(jù)使用手冊中的建議，通過感染20ml1∶100稀釋的大腸桿菌(E.coli)ER2537(recA+菌株細(xì)胞)的過夜培養(yǎng)物，擴(kuò)增洗脫的噬菌體。將培養(yǎng)物在37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。獲得上清液，并根據(jù)以前所描述的方法(Scott等，1990)用聚乙二醇(PEG)沉淀。在第二輪和第三輪選擇中，在添加到用10μg鏈霉抗生物素包被的35nm聚苯乙烯Petri平皿前，將來自前一輪的20％擴(kuò)增噬菌體分別與終濃度為10和1nM的生物素化mAb D32.10在4℃預(yù)先孵育過夜。接下來的操作與第一輪相同。然后克隆并擴(kuò)增來自第三次生物淘選洗脫液的噬菌體，用于DNA測序和免疫分析。
對于DNA測序，根據(jù)Sambrook等(1982)所描述的方法從純化的噬菌體制備單鏈DNA。根據(jù)修改的Sanger(Sanger等，1977)法，使用BigDyeTM終止子循環(huán)測序Ready反應(yīng)試劑盒(Perkin-Elmer)，用Applied biosystems DNA測序儀(377A型)測定基因III插入片段的核苷酸序列。用對應(yīng)于pIII基因序列的引物5′HO-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-OH 3′(SEQ ID NO4)進(jìn)行循環(huán)測序。從核苷酸序列推定插入片段的氨基酸序列。
對于上清液噬菌體的ELISA，用100μl溶于0.1M NaHCO3緩沖液(pH8.6)，終濃度為100μg/ml的mAb D32.10或不相關(guān)的mAb包被成排ELISA平板孔。將平板在4℃過夜孵育，然后用含有5mg/ml BSA的0.1M NaHCO3緩沖液(pH8.6)封閉。在4℃孵育2小時(shí)后，用含有0.5％吐溫的TBS沖洗平板6次。向微量滴定平板的每個(gè)孔中添加每種噬菌體克隆的4倍系列稀釋液，終體積為100μl TBS-T，以每排第一個(gè)孔1012個(gè)病毒體開始，以第12個(gè)孔2×105個(gè)病毒體結(jié)束。將平板在室溫下振蕩孵育2小時(shí)，然后如上用TBS-T洗6次。在使用1∶5,000稀釋的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗M13 mAb(Pharmacia)的夾心試驗(yàn)中，檢測結(jié)合的噬菌體。使用含有OPD和H2O2的商業(yè)化顏色試劑盒(bioMerieux)使平板顯色。孵育10分鐘后，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。對于每個(gè)噬菌體克隆稀釋液，結(jié)果以用所檢驗(yàn)的抗HCV mAb獲得的值和用無關(guān)mAb獲得的值之間的差異表示。然后通過檢驗(yàn)一式三份免疫反應(yīng)克隆的最佳稀釋液證實(shí)結(jié)果。
對于測序分析，通過使用Mac Vector，Ver.4.5軟件(Kodak)將肽的氨基酸序列與HCV E1和E2蛋白序列比較?；旧?，用LFASTA程序檢測最高相似性的區(qū)域，其試驗(yàn)性地搜索最佳的局部同一性(Pearson和Lipman，1988)。
三輪選擇后，在指示特異性結(jié)合噬菌體的擴(kuò)增的洗脫液中發(fā)現(xiàn)4％的噬菌體輸入。因此，隨機(jī)分離88個(gè)克隆，對它們的DNA進(jìn)行測序并且推定插入片段的氨基酸序列。獲得了48個(gè)不同序列，在幾個(gè)實(shí)例中發(fā)現(xiàn)了其中的一些序列。然而，當(dāng)在ELISA試驗(yàn)中檢驗(yàn)它們與D32.10的免疫反應(yīng)性時(shí)，其中沒有一個(gè)給出陽性信號，表明結(jié)合親和力太低以至于無法檢測到。將48個(gè)克隆序列與HCV E1和E2的序列進(jìn)行比較。分別有5個(gè)和3個(gè)序列顯示與位于292-305區(qū)和347-356區(qū)的E1殘基相似(在表1中以粗體指示相似)，而分別有7個(gè)、4個(gè)和2個(gè)序列與E2位于481-501、610-631和685-698區(qū)的殘基共有一些相似性(在表2中以粗體指示相似)。
表1
表2
b.肽合成為了評價(jià)在E1和E2序列上這些不同定位的意義，復(fù)制E1的291-315和347-356區(qū)以及E2的473-498、607-627和686-697區(qū)，作為偏移一位的重疊的合成十五肽，并檢驗(yàn)它們與D32.10的免疫反應(yīng)性。
在硝酸纖維素膜上使用9-芴基甲氧羰基氨基酸化學(xué)(Frank，1988)同時(shí)合成不同的肽序列。
產(chǎn)生適于免疫學(xué)檢測的納摩爾量的每種肽。根據(jù)以前所描述的方法(Jolivet-Reynaud，1998)通過間接比色免疫測定分析抗體對膜結(jié)合肽的反應(yīng)性。對應(yīng)于具有抗體反應(yīng)性的肽的點(diǎn)產(chǎn)生陽性藍(lán)色信號。通過顯示觀察估計(jì)點(diǎn)的強(qiáng)度并且用從0到5等級的相對強(qiáng)度表示。
用與292-305 E1區(qū)對應(yīng)的肽獲得強(qiáng)陽性信號，而347-356 E1區(qū)沒有被D32.10識別。分別與E2區(qū)482-499和612-626對應(yīng)的肽也與D32.10發(fā)生免疫反應(yīng)，用E2區(qū)686-697沒有檢測到信號。在ELISA中E1的292-306區(qū)以及E2的480-494和608-622區(qū)作為十五肽與D32.10相互作用。
通過使用重疊的十五肽，HCV E1蛋白的297RHWTTQGCNC306(SEQ ID NO1)區(qū)以及HCV E2蛋白的613yRLWHYPCT621(SEQ ID NO3)和480PDQRPYCWHYPPKPC494(SEQ ID NO2)兩個(gè)區(qū)都與D32.10反應(yīng)。在E2中所鑒定的這兩個(gè)區(qū)含有由Yagnik等(2000)提出的在E1E2的異二聚體化中涉及的相同基序WHYP。區(qū)分這些區(qū)域很困難，但是作為兩個(gè)非重疊區(qū)479GPDQRPYC486(SEQ ID NO26)和487WHYPPKPC449(SEQ ID NO27)分別結(jié)合D32.10，這提示D32.10特異性識別每種八肽，因此識別整個(gè)序列(480-494)。
