抗丙型肝炎病毒的中和性全人單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗丙型肝炎病毒的中和性全人單克隆抗體。本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合具有天然構(gòu)象的丙型肝炎病毒的E2亞基，能夠阻止丙型肝炎病毒侵染易感細(xì)胞。利用本發(fā)明的抗體可變區(qū)基因或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)基因，可在利用原核和真核細(xì)胞的任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體。
【專利說(shuō)明】抗丙型肝炎病毒的中和性全人單克隆抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及抗丙型肝炎病毒的中 和性全人單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎（丙肝）由丙型肝炎病毒（HCV)引起，一般通過(guò)血液和體液傳播， 是導(dǎo)致各種肝臟疾病的重要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球約有1. 5億人 患有慢性丙肝，并面臨因肝功能喪失或者肝癌導(dǎo)致死亡的風(fēng)險(xiǎn)。每年有300-400萬(wàn)人新增 感染丙肝病毒，并有35萬(wàn)余人死于與丙肝相關(guān)的肝臟疾病。2009國(guó)際肝病峰會(huì)數(shù)據(jù)表明， 中國(guó)作為丙肝流行地區(qū)，目前約有4000萬(wàn)患者。急性HCV感染者轉(zhuǎn)變?yōu)槁员位颊叩母?率高達(dá)80%，呈現(xiàn)出明顯的慢性化趨勢(shì)。中國(guó)十年間HCV的發(fā)病人數(shù)增長(zhǎng)了 9倍。全世界都 迫切需要對(duì)于丙型病毒性肝炎的安全、有效、價(jià)格低廉的預(yù)防治療方法。
[0003] 丙型肝炎病毒（HCV)屬于黃病毒科（Flaviviridae)肝炎病毒屬。HCV病毒體呈 球形，直徑約60nm(在肝細(xì)胞中為36-40nm，在血液中為36-62nm)，內(nèi)部為單鏈正義RNA，在 核衣殼外包裹有含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。HCV基因組的單股正鏈RNA全長(zhǎng)約9. 6kb， 包含5' -端和3' -端非編碼區(qū)（non-translated region, UTR)及一個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，0RF)，編碼一個(gè)3000多個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，可翻譯剪切為11種病毒 蛋白。其中HCV RNA的N-端編碼Core(F)、El、E2和P7五個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，C-端編碼NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A和NS5B六個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（圖8)。其中，core蛋白是病毒核衣殼的最基本 組成部分，E1/E2是病毒表面高度糖基化的包膜蛋白，P7是介導(dǎo)病毒顆粒組裝和釋放的離 子通道蛋白，呢2、呢48、呢54、呢58參與病毒的復(fù)制過(guò)程，呢3-4八參與病毒多聚蛋白前體的 剪切工作。
[0004] 目前尚無(wú)疫苗可以有效防止HCV感染，針對(duì)慢性丙肝的標(biāo)準(zhǔn)療法是聚乙二醇干擾 素-α與利巴韋林的聯(lián)合治療，但基于所感染病毒基因型和其他因素，只有50-80%的患者 可以產(chǎn)生持續(xù)病毒性應(yīng)答，其他患者則無(wú)法用此療法控制病情的發(fā)展。2011年5月，F(xiàn)DA批 準(zhǔn)通過(guò)了兩種丙型肝炎新藥Victrelis (伯賽匹韋，boceprevir)和Incivek(telaprevir， 特拉匹韋）。這兩種藥物都屬于一類所謂的蛋白酶抑制劑，該抑制劑能夠阻止丙型肝炎病毒 復(fù)制。這兩種藥物的治療均可以有效降低患者HCV RNA載量，但同時(shí)也面臨著耐藥性、副作 用、價(jià)格昂貴等問(wèn)題，制約了其在臨床上的大規(guī)模使用。迫使人們尋求新的預(yù)防和治療丙型 病毒性肝炎的方法--抗體藥物。
[0005] 抗體藥物用于病毒感染性疾病的治療早有報(bào)道，抗血清用于治療SARS和重癥 H5N1丙型肝炎病毒感染者的案例已經(jīng)證明了抗體在治療病毒感染中發(fā)揮的重要作用。具 有中和活性的抗丙型肝炎病毒的全人單克隆抗體具有以下潛在優(yōu)勢(shì)：一方面它可以阻斷 病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合；另一方面通過(guò)補(bǔ)體和T細(xì)胞、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的作用，將被病 毒感染的細(xì)胞殺死。1986年，第一株治療器官移植出現(xiàn)的排斥反應(yīng)的鼠單抗--莫羅單 抗-⑶3(murmonab⑶3，hoclone 0KT3)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，但由于其在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生人 抗鼠抗體（HAMA)反應(yīng)，限制了應(yīng)用。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程抗體迅速 發(fā)展，嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體生產(chǎn)技術(shù)不斷發(fā)展，將HAMA反應(yīng)降至最低乃至消 除。2009年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的14個(gè)藥物中有4個(gè)為全人抗體，這標(biāo)志著全人單克隆抗體時(shí) 代的來(lái)臨，全人抗體成為抗體藥物未來(lái)的發(fā)展方向。
[0006] 丙型肝炎病毒包膜蛋白中的E2蛋白，在病毒入侵細(xì)胞過(guò)程中扮演非常重要的角 色，是主要的細(xì)胞表面受體結(jié)合區(qū)域，也是免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。E2蛋白的N-端包含兩個(gè) 高可變區(qū)（HVR)，分別是HVR1和HVR2,這兩個(gè)區(qū)域處于蛋白表面，研究表明丙肝的慢性感染 和病毒逃逸與這兩個(gè)區(qū)域密切相關(guān)。目前，得到廣泛認(rèn)可的廣譜中和性抗原表位是AR3表 位，其包含三個(gè)不連續(xù)氨基酸區(qū)段（396-424,436-447和523-540位氨基酸）。
[0007] 綜上，針對(duì)丙型肝炎病毒E2蛋白而開(kāi)發(fā)的全人單克隆抗體，未來(lái)在HCV的預(yù)防及 治療中必將產(chǎn)生重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供抗丙型肝炎病毒的中和性全人單克隆抗體。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含SEQID N0:8 所示重鏈CDR1區(qū)、SEQ ID N0:9所示重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示重鏈CDR3區(qū)。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含SEQID N0:14 所示輕鏈CDR1區(qū)、SEQ ID NO: 15所示輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈CDR3區(qū)。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含以下的氨基 酸序列：SEQIDN0:8所示的重鏈CDR1，SEQIDN0:9所示的重鏈CDR2和SEQIDN0:10所 示的重鏈CDR3, SEQ ID N0:14所示的輕鏈CDR1，SEQ ID N0:15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID 勵(lì):16所示的輕鏈0?3。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子是Fab、F(ab'）、F(ab'）2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決 定區(qū)（CDR)片段、單鏈抗體（scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈 抗體、四鏈抗體；
[0016] 優(yōu)選的，所述的結(jié)合分子是人單克隆抗體；
[0017] 更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQID N0:2 和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)選擇下組中重鏈類型之一的恒定區(qū)： IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3,和其輕鏈恒定區(qū)選擇下組輕鏈類型的恒定區(qū)之一 ：κ鏈和λ 鏈；
