專(zhuān)利名稱(chēng)：：用作選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)位酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物的選擇體系，其基于關(guān)鍵轉(zhuǎn)位酶的失活和通過(guò)相同作用的因子消除該失活，所述因子通過(guò)載體用于有關(guān)細(xì)胞。需要大量的蛋白，這些蛋白當(dāng)中，特別是用于工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的酶，如今通常通過(guò)微生物發(fā)酵獲得。對(duì)天然產(chǎn)生所研究蛋白的微生物而言，遺傳修飾生產(chǎn)菌株的重要性日益顯著。現(xiàn)有技術(shù)早已經(jīng)建立了這類(lèi)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的遺傳工程方法。其原理在于所研究蛋白的基因作為轉(zhuǎn)基因結(jié)合到宿主細(xì)胞中，被這些細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯，并任選分泌穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)或周?chē)橘|(zhì)中。然后它們可從有關(guān)細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中獲得。在用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的工業(yè)生產(chǎn)方法中，首先利用微生物用于合成蛋白和任選地用于分泌所述蛋白的天然能力。基本上，選擇用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)菌體系是發(fā)酵中價(jià)格低廉的，其可以從一開(kāi)始實(shí)現(xiàn)高的待生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品形成率和保證正確的折疊、修飾等等；后者由于與生物體原來(lái)生產(chǎn)所研究蛋白的關(guān)系增強(qiáng)從而是更為可能的。特別建立用于本目的的宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如葡萄球菌(Staphylococcus)或桿菌(Bacillus)屬的種類(lèi)。生物技術(shù)方法的經(jīng)濟(jì)性主要依賴(lài)于可達(dá)到的蛋白產(chǎn)量。除了采用的表達(dá)體系外，產(chǎn)量取決于采用的方法，特別是依賴(lài)于發(fā)酵參數(shù)和基質(zhì)。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)體系和發(fā)酵方法，可以明顯增加生產(chǎn)生物體的潛力和可實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)量。此外，表達(dá)體系基本上被開(kāi)發(fā)，并根據(jù)兩個(gè)根本上不同的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。另一方面，待生產(chǎn)蛋白的基因被整合到宿主生物體的染色體中。這類(lèi)構(gòu)建體在不加以選擇(見(jiàn)下文)的條件下對(duì)附加的標(biāo)記基因是非常穩(wěn)定的。缺點(diǎn)是該基因只有一個(gè)拷貝存在于宿主中，通過(guò)基因劑量效果整合更多的拷貝以提高產(chǎn)品形成率是以非常復(fù)雜的方式系統(tǒng)地布置。現(xiàn)有技術(shù)可以簡(jiǎn)要地解釋如下。歐洲專(zhuān)利EP284126B1解決穩(wěn)定的多重整合的問(wèn)題，在于大量基因拷貝結(jié)合進(jìn)細(xì)胞中，所述細(xì)胞在拷貝之間包含內(nèi)源的和關(guān)鍵的染色體DNA片段。另一個(gè)穩(wěn)定的多重整合的解決方案在專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/41358A1中公開(kāi)。據(jù)其所述，所研究基因的兩個(gè)拷貝以相反轉(zhuǎn)錄方向整合并通過(guò)非必需的DNA片段分開(kāi)，這樣以免兩個(gè)拷貝同源重組。從專(zhuān)利申請(qǐng)DD277467A1，生產(chǎn)細(xì)胞外酶的方法基于所述酶的基因編碼穩(wěn)定有利地多重整合到細(xì)菌染色體中。整合作用通過(guò)同源區(qū)域發(fā)生。為調(diào)控成功的整合作用，使用包含在質(zhì)粒上的紅霉素基因，其由成功的整合作用失活。根據(jù)DE4231764A1的說(shuō)明書(shū)，整合到染色體中可以通過(guò)胸苷酸合成酶基因的單交換或雙交換而實(shí)現(xiàn)。后者允許調(diào)控該方法，因?yàn)閷?duì)于單交換，胸苷酸合成酶活性得以保持，而雙交換中該活性喪失，也就是說(shuō)獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷體。