實(shí)施例2血清來源HCV病毒顆粒的表征和純化為了分離不同的HCV群，將最終的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60％，w/w)中進(jìn)行等密度離心(在4℃，210,000g離心48小時(shí))。收集級分(0.6ml)，通過折光測定法測定每種級分的密度。通過定量RT-PCR(Amplicor Monitor，Roche)分析HCV-RNA含量，用Ortho-Clinical Diagnostics試驗(yàn)測定HCV核心蛋白含量并通過間接EIA測定HCV病毒顆粒對mAb D32.10的抗原反應(yīng)性。
除了用從10-1到10-4稀釋的不同級分包被孔，如上所述進(jìn)行間接EIA。
鑒定了三個(gè)不同群(圖4)。一個(gè)群(級分3到5)在1.06-1.08g/ml的蔗糖密度形成條帶，并且通過用D32.10的間接EIA所獲得的陰性結(jié)果證實(shí)實(shí)質(zhì)上缺乏病毒包膜，但是含有HCV RNA(約2.105UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2到4pg/ml)。這些似乎是無包膜的病毒顆粒。另一個(gè)群(圖中級分8到10)在1.14-1.15g/ml的蔗糖密度形成條帶，并且實(shí)質(zhì)上缺乏HCV RNA(低于約104到105UI/ml)和HCV核心蛋白(約1pg/ml)，但是含有高水平的對D32.10反應(yīng)的顆粒(從約1到3.8OD450nm單位)。這些HCV亞病毒顆粒似乎僅含有HCV病毒包膜。第三群(級分11到14)在1.20-1.21g/ml的蔗糖密度形成條帶，含有具有高水平HCV RNA(高于約5.105到106UI/ml)和HCV核心蛋白(從約2.5到8pg/ml)以及對D32.10反應(yīng)(從約0.5到1.5OD450nm單位)的顆粒。因此，這群實(shí)質(zhì)上僅含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒。
通過D32.10免疫沉淀在富集HCV的沉淀(圖5A)，以及在第二群(圖5C)和第三群(圖5B)中含有的病毒顆粒，并通過電子顯微鏡觀察。通過這種方法已經(jīng)分析了幾種HCV病毒顆粒制劑。HCV有包膜的亞病毒顆粒表現(xiàn)為平均直徑約30nm(33.08nm)的球形顆粒(圖5C)，而HCV有包膜的完整病毒顆粒同樣表現(xiàn)為球形，但是平均直徑約50nm(48.72nm)(圖5B)。
實(shí)施例2bis血清來源的HCV病毒顆粒的表征和純化本發(fā)明人對感染患者血漿中存在的HCV病毒群還進(jìn)行了另一項(xiàng)分析。
血清來源的HCV顆粒的純化使用實(shí)施例1中所獲得的富集HCV的沉淀(HCV-L)用于物理化學(xué)、免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)研究，以及來自另一個(gè)患者的血漿取出法的沉淀(HCV-Fan，基因型1a/2a)，其顯示出患有慢性丙型肝炎(CH-C)，具有與嚴(yán)重的皮膚脈管炎相關(guān)的II型冷球蛋白血癥，需要定期血漿置換。如同對于HCV-L患者，后面的HCV-Fan患者顯示血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)水平異常升高，抗HCV抗體陽性，對所有HBV和HIV標(biāo)記陰性。
由此表征了7種制劑。它們在定量Amplicor HCV RNA Monitor試驗(yàn)(Roche)中對于從106UI/ml到2-3×107UI/ml的HCV RNA(HCV-Fan，HCV-L)陽性，對應(yīng)于2.5×106拷貝/ml到5-7.5×107拷貝/ml。
為了分離不同HCV群，將最終的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60％或者30到45％，w/w)中進(jìn)行等密度離心(在4℃，200,000g離心48小時(shí))。收集級分(0.6ml)，通過折光測定法測定每種級分的密度。通過定量RT-PCR(Amplicor Monitor，Roche)監(jiān)測HCV-RNA含量。如上所述，在固相上每種級分以不同稀釋度(1/10到1/10000)包被后，使用MAb D32.10通過間接EIA檢測HCV包膜(env)反應(yīng)性。通過使用定量Ortho試驗(yàn)和利用抗核心單克隆抗體混合物(7G12A8、2G9A7和19D9D6)的western印跡，測定HCV核心抗原(Jolivet-Reynaud等，1998；Menez等，2003)。
簡要地說，通過使用OrthoRtrak-CTM試驗(yàn)(Ortho-ClinicalDiagnostics，Inc)測量在富集HCV的沉淀和在從蔗糖梯度中收集的每種級分中的總HCV核心抗原。OrthoRtrak-CTM試驗(yàn)是一種定量免疫捕獲試驗(yàn)，使用對HCV核心抗原的不同區(qū)域具有特異性的幾種單克隆抗體。該方法使用預(yù)處理步驟以使得樣品制劑游離、免疫復(fù)合，以及使病毒體相關(guān)抗原可以測定(Aoyagi等，1999)。通過由RocheMolecular System(Meylan，F(xiàn)rance)開發(fā)的定量RT-PCR，AmplicorTMHCV MonitorTM，評價(jià)HCV RNA。擴(kuò)增步驟涉及單管、單酶(rTth DNA聚合酶)、單引物對組合的反轉(zhuǎn)錄和DNA聚合作用(Colucci和Gutekunst，1997)。通過比色微孔平板試驗(yàn)進(jìn)行檢測。PCR樣品遺留污染的控制包括AmpEraseTM，其已被摻入到試驗(yàn)中用以滅活污染的擴(kuò)增的DNA(Longo等，1990)。
首先將富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中進(jìn)行等密度離心。通過上述間接EIA方法(圖14A和14C)和使用抗E1E2 MAbD32.10(其特異性先前已在實(shí)施例1中詳細(xì)定義)的western印跡(圖14B和14D)調(diào)查是否存在顯示E1E2-D32.10反應(yīng)性的有包膜的病毒顆粒。如在圖14A和14C中所示，在EIA(級分稀釋1/10000)中E1E2-D32.10反應(yīng)性從級分9(密度為1.12g/ml)到級分16(密度為1.23g/ml)回收，峰在1.12和1.17g/ml之間，“肩”從1.18到1.23g/ml。在對應(yīng)低密度復(fù)合物(1.006到1.10g/ml)的級分中沒有檢測到或者檢測到非常低的D32.10反應(yīng)性(級分稀釋1/10)。用基因型1b的分離物HCV-L(圖14A)和用基因型1a/2a的分離物HCV-Fan(圖14C)獲得類似結(jié)果。將分離物HCV-L的一些級分(6、8、10、12、14)(圖14B)和分離物HCV-Fan的所有級分(4到18)進(jìn)行SDS-PAGE并用MAb D32.10進(jìn)行western印跡。從級分8(密度#1.10g/ml)到梯度的底部清楚地顯現(xiàn)E1E2-D32.10反應(yīng)性。值得注意的是，在與1.17到1.20g/ml的密度對應(yīng)的級分11、12和13中觀察到最強(qiáng)的E1E2反應(yīng)性(圖14D)。在這些級分中可檢測到更高分子量(HMW)條帶，可能對應(yīng)于在這種密度下形成條帶的病毒顆粒表面上存在的E1和E2包膜糖蛋白的寡聚形式。在級分9(密度為1.13g/ml)中觀察到針對E2和E1兩者的另一強(qiáng)反應(yīng)性，對應(yīng)于EIA中的峰(圖14C)。所有血清來源的HCV制劑在蔗糖密度梯度(10到60％)中給出相同的E1E2-D32.10反應(yīng)性平衡條帶分布圖。