[0018] 更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQID Ν0:2 和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)分別具有Genebank號(hào) ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，前面任一所述的結(jié)合分子能識(shí)別并結(jié)合丙型肝炎病毒的包膜蛋 白（E2蛋白）中的表位。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的結(jié)合分子的核酸分子。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的結(jié)合分子在制備用于檢測(cè)、治療和/或預(yù)防丙 型肝炎病毒感染的藥物中的用途。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中含有編碼所述的結(jié)合 分子的DNA。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中含有所述的表達(dá)載體。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，它含有所述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可 接受的載體。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑盒，其包括所述的結(jié)合 分子。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：抗原或抗體包被用試劑，洗滌試劑，第二 抗體，標(biāo)記物（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲 酶、過(guò)氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶），顯色劑酶底物等。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種（優(yōu)選非治療性地）抑制丙型肝炎病毒的方法，所 述的方法包括給予患者有效量的所述的結(jié)合分子。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種（優(yōu)選非診斷性地）檢測(cè)丙型肝炎病毒的方法， 利用所述的結(jié)合分子與待測(cè)樣品進(jìn)行接觸，通過(guò)檢測(cè)所述的結(jié)合分子與受試樣品的結(jié)合情 況，獲得丙型肝炎病毒的存在情況以及存在量。
[0029] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1、FACS流式細(xì)胞儀分選特異性Β細(xì)胞的分選圖。
[0031] 圖2、β -actin內(nèi)參的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0032] 圖3、重鏈基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0033] 圖4、輕鏈基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0034] 圖5、若干種全人單克隆抗體（包括7F2)濃度測(cè)定。
[0035] 圖6、若干種全人單克隆抗體（包括7F2)抗原抗體特異性檢測(cè)。
[0036] 圖7、全人單克隆抗體（7F2)對(duì)于HCV假病毒的中和活性檢測(cè)。以抗狂犬病毒G蛋 白的中和性全人單抗2E1 (參見(jiàn)201210122784. 6)作為陰性對(duì)照。
[0037] 圖8、丙型肝炎病毒（HCV)RNA所編碼蛋白示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，獲得一種含有獨(dú)特的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R區(qū)）的抗 丙型肝炎病毒廣譜中和性的結(jié)合分子，優(yōu)選全人單克隆抗體，該結(jié)合分子對(duì)于丙型肝炎病 毒具有顯著的中和作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0039] 結(jié)合分子
[0040] 本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是 人結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)對(duì)于丙型肝炎病毒的中和活性。
[0041] 本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述結(jié)合分子可以是抗原結(jié)合 片段，包括但不限于？ &13、？(&13'）、？(&13'）2、？1(^13、？(1、互補(bǔ)決定區(qū)（0)1〇片段、單鏈抗體 (scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含 有足以賦予與丙型肝炎病毒毒株的特異性抗原結(jié)合免疫球蛋白的片段的（多）肽或其片 段。
[0042] 本發(fā)明的結(jié)合分子也可以特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的一或多個(gè)片段。對(duì)于治療和 /或預(yù)防丙型肝炎病毒的方法而言，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的表面 可及蛋白質(zhì)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的E2分 子。
[0043] 本發(fā)明還提供了所述的結(jié)合分子在制備診斷、預(yù)防和/或治療丙型肝炎病毒感染 的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了可以中和導(dǎo)致丙型肝炎的丙型肝炎病毒感染的結(jié)合分子。
[0044] CDR區(qū)是免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，結(jié)合分子可包含 本文揭示的二、三、四、五或者所有六個(gè)CDR區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子包含本文揭示的 至少兩個(gè)⑶R。
[0045] 本發(fā)明的另一方面包括本文所述結(jié)合分子的功能變體。如果變體能與親代結(jié)合分 子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合丙型肝炎病毒或其蛋白片段，則認(rèn)為該變體分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功 能變體。換句話說(shuō)，所述功能變體仍能結(jié)合丙型肝炎病毒E2蛋白或其片段。功能變體包括 但不限于一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似、但是含有例如在親代結(jié)合分子中未發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化 學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的 共價(jià)附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧 化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說(shuō)，親代結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸 序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所 述結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。
[0046] 所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這 些修飾可以通過(guò)本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定向誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且 可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
[0047] 保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基 酸殘基置換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族己經(jīng)在本領(lǐng)域中限定。這些家族包 括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈氨基酸（例如天冬氨 酸、谷氨酸）、無(wú)電荷極性側(cè)鏈氨基酸（例如天冬酞胺、谷氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半膚氨酸、色氨酸）、非極性側(cè)鏈氨基酸（例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、分支側(cè)鏈氨基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）以及芳香 側(cè)鏈氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白也可以使用除了上述 家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨 基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸 缺失或者插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序可以發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基 可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。