伴隨單交換，在該特定體系中具有對(duì)抗生素三甲氧芐二氨嘧啶的抗性，而雙交換則對(duì)應(yīng)對(duì)抗生素敏感。在申請(qǐng)WO96/23073A1中，公開(kāi)了為整合多拷貝所研究基因到細(xì)菌染色體中的基于轉(zhuǎn)座子的體系，其特征在于質(zhì)粒的標(biāo)記基因通過(guò)整合作用刪除，從而包含的菌株不含抗性標(biāo)記。此外，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，標(biāo)記物只有在控制所需菌株的構(gòu)建時(shí)是需要的。此外在申請(qǐng)WO01/90393A1中也公開(kāi)了提高某些轉(zhuǎn)基因整合到細(xì)菌染色體中拷貝數(shù)的體系。第二種構(gòu)建生產(chǎn)菌株的方法在于對(duì)所研究基因傳遞自主復(fù)制元件，例如質(zhì)粒，如此將其傳遞到宿主生物體。通常在這種情況下每個(gè)細(xì)胞的高質(zhì)粒拷貝數(shù)通過(guò)基因劑量作用具有有益的效果。整個(gè)培養(yǎng)期施加選擇壓力以將質(zhì)粒保留在細(xì)胞中是不利的。默認(rèn)的是，施加選擇壓力通過(guò)添加抗生素到培養(yǎng)基中而進(jìn)行，而給予有關(guān)物質(zhì)抗性的基因被傳遞給質(zhì)粒。從而只有具有足夠數(shù)量的該質(zhì)粒細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。抗生素抗性用作選擇標(biāo)記近來(lái)日益收到批評(píng)。一方面，應(yīng)用抗生素實(shí)際上是昂貴的，特別是如果抗性基于酶降解抗生素，而且有關(guān)物質(zhì)必需在整個(gè)培養(yǎng)期間增加。另一方面，其普遍的應(yīng)用，特別是在其他的
技術(shù)領(lǐng)域：
，導(dǎo)致抗性基因散布到其他菌株，甚至到病理菌株。由于多重抗性的人病源菌株的存在，這已經(jīng)使得例如內(nèi)科衛(wèi)生學(xué)和特別地在傳染性疾病處理中相當(dāng)困難。因此，在很大程度上為穩(wěn)定地整合基因到生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中，對(duì)上述體系進(jìn)行復(fù)原，因?yàn)檫@些質(zhì)粒在沒(méi)有持久的選擇壓力下是穩(wěn)定的。然而，如上所述的有關(guān)菌株只能通過(guò)昂貴的花費(fèi)制備。在生物工程實(shí)踐中，將例如具有選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上新發(fā)現(xiàn)的或修飾的基因結(jié)合到宿主細(xì)胞中并用這樣的方式表達(dá)它是更快和更方便的。在現(xiàn)有技術(shù)中，同時(shí)還開(kāi)發(fā)了無(wú)抗生素的選擇體系。例如，在出版物J.Bacteriol.，Volume172，6557-6567頁(yè)(1990)中Herrero等的“Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistenceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria”，描述了對(duì)除草劑和重金屬的抗性作為選擇標(biāo)記。然而對(duì)這些化合物的應(yīng)用有著和抗生素應(yīng)用類(lèi)似的顧慮。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷體的選擇，例如，通過(guò)使有關(guān)細(xì)胞取決于某些代謝產(chǎn)物的供應(yīng)，作用原則上與對(duì)抗生素的選擇相似。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株然后接受，與消除該營(yíng)養(yǎng)缺陷體的所研究的轉(zhuǎn)基因結(jié)合。就損失來(lái)說(shuō)，在合適的培養(yǎng)條件下它們將同時(shí)喪失成活力，從而對(duì)所需的營(yíng)養(yǎng)缺陷體生產(chǎn)者進(jìn)行選擇。例如，在出版物NetherlandsMilkandDairyJournal，Volume40，(1986)141-154頁(yè)中deVos的“Genecloninginlacticstreptococci”中，參考例如148頁(yè)從乳鏈球菌代謝產(chǎn)生的不同選擇標(biāo)記；這些當(dāng)中是來(lái)自乳鏈球菌的乳糖代謝、銅抗性和不同細(xì)菌素抗性基因的選擇標(biāo)記。專(zhuān)利EP284126B1，其考慮所研究基因穩(wěn)定整合到細(xì)菌染色體的問(wèn)題(參見(jiàn)上面)，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在第7頁(yè)以術(shù)語(yǔ)″生存選擇″總結(jié)了可能用于選擇的營(yíng)養(yǎng)缺陷體、抗微生物劑抗性和對(duì)病毒感染抗性體系。這里提到的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記的例子是新陳代謝基因leu、his、trp“或類(lèi)似的”；顯而易見(jiàn)是指來(lái)自氨基酸合成途徑的基因。