為了進(jìn)一步表征有包膜的HCV群，將HCV-Fan沉淀在1型30到45％的蔗糖梯度(2ml 30％、3ml 35％、3ml 40％、2ml 45％)中進(jìn)行等密度離心。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，如在圖15A中所示，可清楚地見到兩個(gè)E1E2-D32.10反應(yīng)性峰。間接EIA顯示第一個(gè)窄峰(峰1)在約1.15g/ml密度處，第二個(gè)寬大峰(峰2)在約1.18g/ml到1.22g/ml密度處。將來自蔗糖梯度(30-45％)峰1(級分8)和2(級分12和13)的顆粒單獨(dú)地進(jìn)行第二次平衡離心。峰1在2型30到45％蔗糖梯度(3ml 30％、3ml 35％、2ml 40％、2ml 45％)中離心(圖15B)。僅有一個(gè)窄的E1E2抗原峰(峰1)遷移到1.13到1.14g/ml的密度(約32％蔗糖，級分5和6)。峰2在3型30到45％蔗糖梯度(2ml30％、2ml 35％、3ml 40％、3ml 45％)中離心(圖15C)。主峰(峰2)沉降更快，在約1.18g/ml密度處(對應(yīng)于40％蔗糖)顯示最大E 1E 2抗原性。后面的E1E2抗原峰(峰2)顯示不對稱，向較低密度移動(dòng)，并且與在1.14g/ml蔗糖密度形成條帶的E1E2群(峰1)輕微重疊，提示比前者E1E2抗原峰(峰1)更大的異質(zhì)性(圖15B、15C)。
為了闡明在兩群E1E2包被病毒顆粒(峰1和峰2)之間浮力密度的差異，通過Ortho HCV核心試驗(yàn)(圖9A)和通過Western印跡(圖15B)檢驗(yàn)上述1型30到45％蔗糖梯度級分的HCV核心抗原。
簡要而言，使用HCV樣品作為抗原探針(1-5g/ml)，通過免疫印跡測定多肽特異性。在還原條件下(2％SDS+5％2-ME)在12.5％凝膠上進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，使用在50％NHS中稀釋的抗E1E2 MAbD32.10(2到5g/ml)或抗-核心MAb 7G12A8、2G9A7和19D9D6(各5μg/ml)作為一抗，然后通過與作為二抗的偶聯(lián)HRPO的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀釋；購自Immunotech)孵育，檢測結(jié)合的IgG。印跡用Amersham的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL Plus)系統(tǒng)顯色。
兩種實(shí)驗(yàn)方法均顯示在大約1.17到1.19g/ml密度(40％蔗糖)的第二E1E2抗原峰(峰2)中回收最大HCV核心抗原反應(yīng)性。通過在Western印跡(圖9B)的分析，在最初的材料(HCV-Fan沉淀)和級分8到13中鑒定了25kDa的HCV核心蛋白。也檢測到在50、75和150kDa的條帶，其可能對應(yīng)于HCV核心基因編碼產(chǎn)物的寡聚體。通過定量RT-PCR Monitor試驗(yàn)(Roche)，在來自最初10到60％蔗糖梯度的所有級分中分析HCV RNA(圖10)。在1.055到1.075g/ml的密度以及在1.16到1.21g/ml的密度出現(xiàn)兩個(gè)病毒RNA峰。后面峰的總效價(jià)是106IU/ml，對應(yīng)于第二E1E2抗原峰(峰2)。相比之下，級分9(密度為1.13g/ml)，其對應(yīng)于峰1，含有最低效價(jià)的HCV RNA。因此，峰2(大約1.17到1.20g/ml)含有E1E2復(fù)合體、HCV核心蛋白、高效價(jià)HCV RNA并且可能代表完整病毒體。峰1(1.13到1.15g/ml)主要含有E1E2復(fù)合體，并且可能代表亞病毒顆粒(SVP)。低密度復(fù)合物(1.006到1.10g/ml)僅含有核心和HCV RNA，對應(yīng)于裸核殼。
因此，使用本發(fā)明的D32.10單克隆抗體，已經(jīng)分析了在慢性丙型肝炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)的最普遍類型的有包膜的病毒顆粒。通過濃縮的病毒材料在蔗糖梯度中的沉降，通過免疫測定和免疫印跡分析蛋白組成(核心和包膜蛋白)，結(jié)合通過定量RT-PCR監(jiān)測HCV RNA，分別鑒定了在1.13-1.15g/ml和1.17-1.21g/ml兩種不同密度沉降的兩群E1E2包被的顆粒。第一群對應(yīng)于含有E1和E2包膜蛋白，但是缺乏核殼的亞病毒顆粒(SVP)。第二群可能對應(yīng)于HCV病毒體，因?yàn)檫@些顆粒含有E1和E2包膜蛋白、核心蛋白和高效價(jià)的HCV RNA。
血清來源HCV顆粒的形態(tài)學(xué)表征根據(jù)下列方法進(jìn)行E1E2(D32.10)-特異性單克隆抗體的免疫沉淀后HCV-Fan沉淀的電子顯微鏡術(shù)(免疫電子顯微鏡術(shù)或IEM)。
簡要而言，將血清來源的HCV制劑(2、20或200μg)或來自梯度的級分(0.1ml)與0.1ml MAb D32.10(5μg)或同一同種型(IgG1)的無關(guān)單克隆抗體(F35.25，HBV抗-preSl)(Petit等，1989)混合。在37℃孵育1小時(shí)，然后在4℃孵育16小時(shí)。接著將混合物在10mlTNE緩沖液中稀釋并在48,000g離心1小時(shí)。將沉淀在0.1ml TNE緩沖液中重懸。將D32.10-免疫沉淀的HCV顆粒吸附5分鐘到glow-discharged Formvar/碳包被的cupron格柵上并用1％乙酸雙氧鈾(pH4.5)染色4分鐘。然后使用JEOL 100CX電子顯微鏡(Imagingfacility，Laennec Faculty，Lyon，F(xiàn)rance)觀察該制劑。對于間接免疫金標(biāo)記，用作為二抗的山羊抗小鼠I gG膠體金顆粒的1∶50稀釋液(直徑10nm；BioCell Research Laboratories)孵育格柵。