[0048] 此外，功能變體可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短 體。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結(jié)合親和 性，但是仍能結(jié)合丙型肝炎病毒或其片段。優(yōu)選地，可變區(qū)包括但不限于構(gòu)架區(qū)、高變區(qū)或 ⑶R區(qū)的氨基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，包括三個(gè)⑶R，以及 更保守的區(qū)域，即所謂的構(gòu)架區(qū)（(FR)。高變區(qū)包含來(lái)自CDR的氨基酸殘基和來(lái)自高變環(huán)的 氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代結(jié)合分子具有至少大約50%至大 約99%、優(yōu)選至少大約60%至大約99%、更優(yōu)選至少大約70%至大約99%、甚至更優(yōu)選至少大 約80%至大約99%、最優(yōu)選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，以及 特別是至少大約97%至大約99%的氨基酸序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法 如Gap或者Bestf it可用于最佳地排列氨基酸序列以進(jìn)行對(duì)比以及明確相似或相同的氨基 酸殘基。功能變體可以通過(guò)使用本領(lǐng)域己知的普通分子生物學(xué)方法改變親代結(jié)合分子或其 一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯(cuò)PCR、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、定點(diǎn)誘變以及重鏈 和/或輕鏈改組法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的功能變體對(duì)于丙型肝炎病毒具有中和活 性。所述中和活性與親代結(jié)合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)（人） 結(jié)合分子時(shí)，其也涵蓋所述（人）結(jié)合分子的功能變體。
[0049] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的結(jié)合分子是單克隆抗體，優(yōu)選它包括人源的恒定 區(qū)（如人源恒定區(qū)IgH序列和IgKappa序列）。所述的抗丙型肝炎病毒單克隆抗體的重鏈 可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)均具有獨(dú)特的 不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)，且它們是全人源的。
[0050] 本發(fā)明包括：具有所述單克隆抗體的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體，具有所述單 克隆抗體可變區(qū)鏈的單克隆抗體。本發(fā)明還包括具有含所述的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的輕鏈和 重鏈的任何抗體，以及⑶R區(qū)與本發(fā)明的單克隆抗體的⑶R具有90%以上（較佳地95%以 上）的同源性的任何抗體。
[0051] 抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來(lái)描述，稱為 互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，CDR)，所述的CDR區(qū)將可變區(qū)間隔成 4個(gè)框架區(qū)域（FR)，4個(gè)FR的氨基酸序列相對(duì)比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形 成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應(yīng)輕 鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。可以通過(guò)比較同類型的抗體的氨基酸序列來(lái)確定 是哪些氨基酸構(gòu)成了 FR或⑶R區(qū)域。
[0052] 對(duì)于本發(fā)明的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。
[0053] 經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明的抗丙型肝炎病毒單克隆抗體的⑶R區(qū)是全新的，其針對(duì)的是一 個(gè)獨(dú)特的丙型肝炎病毒Ε2蛋白上的抗原表位，技術(shù)構(gòu)思不同于現(xiàn)有的抗丙型肝炎病毒抗 體。
[0054] 本發(fā)明的單克隆抗體是全人源的，其重鏈、輕鏈可變區(qū)以及恒定區(qū)均來(lái)源于人抗 體。因此，其在具有特別優(yōu)異的識(shí)別和中和丙型肝炎病毒的作用的同時(shí)，還具有免疫原性 低、安全性高的特點(diǎn)。
[0055] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，從近年感染丙型肝炎病毒的志愿者體內(nèi)獲得外周血單個(gè)核 細(xì)胞（PBMC)，使用⑶19 +/IgG+/HCV-E2為特異性標(biāo)志物，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選（FACS)獲得識(shí) 別丙型肝炎病毒E2蛋白的特異性B細(xì)胞。使用文獻(xiàn)已報(bào)道的單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)（Journal of Immunological Methods329 (2008) 112 - 124)，獲得了抗體基因，并在 293T 細(xì)胞中進(jìn)行 表達(dá)獲得全人單克隆抗體7F2。假病毒（HCV-ElE2pp)中和試驗(yàn)表明，7F2抗體對(duì)于HCV假 病毒具有超過(guò)60%的抑制率。由此可見(jiàn)，7F2抗體具有較強(qiáng)的親和力和中和活性，具有臨床 上預(yù)防和治療丙型肝炎病毒感染的可能。
[0056] 另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個(gè)結(jié)合分子以及進(jìn)一 步包含至少一個(gè)標(biāo)記如可檢測(cè)的部分/物質(zhì)的分子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明免疫綴合物的混 合物或者至少一種本發(fā)明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另 一結(jié)合分子或免疫綴合物。本發(fā)明的免疫綴合物可包含一個(gè)以上的標(biāo)記。這些標(biāo)記可以彼 此相同或不同，并且可以與結(jié)合分子非共價(jià)地結(jié)合/綴合。所述標(biāo)記也可以通過(guò)共價(jià)鍵與 人結(jié)合分子直接結(jié)合/綴合。或者，所述標(biāo)記可以通過(guò)一或多種連接化合物與所述結(jié)合分 子結(jié)合/綴合。標(biāo)記與結(jié)合分子的綴合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0057] 本發(fā)明的免疫綴合物的標(biāo)記可以是治療劑，但是它們也可以是可檢測(cè)的部分/物 質(zhì)。適于治療和/或預(yù)防的標(biāo)記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強(qiáng)吞噬作用或 者免疫刺激作用的其它結(jié)合分子。包含可檢測(cè)物質(zhì)的免疫綴合物可診斷性地用于例如評(píng)定 對(duì)象是否己經(jīng)感染丙型肝炎病毒毒株或者作為臨床實(shí)驗(yàn)程序的一部分監(jiān)測(cè)丙型肝炎病毒 感染的發(fā)生或進(jìn)展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用于其它檢測(cè)和/ 或分析和/或診斷目的?？蓹z測(cè)的部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料， 生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測(cè)和/ 或分析和/或診斷目的用于標(biāo)記結(jié)合分子的標(biāo)記依賴于使用的特定檢測(cè)/分析/診斷技術(shù) 和/或方法例如免疫組織化學(xué)染色（組織）樣品、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢 測(cè)、熒光免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)、放射免疫測(cè)定（RIA)、生物測(cè)定（例如吞噬 作用測(cè)定）、蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用等。對(duì)于本領(lǐng)域已知的檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法合適 的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0058] 此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物上，其特別 用于丙型肝炎病毒E2蛋白或其片段的體外免疫測(cè)定或者純化。這種固體支持物可以是多 孔或者無(wú)孔的、平面或非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以與標(biāo)記序列融合以便于純化。所 述標(biāo)記序列的例子包括但不限于六組氨酸標(biāo)記、myc標(biāo)記或者flag標(biāo)記?；蛘?，一種抗體 可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物（heteroconjugate)。
[0059] 另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與一或多個(gè)抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原 是由給予了結(jié)合分子-抗原綴合物的對(duì)象的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。所述抗原可以彼此相 同，但也可以是不同的。使附著抗原和結(jié)合分子的綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于 使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合丙型肝炎病毒并且附著于結(jié)合分子的抗原將引發(fā)對(duì)于 所述綴合物的有力T細(xì)胞攻擊，最終導(dǎo)致丙型肝炎病毒的破壞。