但是在實(shí)踐中，這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)缺陷體的應(yīng)用到目前為止是非常有問(wèn)題的，因?yàn)樘貏e是在工業(yè)發(fā)酵介質(zhì)中，幾乎所有的必需基質(zhì)都是足量的，有關(guān)細(xì)胞可以通過(guò)從培養(yǎng)基吸收相同的化合物而補(bǔ)償某特定化合物合成的不足。例外迄今僅是必需的胸腺嘧啶脫氧核苷，其在工業(yè)發(fā)酵介質(zhì)中只以痕量存在，因此必需通過(guò)胸苷酸合酶從增殖的并因而合成DNA的生物體形成。因此EP251579A2的應(yīng)用提供采用對(duì)核苷酸代謝必要的胸苷酸合酶基因缺陷的宿主菌株的解決方案。據(jù)文獻(xiàn)所述通過(guò)載體有可能使該基因(來(lái)自EscherichiacoliK12的thyA)精確地用于所述功能并消除基因缺陷。如果這些載體另外帶有所研究蛋白的基因，可以產(chǎn)生對(duì)生產(chǎn)者細(xì)胞類(lèi)似于抗生素的選擇。概括地說(shuō)，應(yīng)該理解在現(xiàn)有技術(shù)中盡管存在大量生物工程生產(chǎn)蛋白的經(jīng)驗(yàn)，并且通過(guò)染色體整合和抗生素選擇表達(dá)所研究基因是系統(tǒng)性可調(diào)控的，對(duì)于這兩個(gè)體系迄今沒(méi)有同樣好的實(shí)際應(yīng)用的替換物存在，特別是不存在比染色體整合復(fù)雜性小且同時(shí)無(wú)需通過(guò)昂貴的或有生態(tài)問(wèn)題的化合物進(jìn)行選擇。特別是，對(duì)于工業(yè)慣常的復(fù)合培養(yǎng)基，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇的方法目前只得到非常不充分的結(jié)果。因此本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)新的選擇體系，其與通過(guò)抗生素的選擇具有可比較的簡(jiǎn)便性，并且無(wú)需通過(guò)昂貴的和某些情況下環(huán)境有害的物質(zhì)進(jìn)行選擇。它應(yīng)該可在工業(yè)規(guī)模上利用。它不應(yīng)該基于這樣的必需基因，所述基因在工業(yè)介質(zhì)中不存在時(shí)可通過(guò)污染物補(bǔ)償。根據(jù)本發(fā)明上述目的通過(guò)微生物的選擇而實(shí)現(xiàn)，其特征在于(a)編碼必需轉(zhuǎn)位活性的內(nèi)源性存在的基因被失活，和(b)根據(jù)(a)必需轉(zhuǎn)位活性的失活通過(guò)載體得到消除。令人驚訝的是，已經(jīng)公認(rèn)轉(zhuǎn)位涉及的關(guān)鍵因子適合用于選擇。對(duì)于選擇，使用根據(jù)發(fā)明的基因，其衍生的蛋白包括在蛋白轉(zhuǎn)位中作為有關(guān)細(xì)胞必需的因子。這表明缺乏該基因是致命的，因此微生物的抗生素樣選擇是可能的。該選擇體系運(yùn)行無(wú)需添加劑(例如，現(xiàn)有技術(shù)已知的抗生素)，且原則上作用時(shí)不受營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組成的影響。為此，對(duì)所研究微生物進(jìn)行分子生物學(xué)修飾是必需的，其按照轉(zhuǎn)位的細(xì)節(jié)進(jìn)行描述并且在本申請(qǐng)的實(shí)施例中闡述。轉(zhuǎn)位過(guò)程包括由細(xì)菌形成的蛋白分泌到周質(zhì)中(就革蘭氏陰性細(xì)菌而言)、或到周?chē)橘|(zhì)中(就革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌兩者而言)。其描述于，例如A.J.Driessen(1994)的論文“Howproteinnscrossthebacterialcytoplasmicmembrane”inJ.Membr.Biol.，142(2)，pp.145-59。為此所必需的分泌裝置由一系列不同的、主要是膜-相關(guān)的蛋白組成，其在本申請(qǐng)的圖1中顯示。這些包括，特別是，蛋白SecA、SecD、SecF(共同作為復(fù)合SecDF)，E、G和Y較好地表征，例如枯草桿菌(Bacillussubtilis)(vanWely，K.H.，Swaving，J.，F(xiàn)reudl，R.，Driessen，A.J.(2001)“TranslocationofproteinsacrossthecellenvelopofGram-positivebacteria”，F(xiàn)EMSMicrobiolRev.2001，25(4).，pp.437-54)。被認(rèn)為是體系一部分的其它因子是YajC，其同樣地與Sec復(fù)合物直接接觸，且在圖1中確認(rèn)了因子Bdb(Dsb)、SPase(為″信號(hào)肽酶″)、PrsA和b-SRP(Ffh，F(xiàn)fs/Scr、SRP-RNA)。前面提到的因子是細(xì)菌因子，其原則上起著與最初在真核生物中描述的SRP(信號(hào)識(shí)別粒子)相同的作用。其亞基是Ffh因子，特征來(lái)自枯草桿菌(B.Subtilis)和大腸桿菌(E.coli)。