對照實(shí)驗(yàn)顯示制劑的大小不均勻隨著抗原抗體比而變化(結(jié)果沒有顯示)。為了保持形態(tài)完整，HCV顆粒的分離過程僅涉及沉淀和蔗糖梯度離心。在這種實(shí)驗(yàn)條件下，如在圖11A中所示，獲得相對較好限定的顆粒大小分布圖。不對稱的峰集中在約35nm。這種大小(30到40nm)的顆粒占大多數(shù)(56％)?；旧辖^大多數(shù)顆粒(80％)直徑大于30nm，平均值為38.28nm(156個(gè)顆粒中的125個(gè))，其中的20％在40到50nm之間(均值＝43.61nm)，4％在50和60nm之間(均值＝55.69nm)。所有顆粒中僅20％直徑小于30nm(均值＝26.35nm)。電子顯微鏡照片(圖11B)顯示HCV顆粒以相對規(guī)則的光滑表面為特征。圖11Ba和b組，例示了HCV有包膜的顆粒的大小不均勻性。圖11Bc組顯示直徑50nm的顆粒，d組顯示那些顆粒直徑35nm。在35nm的顆粒表面上出現(xiàn)相當(dāng)同質(zhì)的更高密度(圖11B，d組)，而在50nm直徑的顆粒中央可清楚地觀察到更低密度的更亮區(qū)(圖11B，c組)。當(dāng)使用無關(guān)的第一單克隆抗體時(shí)，通過IEM沒有觀察到顆粒(圖11B，e組)。對蔗糖梯度峰1和2的顆粒進(jìn)行免疫沉淀、染色以及通過IEM進(jìn)行分析(圖12A-12B)。如在圖12A中所示，峰1中的絕大多數(shù)(85.4％)是直徑約20nm的球形顆粒(41個(gè)顆粒中有35個(gè)，平均值＝20.6nm)。僅14.6％的顆粒直徑大于30nm，可能對應(yīng)于與峰2的重疊。峰2似乎比峰1材料大小更不均勻(圖12B)。然而，在這群中最普遍的形式(77.5％)的平均直徑約41nm(89個(gè)顆粒中有69個(gè)，均值＝41.15nm)，其可能對應(yīng)于整個(gè)HCV病毒體的直徑。在這種制劑中可見到一些較小的30nm直徑的顆粒(13.5％)，可能由于與峰1的重疊所致。異質(zhì)的主要的較快沉降峰(峰2)主要由35和50nm直徑的大顆粒組成，而同質(zhì)的次要的較慢沉降峰(峰1)主要由大約20nm直徑的小顆粒組成?？偟恼f來，形態(tài)學(xué)研究表明兩種大小類別的E1E2包被的HCV顆粒共同存在于感染患者的血清中。通過間接免疫金標(biāo)記(圖13)，所有球形有包膜的顆粒，先前通過IEM鑒定，都特異性固定10nm金標(biāo)記的二抗。
因此，通過用MAb D32.10的免疫-電子顯微鏡術(shù)，測定總的有包膜的群(富集HCV的沉淀)以及每種E1E2群各自的相對較好限定的顆粒大小分布。有包膜的HCV顆粒大小上不均勻，但是可容易地鑒定兩個(gè)不同大小類別的顆粒。多數(shù)種類由直徑從35nm到50nm變化的大顆粒構(gòu)成，可能視包膜的晶格結(jié)構(gòu)而定，對應(yīng)于完整的含有衣殼的有包膜顆粒。另一種更同質(zhì)的種類由直徑約20nm的小顆粒構(gòu)成，對應(yīng)于無衣殼的SVP。進(jìn)一步鑒定結(jié)合MAb D32.10的所有這些顆粒并使用用抗小鼠IgG-金顆粒的間接標(biāo)記，通過電子顯微鏡術(shù)觀察。
除了感染性的病毒體外還形成非感染性SVP是黃病毒感染的共同特征(Russel等，1980)。已提出這些代表無衣殼的空病毒包膜(Mason等，1991)。其也發(fā)生在感染乙型肝炎病毒(HBV)的細(xì)胞中，以及通過單獨(dú)表達(dá)包膜蛋白生產(chǎn)分泌的SVP(Laub等，1983)。這些顆粒小于病毒體。這證明這些蛋白在存在或缺乏核心時(shí)內(nèi)在地能夠自我形成特異性微粒結(jié)構(gòu)。這些顆粒裝配并經(jīng)歷與整個(gè)病毒體相同的成熟過程，包括糖基化和碳水化合物加工。用這種重組包膜SVP的免疫顯示它們在動(dòng)物模型中(Konishi等，1992；Heinz等，1995)和在人中(Leroux-Roels等，1994)是極好的保護(hù)性免疫原。
完整病毒體和SVP與MAb D32.10的反應(yīng)性顯示，E1(297-306)-E2(480-494)(613-621)構(gòu)象表位以基本上相同的方式呈現(xiàn)在HCV病毒體和SVP的表面上。然而，在通過基因重組獲得并在異種系統(tǒng)棒狀病毒/昆蟲細(xì)胞(Baumert等，1999)或反轉(zhuǎn)錄病毒/293T細(xì)胞(Bartosch等，2003)中生產(chǎn)的顆粒上缺乏在血清來源的病毒體和SVP上檢測到的這種表位，提示這種復(fù)合位點(diǎn)缺乏和/或存在于這些重組HCV顆粒表面上分開的難接近的區(qū)域上。前者HCV樣顆粒(HCV-LP)保留在ER中，后者HCV假顆粒(HCVpp)中僅有一小部分到達(dá)細(xì)胞表面。值得注意的是MAb D32.10既不與HSA也不與免疫球蛋白的γ或μ鏈反應(yīng)。其能夠特異性免疫沉淀E1、E2以及E1E2異二聚體，當(dāng)這兩種蛋白分別或者一起由痘苗病毒重組體在HepG2細(xì)胞中表達(dá)時(shí)。其因此主要與二硫鍵連接的聚集體反應(yīng)，與E1E2非共價(jià)連接的成熟復(fù)合物的反應(yīng)更微弱。然而，通過印跡分析，其不識別在這種異種系統(tǒng)中所表達(dá)的變性的重組E1或E2蛋白。這有利于在血清來源的病毒表面上E1、E2和E1E2的排列，其不同于在重組HCV顆粒中發(fā)現(xiàn)的排列。天然結(jié)構(gòu)依賴于裝配條件。如果在異種系統(tǒng)中缺乏調(diào)控獨(dú)特結(jié)構(gòu)形成的條件，那么當(dāng)兩者都分離自感染患者的血清時(shí)，與SVP和病毒體表面的相似形成對照，VLP和HCVpp中二聚體的排列不相似。在重組亞病毒顆粒(RSP)和病毒體中，黃病毒包括蜱傳腦炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)包裝的一個(gè)特別值得注意的特征是，它們以頭到尾的取向平躺在病毒表面上(Ferlengi等，2001)。結(jié)構(gòu)域III上的側(cè)表面，其具有Ig樣折疊并參與受體結(jié)合，容易接近，而融合肽是一種內(nèi)環(huán)(Rey等，1995)。因此，黃病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用和在內(nèi)體中低pH誘導(dǎo)的融合進(jìn)入細(xì)胞(Rice，1996)。據(jù)信正在裝配的顆粒通過經(jīng)由ER或早期分泌途徑的中間區(qū)室的膜出芽而獲得其包膜。顆粒然后通過高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(TGN)被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，成熟并因此獲得復(fù)合糖。所有這些步驟對于病毒裝配都是關(guān)鍵的，并且在復(fù)制循環(huán)的許多階段中都起著決定性的作用。