[0060] 除了通過(guò)直接或間接（例如通過(guò)接頭）綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物之外，所述免 疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的結(jié)合分子及合適的標(biāo)記。 融合蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，例如通過(guò)構(gòu)建核酸分子以及隨后表達(dá)所述核酸分 子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結(jié)合分子的核苷酸序列以及編碼合適標(biāo) 記的核苷酸序列。
[0061] 本發(fā)明另一方面提供了編碼本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、其功能變體或者免疫綴 合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進(jìn)行克隆，例如用于如上述的親和力成 熟方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。DNA分子的序列可以 用常規(guī)技術(shù)，或利用雜交瘤技術(shù)獲得。
[0062] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變 體是這樣的核酸序列，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子 中翻譯的序列相同的氨基酸序列。
[0063] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 [0064] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0065]目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明的結(jié)合分子（或其片段，或 其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子 (或如載體）和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的結(jié)合分子的序列中。 [0066] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體是例 如含病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體，且在所述表達(dá)載體中分別插入了抗丙型肝炎病毒單克隆 抗體重鏈可變區(qū)（VH)與恒定區(qū)的IgH(來(lái)自人源IgH的恒定區(qū)）融合序列和輕鏈可變區(qū)VL 與人體Igkappa (來(lái)自人源Igkappa的恒定區(qū)）融合序列。
[0067] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙 門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CH0、C0S7、NS0 或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。特別適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物 細(xì)胞，如293細(xì)胞。
[0068] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，或常規(guī)機(jī)械 方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0069] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子。根據(jù)所用的宿主細(xì) 胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)選擇 的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0070] 本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選的是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常需要在 含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清的適應(yīng)過(guò)程后，方可讓細(xì)胞在無(wú)血清 培養(yǎng)基中正常的生長(zhǎng)。
[0071] 如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重 組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī) 的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層 析（凝膠過(guò)濾）、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù) 及這些方法的結(jié)合。
[0072] 本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物如兔、山羊或者牛中產(chǎn)生，并且 分泌進(jìn)例如其乳中。
[0073] 藥物組合物
[0074] 本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備抑制丙型肝炎病毒的組合物。
[0075] 基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種可抑制丙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染疾 病的組合物，其包含：有效量的本發(fā)明所述的結(jié)合分子；以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0076] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或 人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過(guò)敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體" 應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的結(jié)合分子相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低組合物的效 果。
[0077] 可作為藥學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡 萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基 纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸 鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二 醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween?;潤(rùn)濕劑，如月桂基 硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無(wú)熱原水；等滲鹽溶液；和磷 酸鹽緩沖液等。
[0078] 本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重 和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采 用注射或其它治療方式。
[0079] 本發(fā)明的結(jié)合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分 子可以單獨(dú)應(yīng)用或者于包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子（或其變體或片段）的混合物中應(yīng) 用。換句話說(shuō)，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用，例如作為包含兩或更多種本發(fā)明的結(jié)合分子、 其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的結(jié)合分子可以組合在一個(gè)治療 方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結(jié)合分子 組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進(jìn)一步包 含至少一種其它治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑如利巴韋林，可用于預(yù)防和/或治療丙型肝炎 病毒感染。
[0080] 所述藥物組合物可包含兩或多個(gè)對(duì)于丙型肝炎病毒具有中和活性的結(jié)合分子。在 一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，所述結(jié)合分子呈現(xiàn)協(xié)同中和活性。換句話說(shuō)，所述組合物 包含至少兩種具有中和活性的結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子在中和丙型肝炎病毒中起 協(xié)同作用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"協(xié)同"是指當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，結(jié)合分子的組合作用高于單獨(dú)應(yīng) 用時(shí)的加合作用。所述協(xié)同作用的結(jié)合分子可以結(jié)合丙型肝炎病毒的相同或不同片段上的 不同結(jié)構(gòu)。計(jì)算協(xié)同作用的方式是通過(guò)組合指數(shù)計(jì)算。組合指數(shù)（CI)的概念己經(jīng)由Chou and Talalay(1984)描述。
[0081] 本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合在用于人體之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中檢 測(cè)。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于小鼠、雪貂（ferret)和猴。感病毒丙型肝炎病毒中也 可以協(xié)同作用。
[0082] 可以調(diào)整給藥方案以提供最佳的所需應(yīng)答（例如治療應(yīng)答）。合適的劑量范圍可 例如是〇. 〇l-l〇〇mg/kg體重，優(yōu)選0. l-15mg/kg體重。此外，例如可以給予一次推注、隨時(shí) 間給予多次分開(kāi)劑量或者根據(jù)治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發(fā)明的 分子和組合物優(yōu)選是無(wú)菌的。使得這些分子和組合物無(wú)菌的方法為本領(lǐng)域所熟知。用于診 斷、預(yù)防和/或治療的其它分子可以以與本發(fā)明的結(jié)合分子相似的給藥方案給予。如果單 獨(dú)給予其它分子，則可以在給予本發(fā)明的一或多種人結(jié)合分子或藥物組合物之前、同時(shí)或 者之后給予患者。對(duì)于人患者的精確給藥方案通常在臨床實(shí)驗(yàn)期間挑選出。
[0083] 檢測(cè)試劑和試劑盒
[0084] 本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑或試劑盒。
[0085] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"待測(cè)樣品"涵蓋了多種樣品類型，包括生物學(xué)來(lái)源的血液及其 它體液樣品，實(shí)體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養(yǎng)物，或者衍生自其中的細(xì)胞或者 其后代。該術(shù)語(yǔ)還包括在獲得后已經(jīng)通過(guò)任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或 者富集某些成分如蛋白質(zhì)或者多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也 包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清和細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
[0086] 以所述的結(jié)合分子為基礎(chǔ)，可制備方便、快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑 盒。
[0087] 因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在丙型肝炎病毒的檢測(cè)試劑盒， 該試劑盒中含有本發(fā)明的抗丙型肝炎病毒的結(jié)合分子。
[0088] 在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子后，可以方便地制備出用于特異性檢測(cè)丙型肝炎 病毒的檢測(cè)試劑盒。
[0089] 作為本發(fā)明的一種檢測(cè)方式，采用間接ELISA法，將待測(cè)的抗原包被于固相載體 上，利用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行檢測(cè)。
[0090] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的結(jié)合分子是抗體，可根據(jù)雙抗夾心法的原理 來(lái)檢測(cè)。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將一抗（如本發(fā)明的單克隆抗體）固定于載體，然后使 一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與二抗反應(yīng)（所述的二抗攜帶可檢測(cè)信號(hào)，或可與攜帶可檢測(cè) 信號(hào)的物質(zhì)結(jié)合），最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。雙抗夾心法特別適用于具 有兩個(gè)或兩個(gè)以上表位的抗原的檢測(cè)。
[0091] 為了在檢測(cè)時(shí)更方便，所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的結(jié)合分子以外，還可以包 含其它檢測(cè)試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試 齊U，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如顯色劑、標(biāo)記 物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，各種變化形式的檢測(cè)試劑盒均是包含在本 發(fā)明中的，只要在其中利用了本發(fā)明的結(jié)合分子作為識(shí)別丙型肝炎病毒的試劑。
[0092] 此外，在所述試劑盒中還可包含使用說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明其中裝載的試劑的使用方 法。
[0093] 在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子和/或試劑盒后，可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法 來(lái)檢測(cè)樣品中E2蛋白或其含量，從而得知待測(cè)樣品的供體是否感染丙型肝炎病毒，這些方 法均被包含在本發(fā)明中。較佳地，所述的方法是以非疾病診斷為目的的。
[0094] 作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種體外（非診斷或治療性地）檢測(cè)丙型肝炎病 毒的方法，包括以下步驟：
[0095] (al)將待測(cè)樣品包被于固相載體；
[0096] (a2)將本發(fā)明的結(jié)合分子加樣于（al)的固相載體，從而使待測(cè)樣品中的丙型肝 炎病毒與結(jié)合分子結(jié)合，形成帶有"丙型肝炎病毒-本發(fā)明的結(jié)合分子"二元復(fù)合物的固相 載體；
[0097] (a3)將特異性結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子的檢測(cè)物加樣于（a2)的固相載體，形成帶 有"丙型肝炎病毒-本發(fā)明的結(jié)合分子-檢測(cè)物"三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測(cè)物上 攜帶一標(biāo)記物；
[0098] (a4)檢測(cè)三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒的存在與否以 或存在的量。
[0099] 按照上述方法，只要設(shè)置已知濃度的抗原對(duì)照，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)比照濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出待測(cè)樣品中的丙型肝炎病毒含量。
[0100] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0101] (1)提供了一種具有全新的結(jié)合分子，其是全人源的，與其它動(dòng)物源性（如鼠源 性）抗丙型肝炎病毒的分子相比，免疫原性大大減少，且親和性良好。不僅治療效果好，而 且副作用低。
[0102] (2)本發(fā)明的結(jié)合分子能夠結(jié)合具有天然構(gòu)象的丙型肝炎病毒E2亞基，阻止丙型 肝炎病毒侵染易感細(xì)胞。
[0103] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0104] I.材料和方法
[0105] 以下說(shuō)明本發(fā)明即一株能夠中和丙型肝炎病毒的全人單克隆抗體制備過(guò)程以及 抗體特性分析過(guò)程。分為兩部分：
[0106] (1)單細(xì)胞RT-PCR法獲得抗體基因以及抗體表達(dá)制備；
[0107] (2)抗體特性分析。
[0108] 具體過(guò)程如下：
[0109] 1、外周血單核細(xì)胞（PBMC)的獲得
[0110] 從已感染丙型肝炎病毒的志愿者體內(nèi)抽取外周血，采用常規(guī)Ficoll-Paque (廠家 為L(zhǎng)ympholyte?-H (CEDARLANE)公司）密度梯度離心，得到107以上個(gè)外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。
[0111] Ficoll 分離方法：
[0112] 1)收集血液，于50ml離心管（預(yù)含4%檸檬酸鈉1ml)，收集全血10ml，顛倒混勻 8-10次。（即使檸檬酸鈉終濃度為0. 4%);
[0113] 2)加等體積RPMI1640 (含檸檬酸鈉），混勻；
[0114] 3)用15ml透明離心管，鋪3ml淋巴細(xì)胞分離液，在其上小心加6ml血樣。形成分 離界面（或4ml分離液加8ml血樣）；
[0115] 4)室溫離心 800g，20min (2000rpm，20min);
[0116] 5)小心吸取界面層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新管；
[0117] 6)加 RPMI1640(含檸檬酸鈉），稀釋減小液體密度。離心，800g/2000rpm，lOmin。 去上清；
[0118] 7) RPMI1640 洗細(xì)胞 2-3 次，備用。
[0119] 2、E2蛋白特異性記憶B細(xì)胞分選
[0120] 使用FITC-⑶19/APC-IgG/Cy3-HCV-E2為標(biāo)志物，經(jīng)流式細(xì)胞儀獲得特異性B細(xì)胞 至96孔R(shí)T-PCR板，每孔一個(gè)細(xì)胞，獲得E2蛋白特異性記憶B細(xì)胞。
[0121] 1)丙型肝炎病毒包膜蛋白E2(HCV_E2)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞CH0表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)；參考 FreeStyle? MAX CHO Expression System 手冊(cè)；