出乎意料地，所有HCV顆粒似乎都顯示相似的生物物理屬性，無論它們來源為何。在昆蟲細(xì)胞中裝配的、來自HCV-J株cDNA或來自感染性克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是1.14到1.20g/ml(Wellnitz等，2002)。大多數(shù)顆粒的直徑是40到60nm。然而，在HCV-LP外表面的E1和E2胞外域上存在的所有表位(Wellnitz等，2002)與MAb D32.10的E1和E2特異性不同。因此，即使顆粒在蔗糖中以同一密度沉降，它們也具有不同的免疫反應(yīng)性，其可能與不適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)和/或折疊有關(guān)，并且在細(xì)胞結(jié)合和感染性方面將明顯地導(dǎo)致不同的功能特性。
與血清有包膜的HCV顆粒相反，從感染HCV個(gè)體的血漿中分離的HCV核心顆粒似乎與在昆蟲細(xì)胞中所生產(chǎn)的核殼樣顆粒相似。HCV核殼在CsCl梯度中1.32到1.34g/ml的密度形成條帶，并且在大小上非常不均勻，直徑從38到62nm(Maillard等，2001)。所有這些顆粒都與抗核心MAb反應(yīng)，但是不與通過用重組蛋白免疫所產(chǎn)生的抗E1和抗E2 MAb反應(yīng)(Deleersnyder等，1997；Dubuisson等，1994)。
因此，不同類型的HCV相關(guān)顆粒(HCV-LP、血清HCV核殼、血清HCV病毒體)在大小和/或密度上具有一些相似之處，但是顯示不同抗原特性(E1E2復(fù)合體、有包膜的病毒體或無包膜核殼的不適當(dāng)?shù)幕蜻m當(dāng)?shù)恼郫B)。因此，總之這證明具有好的免疫學(xué)工具對于分析HCV顆粒的真實(shí)抗原性質(zhì)很重要，同樣地對于鑒定天然HCV病毒體也很重要。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)和其它人的那些數(shù)據(jù)(Andre等，2002；Maillard等，2001)，能獲得更多關(guān)于在慢性丙型肝炎患者血清中循環(huán)的不同形式HCV相關(guān)顆粒的完整譜知識。蔗糖梯度中的低密度級分(1.06g/ml)含有衣殼樣結(jié)構(gòu)，與脂蛋白結(jié)合形成脂-病毒-顆粒(LVP)，以及視個(gè)別變異而定與HCV RNA和免疫球蛋白結(jié)合(Andre等，2002)。LVP表現(xiàn)為直徑大于100nm的大顆粒，通過LDL受體結(jié)合肝細(xì)胞系(Andre等，2002)。從去污劑處理的血清中分離的無包膜的HCV核殼在CsCl中的浮力密度是1.32到1.34g/ml，大小上不均勻(Maillard等，2001)，最近表明其顯示FγR樣活性(Maillard等，2004)，這可解釋含有HCV RNA的顆粒與“非免疫”抗體結(jié)合作為在蔗糖梯度中高密度(1.28到1.35g/ml)的HCV核心-IgG復(fù)合物。中間密度的級分，在1.13到1.21g/ml之間，這里鑒定為E1E2包被的HCV顆粒。假定的整個(gè)HCV病毒體(由核殼、脂膜以及兩個(gè)E1和E2包膜糖蛋白構(gòu)成)的平均密度(1.18到1.20g/ml)，與黃病毒的平均密度相似(Bradley等，1991)。從MAb D32.10的精細(xì)特異性推出的側(cè)面包膜蛋白相互作用的假設(shè)也與來自TBEV的重組SVP和整個(gè)病毒顆粒的包膜的組織相似(Schalich等，1996)。最后，在感染HCV患者血清中存在僅含有E1E2包膜蛋白，顯示不同沉降性質(zhì)(1.13到1.15g/ml)以及不同顆粒大小(≈20nm)，但是與整個(gè)病毒顆粒具有相似抗原特征的SVP，這支持HCV和黃病毒之間的一些相似性。
總之，通過使用新的MAb D32.10，第一次鑒定了(i)HCV完整病毒體，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上表達(dá)E1E2包膜復(fù)合物，作為“大顆?！?，直徑35-50nm并在1.17-1.21g/ml形成條帶；(ii)包膜SVP的HCV群，作為“小顆粒”，缺乏衣殼和HCV RNA，直徑20-30nm并在1.13-1.15g/ml形成條帶。
這種有包膜的顆?？赡芤虼舜硌芯縃CV包膜糖蛋白結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的相關(guān)模型，并且是接種方法的極好候選物。另外，在不同組患者中以及在HCV相關(guān)疾病的不同階段進(jìn)一步追蹤循環(huán)HCV顆粒的譜將會(huì)是有趣的。
實(shí)施例3獲得針對純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的單克隆抗體將在蔗糖密度梯度中進(jìn)行等密度離心、含有純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的上面所提到的富集HCV沉淀的級分，用于制備單克隆抗體。將這種級分用于免疫小鼠并根據(jù)上述說明分離雜交瘤。由此獲得一種單克隆抗體，(D4.12.9)，其顯示出特異性識別天然HCV E2蛋白，在Western印跡實(shí)驗(yàn)中(圖6)，和天然HCV病毒顆粒，如在實(shí)施例2中證實(shí)的(圖7)。事實(shí)上，圖7顯示D4.12.9以與D32.10相似的方式識別HCV有包膜的亞病毒顆粒(級分8到11)和HCV有包膜的完整病毒顆粒(級分11到14)。
實(shí)施例4來自感染患者的抗HCV抗體的表位表征通過使用包括它們本身的肽，評價(jià)E1和E2衍生的與D32.10反應(yīng)的肽序列(實(shí)施例1)對感染HCV患者的血清的免疫反應(yīng)性。
生產(chǎn)E1(第290-317位氨基酸)和E2(第471-500位和第605-629位氨基酸)序列作為生物素化的合成肽，通過ELISA用11份健康個(gè)體的血清和44份感染HCV患者的血清(編為A1到A44)進(jìn)行檢驗(yàn)。