[0122] 2)E2 蛋白進(jìn)行生物素（Biotin)標(biāo)記：No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin(購(gòu)自 PIERCE，參考PIERCE 公司 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 生物素標(biāo)記Protocol) 10mM試劑； 另兩個(gè)標(biāo)志物FITC-CD19和APC-IgG均購(gòu)自BD Bioscience公司；
[0123] 3)分選細(xì)胞的標(biāo)記：PBMC細(xì)胞分組，實(shí)驗(yàn)組+對(duì)照組，按細(xì)胞數(shù)加入標(biāo)志物，避光 染色，進(jìn)行標(biāo)記，用PBS重懸后，使用40 μ m BD falcon濾膜過(guò)濾；
[0124] 4)特異性B細(xì)胞的分選：使用BD FACS ARIA II篩選，根據(jù)前向角和側(cè)向角從PBMC 中篩選到淋巴細(xì)胞，然后通過(guò)不同對(duì)照組的調(diào)節(jié)補(bǔ)償，獲得丙肝E2蛋白的特異性記憶B細(xì) 胞，將其分選到96孔板中進(jìn)行RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)，每孔一個(gè)細(xì)胞，板置于干冰上。
[0125] 3、抗體基因
[0126] 根據(jù)文獻(xiàn) Journal of Immunological Methods329 (2008) 112-124 中報(bào)道的方法， 獲得抗體基因。
[0127] 獲得的抗體基因連接pGEMT載體（購(gòu)自Invitrogen公司），進(jìn)行測(cè)序（華大基因 測(cè)序公司），常規(guī)方法驗(yàn)證抗體基因。然后將重、輕鏈基因分別連接表達(dá)載體AbVec-hlgG和 AbVec-hlgKappa(Kenneth Smith et al. Rapid generation of fullyhuman monoclonal antibodies specific to a vaccinating antige. Nat Protoc. 2009;4(3):372-384)〇
[0128] 4、抗體表達(dá)
[0129] 將前述插入了重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn) 行全人抗體表達(dá)（參考Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)化手冊(cè)）。
[0130] (1)在轉(zhuǎn)染前一天將1. ox 1〇6細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；
[0131] (2)A 管：500μ 1 0pti-MEM+4y g IgG+4y g IgL ;
[0132] (3)B 管：500 μ 1 Opti-MEM+20μ 1 Lipofectamine Reagent ;
[0133] (4)靜置5分鐘后，將A管與B管混合，在室溫靜置20min ;
[0134] (5)A、B管混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)盤中，37°C孵育6h ;
[0135] (6) 6h后，吸除含有Lipofectamine Reagent DNA的培養(yǎng)液，每孔加入 2mlFreeStyle?293Expression Medium ；
[0136] (7)72h 后，收集細(xì)胞上清，4°C，3000rpm，5min。
[0137] 5、抗體濃度測(cè)定
[0138] ELISA方法測(cè)定全人抗體濃度。
[0139] 1)包被 Goat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody 于 ELISA板，10 μ g/ml，每 孔 100μ 1，4°C 過(guò)夜；
[0140] 2)PBST 洗板，3 次；
[0141] 3)封閉：1%BSA，每孔 200μ l，37°C，2h ;
[0142] 4)PBST 洗板，3 次；
[0143] 5)使用倍比稀釋的人IgG(購(gòu)自Sigma)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度400ng/ml、200ng/ml、 100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12. 5ng/ml、6. 25ng/ml、0ng/ml，100 μ 1/ 孔；全人抗體細(xì)胞上 清稀釋 5000 倍，每孔 100μ l，37°C，2h ;
[0144] 6)PBST 洗板，3 次；
[0145] 7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific)-Peroxidase 抗體，1:10000 稀釋，每孔 100 μ l,37〇C, lh ；
[0146] 8)PBST 洗板，3 次；
[0147] 9)底物 A 液：B 液=1:1，每孔 100μ l，37°C，15min，避光反應(yīng)；
[0148] 10)加入 2M H2S04,每孔 50 μ 1 ;
[0149] 11)測(cè)定0D450,并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
[0150] 6、抗原特異性檢測(cè)
[0151] 檢測(cè)表達(dá)的全人抗體是否識(shí)別HCV-E2 (由哺乳動(dòng)物細(xì)胞CH0表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)；參考 FreeStyle? MAX CH0 Expression System手冊(cè)），以及與抗原的結(jié)合能力。
[0152] (1)包被HCV-E2于ELISA板（購(gòu)自NUNC公司），10 μ g/ml，每個(gè)樣品兩個(gè)復(fù)孔，每 孔 100μ 1，4°C 過(guò)夜；
[0153] (2)PBST 洗板，3 次；
[0154] (3)封閉：1%BSA，每孔 200μ l，37°C，2h ;
[0155] (4)PBST 洗板，3 次；
[0156] (5)根據(jù)測(cè)定濃度，調(diào)整全人抗體細(xì)胞上清至相同濃度，每孔100 μ 1，HCV病人血 漿為陽(yáng)性對(duì)照，37°C，2h ;
[0157] (6)PBST 洗板，3 次；
[0158] (7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific)-Peroxidase antibody，1:10000 稀釋，每 孔1〇〇μ 1，加到樣品和陽(yáng)性對(duì)照的ELISA板中，37°C，lh ;
[0159] (8)PBST 洗板，3 次；
[0160] (9)底物A液：B液=1:1，底物為TMB，3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（購(gòu)自Sigma，使 用方法按產(chǎn)品說(shuō)明）。每孔1〇〇μ l，37°C，15min，避光反應(yīng)；
[0161] (10)加入 2M H2S04,每孔 50μ 1 ;
[0162] (11)用分光光度計(jì)測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度（即0D450)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
[0163] 7、抗體中和活性測(cè)定--假病毒中和試驗(yàn)
[0164] l)pcDNA3. 1 (+)-HCV_ElE2 質(zhì)粒構(gòu)建：E1E2 的 3a 亞型序列來(lái)自于 GenBank(序列 號(hào) GQ356213. 1) ;E1E2 的 6a 亞型序列來(lái)自于 GenBank (序列號(hào) DQ480524. 1) ;E1E2 的 2a 亞 型序列來(lái)自于GenBank(序列號(hào)AB237837. 1) ;E1E2的lb亞型序列來(lái)自于GenBank (序列 號(hào) AY045702. 1) ;pcDNA3. 1(+)購(gòu)自 Invitrogen 公司；E1E2 的 3a、6a、2a 亞型（以串聯(lián)的形 式）插入pcDNA3. 1 (+)的位點(diǎn)為EcoRI/Notl，E1E2的lb亞型插入pcDNA3. 1 (+)的位點(diǎn)為 EcoRI/XhoI，獲得 pcDNA3. 1 (+) -HCV-E1E2 質(zhì)粒。
[0165] 2)包裝HCV-E1E2假病毒：將pcDNA3. 1 (-)_HCV-E1E2質(zhì)粒（用分子克隆技術(shù)構(gòu) 建）和包裝質(zhì)粒 pNL4-3Lue + Env-Vpr (參見(jiàn)文獻(xiàn) Conserved amino acids W423and N424in receptor-binding domain of SARS-CoV are potential targets for therapeutic monoclonal antibody. Bian C, Zhang X, Cai X, Zhang L, Chen Z, et al. (2009) Virology383:39 - 46. doi: 10. 1016/j. virol. 2008. 09. 029) -起共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞（參考 Lip〇feCtamineTM2000轉(zhuǎn)染手冊(cè)），37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，測(cè)定假病 毒濃度后，調(diào)整至適當(dāng)濃度；
[0166] 3)感染前一天，用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞（購(gòu)自ATCC)鋪24孔板，密度為 5X104 個(gè) / 孔；
[0167] 4)感染當(dāng)天，將調(diào)整至適當(dāng)濃度的HCV-E1E2假病毒與全人抗體孵育，lh后感染細(xì) 胞，lml/孔，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)；同時(shí)設(shè)置未孵育感染組，作為陰性對(duì)照；
[0168] 5)感染24h后，1ml/孔補(bǔ)液，同時(shí)也加入等比例稀釋的全人抗體。
[0169] 感染48h后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)Luciferase值，確定HCV-E1E2假病毒與本發(fā)明的全 人抗體孵育前后對(duì)于Huh7細(xì)胞的感染力，計(jì)算出全人抗體對(duì)于病毒的抑制率。
[0170] II.實(shí)施例
[0171] 實(shí)施例1、HCV-E2蛋白特異性記憶B細(xì)胞
[0172] 使用FITC-CD19/APC-IgG/Cy3-HCV-E2為特異性標(biāo)志物，獲得了若干個(gè)HCV-E2蛋 白的特異性B細(xì)胞，見(jiàn)圖1。
[0173] 實(shí)施例2、抗體基因
[0174] RT-PCR和Nested-PCR法獲得抗體重輕鏈可變區(qū)基因，分子量為400bp左右， β-actin作為內(nèi)參（343bp)，電泳圖譜見(jiàn)圖2,圖3和圖4。將來(lái)源于同一個(gè)B細(xì)胞抗體重 輕鏈基因可變區(qū)連接T載體，測(cè)序并進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建。
[0175] 7F2重鏈可變區(qū)基因序列如下（SEQ ID N0:1):
[0176] CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGATCCTTCAGT GGTTAC TACTGGAAC(CDRiV TGGATCCGCCAGCCCCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGATTGG G GAAATCAATrCTAGAGGAACCGrCAArrACAACCCGTCCC TT AAGAGT(CDR2、CGAGTCACCATATCAGTAGGCACGTCCAGGAACC AATTCTCCCTGAAGTTGAGGGCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTG ? CrCACAGCCATTCArGATArTTTGArTGGTTATTTAGrGTTrTA CTTTGACTAC(COR3)TaaaarrAaacA^cccaaTrAccaTCTCCTrAa
[0177] 備注：其中使用雙下劃線標(biāo)注的為重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)序列，依次為重鏈 基因 CDR1(SEQ ID N0:5)，CDR2(SEQ ID N0:6)，CDR3(SEQ ID N0:7)序列。
[0178] 7F2重鏈可變區(qū)氨基酸序列如下（SEQ ID NO: 2):
[0179] QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWNfCDRI^X WIRQPPGKGLEWIG ElNPRGTANHNPSIKSiCDR2)X RVTISVGTSRNQFSLKLRAVTAADTAVYYC ARGTHDTLTCYi.AFYFDYfrDR3^X WGQGTPVTVSS
[0180] 備注：其中使用雙下劃線標(biāo)注的依次為重鏈氨基酸⑶R1(SEQ ID NO: 8)， CDR2(SEQ ID NO: 9)，CDR3(SEQ ID NO: 10)序列。
[0181] 7F2輕鏈可變區(qū)基因序列如下（SEQ ID NO: 3):
[0182] TCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACACCGTCACCATCACTTG Γ CGGGCAAGTCAGAACATCGATAGGCATTTA AAT(CDRU TGGTATCAGCAG AAAGCAGGGAAGGCCCCTAAGGTCCTGATCTAT GCTGCATCCGGTTTGCAAAGIYCDR2) G GGGTCTCGTCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAACGATCTGGAACCTGAAGA τττταΓΓΑΓΤΤΑΓΤΑΤτατ CAACAQTATTATGACACTCTrO GGTACACT(CJiU3^ TTTGGTCAGGGGACCAAGCTGGATATCAA
[0183] 備注：其中雙下劃線標(biāo)注的為輕鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)序列，依次為CDR1 (SEQ ID NO: 11)，CDR2 (SEQ ID NO: 12)，CDR3 (SEQ ID NO: 13)序列。
[0184] 7F2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如下（SEQ ID NO: 4):
[0185] QMTQSPSSLSASVGDTVTITC RASONTDRHT.NiCDR 1 \X WYQQKAGKAPKVLIY Aa\SGI.OS(CDR2>>X GVSSRFSGSGSGTEFTLTINDLEPEDFATYYC Q OYYDU.GYT (CDR3) 1 fgqgtkldi
[0186] 備注：其中使用雙下劃線標(biāo)注的依次為輕鏈氨基酸⑶R1 (SEQ ID NO: 14)， CDR2(SEQ ID NO: 15)，CDR3(SEQ ID NO: 16)序列。
[0187] 實(shí)施例3、抗體表達(dá)
[0188] ELISA結(jié)果表明成功表達(dá)了全人抗體，并且7F2全人抗體濃度為55 μ g/ml左右，高 于其它全人抗體。因表達(dá)載體中含有重輕鏈的恒定區(qū)，因此空載體也能表達(dá)不完整的抗體， 見(jiàn)圖5。
[0189] 實(shí)施例4、抗體的抗原特異性
[0190] ELISA結(jié)果表明，7F2全人抗體對(duì)于CH0表達(dá)的HCV-E2具有特異性結(jié)合能力，該能 力在同一批制備的全人抗體中明顯較強(qiáng)。
[0191] 如圖6所示，此實(shí)驗(yàn)，用感染過(guò)HCV的病人血漿作為陽(yáng)性對(duì)照，用細(xì)胞培液和 一株流感病毒抗體 1F2 (參見(jiàn)文獻(xiàn) Fully human broadly neutralizing monoclonal antibodies against influenza A viruses generated from the memory Bcells of a2009pandemic H1N1influenza vaccine recipient. Hu W,Chen A，Miao Y，Xia S,Ling Z,Xu K,,et al. Virology. 2013Jan20 ; 435 (2) : 320-8. doi : 10. 1016/ j. virol. 2012. 09. 034.)作為陰性對(duì)照。
[0192] 實(shí)施例5、抗體的中和活性
[0193] 全人單克隆抗體（7F2)使用293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，將其濃度調(diào)整為25ug/ml、 12. 5ug/ml和6. 25ug/ml進(jìn)行假病毒中和試驗(yàn)測(cè)定其中和活性，即對(duì)HCV假病毒的抑制率。
[0194] 如圖7所示，相比于陰性對(duì)照（一株抗狂犬病毒G蛋白的中和性全人單抗2F5)，實(shí) 驗(yàn)組（抗丙肝病毒E2蛋白的全人單抗7F2)對(duì)于2a亞型HCV假病毒具有超過(guò)60%的抑制 率。
[0195] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
[0001] 序列友 <πο>中Η科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 <120>抗內(nèi)型肝炎病毒的中和性全人箏克隆抗體 <130：> 132240 <160> 16 <170> Patentln version 3,3 <210> 1 <211> 373 <212> DM <2 ?3> 智人 ffiomo Sapiens) <400> 1 cagglgcagc (.acagcaglg gggcgcagga cigllgaagc c l Icggagac cclglccclc 60 acctgcgctg tcto.tggtgg atccttcagt ggttactact ggaactggat ccgccagccc 120 ccaggaaagg gcctggcigtg gattggggaa atcaatccta gaggaaccgc caaccacaac 180 ccgtccctto. agagtcgagt cacca.tatca gtaggcacgt ccaggo,acca attctccctg 240 aagttgaggg ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggcattcac 300 gatactttgo, ctggttattt agcgttctac tttgactact ggggccaggg aaccccggtc 360 accgtctcct cag 373 <210> 2 <211> 127 <212> FRT <213〉智人 Sapiens) <220> <221> raise feature <222> (3B).. (36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67).. (67) <223> Xaa可以足·任意天然M基酸 <220> <221> misc_reature <222> (116)..(116) <223〉Xaa可以是仟意滅然氨基酸 <400> 2 Gin ￥al Gin Leu Gin Gin ?τρ Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15