用100μl溶于0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)，濃度為10μg/ml的鏈霉抗生物素在4℃過夜包被微量滴定平板孔，并用含有10％山羊血清的PBS在37℃封閉1小時(shí)。然后在加入100μl生物素化肽溶液(在PBS中10μg/ml)在37℃孵育2小時(shí)前，用含有0.05％吐溫-20的PBS洗滌平板三次。用PBS-吐溫新沖洗后，加入100μl在含有10％山羊血清的PBS-吐溫中1∶50稀釋的檢驗(yàn)血清，并且在37℃孵育2小時(shí)。再次用PBS-吐溫沖洗平板。然后加入在PBS-吐溫-山羊血清中1∶5000稀釋的二抗-偶聯(lián)過氧化物酶的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)。平板在37℃孵育1小時(shí)，然后用PBS-吐溫再?zèng)_洗一次。使用含有鄰苯二胺和過氧化氫的Biomerieux顏色試劑盒使平板顯色。孵育10分鐘后，用ELISA讀板器在492nm讀取平板。報(bào)告值是一式三份的平均OD。
計(jì)算每種肽的截止識別(用HCV陰性血清獲得的均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差)。其允許證明44份HCV陽性血清中有6份產(chǎn)生抗E1(第290-317位氨基酸)(圖8A)、44份中有6份產(chǎn)生抗E2(第471-500位氨基酸)(圖8B)以及44份中有16份產(chǎn)生抗E2(第605-629位氨基酸)(圖8C)的陽性反應(yīng)。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40與這三種肽產(chǎn)生陽性信號，而E2(605-629)也被10份更多血清識別。
在感染HCV患者血清中存在能與由D32.10mAb識別的E1和E2的三個(gè)區(qū)域同時(shí)反應(yīng)的特異性抗體，強(qiáng)烈支持它們在循環(huán)的有包膜的HCV病毒顆粒表面的毗鄰以及它們在小鼠和在人中的免疫原性。
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序列表<110>INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALEBIOMERIEUX<120>針對丙型肝炎病毒的新抗體、易于被所述抗體識別的顆粒組合物及含有它們的藥物組合物<130>WOB 03 AG INS VHC1<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>1Arg His Trp Thr Thr Gln Gly Cys Asn Cys1 5 10<210>2<211>15<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>2Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys1 5 10 15<210>3<211>9<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>3Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr1 5<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ccctcatagt tagcgtaacg20<210>5<211>20<212>PRT<213>丙型肝炎病毒
<400>5Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Thr Gln Gly1 5 10 15Cys Asn Cys Ser20<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>6Ser Pro Leu Arg His Tyr Glu Leu Pro Leu Ile Gln1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>7Trp Pro His Asn His Ser Thr His Ser Arg Thr His1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>8Phe Pro Lys Tyr His Pro Arg Phe His Lys His Ala1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>9Ser Gln Arg Ser Arg His Trp His Asp Val Pro Lys1 5 10
<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>10Thr Ser Gln Pro Arg Trp His Gln Lys Pro Ala Thr1 5 10<210>11<211>21<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>11Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly1 5 10 15Ile Ala Tyr Phe Ser20<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>12Trp Lys Met Pro Arg Ala Thr Asp Trp Asn Leu Arg1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>13His Trp Gly Asn His Ser Lys Ser His Pro Gln Arg1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽
<400>14Trp His Arg Thr Pro Ser Thr Leu Trp Gly Val Ile1 5 10<210>15<211>21<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>15Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys ProCys Gly Ile1 5 10 15Val Pro Ala Lys Ser20<210>16<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>16Trp His Lys Leu Pro Gly His Pro Arg Thr Val1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>17Thr Phe Ala Trp His Lys Pro Arg Val Asn Leu Gly1 5 10<210>18<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>18His Ser Ser Trp Tyr Ile Gln His Phe Pro Pro Leu1 5 10<210>19