[0002] Thr Leu Ser Leu Thr €ys Ala Yal Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Asn Xaa Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Asn Pro Arg Gly Thr Ala Asn Ills Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Xaa Arg Val Thr lie Ser Val Gly Thr Ser Arg Asn Gin Phe 65 70 75 80 Ser I,eu l.ys Leu Arg Ala Val 丁hr A1 a A1 a Asp Thr A1 a Val Tyr ?γτ 85 90 95 Cys Ala Arg Gly lie His Asp Thr Leu Thr Gly Tyr Leu Ala Phe Tyr 100 105 110 Phe Asp Tyr Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Fro Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 319 <212> DM (213)智人(Hano Sapiens) <400> 3 tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacacc gtcaccatca 60 cttgccgggc aagtcagaac atcgataggc atttaaattg gtatcagcag aaagca.ggga 120 aggcccctaa ggtcctgatc tatgctgcat ccggtttgca aagtggggtc tcgtctagat 180 tcagtggcag tggatctggg acagaattca ctctcaccat caacgatctg gaacctgaag 240 attttgccac ttactattgt ci-iacagtatt atgacactct cgggtacact tttggtcagg 300 ggaccaagct ggatatcaa 319 <210> 4 <211> 108 <212> PET <213> 智人Ofomo Sapiens) <220> <221> miscfealure <222> (33). . (33) <223/ Xaa可以是任意天然氨基酸 <220> <221> in isc-feature <222> (56) _ (56) <223> XaaHj以是任意天然氨基酸 <220> <221/ nd sc-feature <222> (99).. (99) <223> Xaa BJ以是任意天然氨基酸 <400> 4
[0003] Gin Met Tlir Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr 15 10 15 Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn lie Asp Arg His Leu Asn 20 25 30 Xaa Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu lie Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Gl}r Leu Gin Ser Xaa irly Val Ser Ser Arg Phr Ser 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Asn Asp Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tvr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Asp Thr Leu Gly 85 90 95 lyr Ihr Xaa Phe Gly Gin Gly Thi' i.y.s Leu Asp i Ie 100 105 ；2iON B ^211^ 15 ^212> DNA 、2i3> 寶人(Homo Sapiens) <400> 5 ggttactact ggaac 15 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> 智人〇i_>mo Sapiens) <400> 6 gaaatcaatc ctagaggaac cgccaaccac aacccgtccc ttaagagt 48 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <2i3> 智人（Homo Sapiens) <400、 7 gcgagaggca ttcacgatac ttt.gactggt tatt-t-agcgt tcta.ctttga ctac 54 -210> 8 "211^ 5 <212> PRT <213> 智人(Homo Sapiens) s400^ 8 Glv Ivr Tyr Trp Asn 1 5
[0004] <21?> 9 <211> 16 <212> PRT <213> 智人(Homo Sapiens) <400> 9 Glu lie Asn Pro Arg Gly Thr Ala Asn His Asn Pro Scr Lou Lys Scr 15 10 15 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> 智人（Homo Sapiens) <400> 10 Ala Arg Gly lie His Asp Thr Leu Thr Gly Tyr Leu Ala Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 11 <；211> 33 <212> DNA <213> 智人(Homo Sapiens) <400> 11 cgggcaagtc agaacatcga taggeattta aat 33 <210> 12 <2U> 21 <212> DNA <213> 智人（Homo Sapiens) <400> 12 gctgcatccg gtttgcaaag t 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> 智人(Homo Sapiens) <400> 13 caacagtatt atgacactct cgggtacact 30 <210> 14 <211> 11 <212> PRT
[0005] <213> 智人(Homo Sapiens) <400> 14 Arg Ala Ser Gin Asn lie Asp Arg His Leu Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213〉智人(Homo Sapiens) <400/ 15 Ala Ala Ser Gly Leu Gin Ser 1 5 <210> 16 <2U> 10 <212> PRT <213〉智人（Homo Sapiens) <400/ 16 Gin Gin Tyr Tyr Asp Thr Leu Gly Tyr Thr 1 5 10
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含SEQ ID N0:8所示重鏈⑶R1 區(qū)、SEQ ID N0:9所示重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示重鏈CDR3區(qū)。
2. -種分離的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含SEQ ID NO: 14所示輕鏈⑶R1 區(qū)、SEQ ID NO: 15所示輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈CDR3區(qū)。
3. -種分離的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含以下的氨基酸序列：SEQ ID N0:8所示的重鏈CDR1，SEQ ID N0:9所示的重鏈CDR2和SEQID勵(lì)：10所示的重鏈〇?3， SEQ ID NO: 14所示的輕鏈CDR1，SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的 輕鏈CDR3。
4. 如權(quán)利要求1-3任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可 變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
5. 如權(quán)利要求1-3任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含輕鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可 變區(qū)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
6. 如權(quán)利要求1-3任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)， 其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
7. 編碼權(quán)利要求1-6任一所述的結(jié)合分子的核酸分子。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的結(jié)合分子在制備用于檢測(cè)、治療和/或預(yù)防丙型肝炎病毒 感染的藥物中的用途。
9. 一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體中含有編碼權(quán)利要求1-6任一所述的結(jié) 合分子的DNA。
10. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
11. 一種組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1-6任一所述的單克隆抗體，以及藥學(xué) 上可接受的載體。
12. -種檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑盒，其包括權(quán)利要求1-6任一所述的結(jié)合分子。
13. -種抑制丙型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括給予患者有效量的權(quán) 利要求1-6任一所述的結(jié)合分子。
14. 一種檢測(cè)丙型肝炎病毒的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-6任一所述的結(jié)合分 子與待測(cè)樣品進(jìn)行接觸，通過(guò)檢測(cè)所述的結(jié)合分子與受試樣品的結(jié)合情況，獲得丙型肝炎 病毒的存在情況以及存在量。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104119436SQ201310151427
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月27日
【發(fā)明者】孫兵, 尹東升, 邊超, 王江君, 伊春艷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院