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>19Phe Pro Ala His Pro Leu Pro Arg Leu Pro Ser Leu1 5 10<210>20<211>22<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>20Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr1 5 10 15Ile Phe Lys Ile Arg Met20<210>21<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>21Trp His Trp Asn Lys Pro Ile Ile Arg Pro Pro Leu Arg1 5 10<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>22Gln Pro Tyr Lys Leu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Tyr1 5 10<210>23<211>14<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>23Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp1 5l0
<210>24<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>24His Leu Tyr His Lys Asn Arg Asn His His Ile Ala Tyr1 5 10<210>25<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體展示肽<400>25Trp Ser Pro Gly Gln Gln Arg Leu His Asn Ser Thr1 5 10<210>26<211>8<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>26Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys1 5<210>27<211>8<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>27Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys1 權(quán)利要求
1.能特異性結(jié)合天然HCV病毒包膜的構(gòu)象抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E2蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的構(gòu)象抗體，能夠中和患者的HCV感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的構(gòu)象抗體，能夠沉淀在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的HCV E1E2復(fù)合體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E1蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合天然HCV E1蛋白、結(jié)合天然HCV E2蛋白以及能夠沉淀在其共價(jià)或非共價(jià)形式下的HCV E1E2復(fù)合體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的至少一種構(gòu)成的表位-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO1)；-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO2)；-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的構(gòu)象抗體，能夠特異性結(jié)合由下列序列中的每一種構(gòu)成的表位-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO1)；-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO2)；-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任何一項(xiàng)的構(gòu)象抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項(xiàng)的單克隆抗體，由2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2983的雜交瘤分泌。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項(xiàng)的單克隆抗體，由2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2982的雜交瘤分泌。
12.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culturede Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2983的雜交瘤。
13.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culturede Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)保藏的登錄號為CNCM I-2982的雜交瘤。
14.藥物組合物，包含至少一種權(quán)利要求1到11的抗體作為活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體。
15.至少一種權(quán)利要求1到11的抗體用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物的用途。
16.能結(jié)合至少一種權(quán)利要求10或11的抗體的有包膜的病毒顆粒。
17.結(jié)合權(quán)利要求16的有包膜的病毒顆粒的抗體。
18.源自人血液、血漿或血清最初樣品的HCV病毒顆粒的組合物，其中HCV RNA拷貝的濃度比其來源的人血液、血漿或血清最初樣品中的HCV RNA拷貝濃度高約100到1000倍，特別是高于約107拷貝/ml。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中HCV RNA拷貝數(shù)是從每毫克蛋白約108到約109UI。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的組合物，其中所述組合物的體積是從約0.1ml到約10ml。
21.實(shí)質(zhì)上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的分離的HCV有包膜的亞病毒顆粒，其中所述亞病毒顆粒易于結(jié)合權(quán)利要求1到11的任何抗體。
23.組合物，其包含純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒，所述純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜，并且易于結(jié)合權(quán)利要求1到11的任何抗體。
24.制備HCV病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀以獲得HCV病毒顆粒的組合物。
25.HCV病毒顆粒的組合物，如根據(jù)權(quán)利要求24的方法獲得。
26.制備HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分離成級分；-回收實(shí)質(zhì)上不含HCV RNA、實(shí)質(zhì)上不含HCV核心蛋白以及含有能結(jié)合權(quán)利要求10或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約1.13到1.15g/ml的級分，以獲得HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物。
27.HCV有包膜的亞病毒顆粒的組合物，如根據(jù)權(quán)利要求26的方法獲得。
28.制備純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物的方法，包括下列步驟-對從HCV感染患者的澄清的血漿取出法得到的樣品進(jìn)行至少兩次超速離心，以獲得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重懸富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速離心重懸的富集HCV的沉淀以將重懸的富集HCV的沉淀的組成成份根據(jù)它們的密度分離成級分；-回收含有每毫升從約5.105到約106UI的HCV RNA、每毫升從約50到約100pg的HCV核心蛋白，以及含有能結(jié)合權(quán)利要求10或11的單克隆抗體的顆粒的級分，特別是蔗糖密度為大約1.17到1.21g/ml的級分，以獲得純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物。
29.純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，如根據(jù)權(quán)利要求28的方法獲得。
30.制備權(quán)利要求10的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用根據(jù)權(quán)利要求18的HCV病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)權(quán)利要求24制備的組合物免疫動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，并回收產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的HCV病毒顆粒的組合物中所包含的HCV病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
31.制備權(quán)利要求11的單克隆抗體的方法，包括下列步驟-用根據(jù)權(quán)利要求23的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物，或者如根據(jù)權(quán)利要求28制備的組合物免疫動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，并回收產(chǎn)生的抗體；-在所產(chǎn)生的抗體中，根據(jù)它們結(jié)合在上面所提到的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的組合物中所包含的純化的HCV有包膜的完整病毒顆粒的能力，選擇單克隆抗體。
32.藥物組合物，其包含權(quán)利要求21或22的亞病毒顆?；蛘邫?quán)利要求27的組合物作為活性物質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體。
33.權(quán)利要求21或22的HCV有包膜的亞病毒顆?；蛘邫?quán)利要求27的組合物的用途，用于誘導(dǎo)針對所述HCV有包膜的亞病毒顆?；蛘哚槍θ缭跈?quán)利要求22中所定義的HCV有包膜的完整病毒顆粒的免疫反應(yīng)。
34.權(quán)利要求21或22的HCV有包膜的亞病毒顆粒或者權(quán)利要求27的組合物的用途，用于制備診斷、預(yù)防或治療HCV感染的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對HCV的新構(gòu)象抗體以及更特別地涉及單克隆抗體。本發(fā)明還涉及易于被所述抗體識別的顆粒的組合物，以及涉及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明還涉及HCV有包膜的亞病毒顆?；蚣兓腍CV有包膜的完整病毒顆粒，以及制備它們的方法。
文檔編號C12N7/00GK1768078SQ200480008734
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者M-A·珀蒂, C·洛利夫雷-雷諾 申請人:國家健康醫(yī)學(xué)研究所, 拜奧默里克斯股份有限公司