b-SRP相鄰的亞基在枯草桿菌中被稱(chēng)為Scr，在E.coli中被稱(chēng)為Ffs。此外，RNA(SRP-RNA)是功能b-SRP復(fù)合物的一部分。功能上與此聯(lián)合的其他因子在大腸桿菌中被稱(chēng)為Srb和在枯草桿菌中被稱(chēng)為FtsY。就其功能對(duì)應(yīng)于真核的?？康鞍?。在另外的背景中，例如還包括因子PrfB(肽鏈釋放因子B；也叫RF2)。它已知為蛋白合成裝置的一部分，即，既在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌又在革蘭氏陰性細(xì)菌中。與翻譯相關(guān)，它功能特別地是脫離剛翻譯的核糖體，即翻譯的終止。由于prfB基因在許多細(xì)菌中與因子SecA的基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄，因而只間接地提供與上述轉(zhuǎn)位的關(guān)系。從而具有調(diào)控關(guān)系。轉(zhuǎn)位的前提是待釋放的蛋白具有N-末端信號(hào)肽(Park，S.，Liu，G.，Topping，T.B.，Cover，W.H.，Randall，L.L.(1988)“Modulationoffoldingpathwaysofexportedproteinsbytheleadersequence”，Science，239，pp.1033-5)。這適用于細(xì)胞外的蛋白和膜蛋白。當(dāng)翻譯在核糖體上進(jìn)行后，得到的肽鏈通過(guò)具有伴護(hù)作用的胞漿蛋白保持解折疊的狀態(tài)并運(yùn)輸?shù)侥?。肽的穿膜運(yùn)輸隨著消耗ATP而被催化(Mitchell，C.，Oliver，D.(1993)“TwodistinctATP-bindingdomainsareneededtopromoteproteinexportbyEscherichiacoliSecAATPase”，Mol.Microbiol.，10(3)，pp.483-97)。這里SecA作為多酶復(fù)合物轉(zhuǎn)位酶的能量供給組分(ATPase)。在穿膜以后，信號(hào)肽通過(guò)信號(hào)肽酶的活性分裂，細(xì)胞外的蛋白以這樣的方式與膜分離。就革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌而言，外蛋白(exoproteins)以這樣方式釋放直接進(jìn)入周?chē)橘|(zhì)。就革蘭氏陰性細(xì)菌而言，隨后通常在周質(zhì)空間發(fā)現(xiàn)該蛋白，并需要另外的修飾以實(shí)現(xiàn)其釋放到周?chē)橘|(zhì)中。B.v.d.Berg等近期的研究(2004；Nature，Volume427，36到44頁(yè))描述了轉(zhuǎn)位酶的x-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)，即在其他生物體中作為對(duì)應(yīng)復(fù)合物模型的詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschi)中的SecY復(fù)合物。因此該方法的中央分子是轉(zhuǎn)位酶蛋白前體，由SecA、SecY、SecE、SecD、SecF(SecDF)和SecG亞單位組成。因?yàn)锳TPase控制該過(guò)程，因子SecA對(duì)轉(zhuǎn)位具有決定性的作用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的特征是這些因子(見(jiàn)下文)。在下面的表1中，目前已知包括在轉(zhuǎn)位中的因子根據(jù)它們?cè)趦煞N模式生物體大腸桿菌(革蘭氏陰性)和枯草桿菌(格蘭氏陽(yáng)性)之一中是否是必需的而進(jìn)行分類(lèi)。如果這些因子中的一個(gè)在各種情況下的有關(guān)生物體中是必需的，那么其適合于本發(fā)明的選擇?；旧?，由此可以假定對(duì)應(yīng)的模式還存在于其他的生物體，特別是革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。表1目前已知包括在革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌轉(zhuǎn)位中的蛋白因子，根據(jù)它們?cè)谶@些生物體中是否是需的而進(jìn)行分類(lèi)。根據(jù)本發(fā)明在革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是在大腸菌類(lèi)細(xì)菌中，更具體是在大腸桿菌中，可通過(guò)下列轉(zhuǎn)位酶或它們的相關(guān)基因進(jìn)行選擇SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或FfS)、SrborYajC。根據(jù)本發(fā)明在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是在桿菌中，更具體是在枯草桿菌中，可通過(guò)下列轉(zhuǎn)位酶或它們的相關(guān)基因而選擇SecA、SecY、SecE、b-SRP(Ffh或Scr)、FtsY或PrsA。這些列表中的限定或連接語(yǔ)不應(yīng)理解為排他的。技術(shù)上而言，其應(yīng)該還可能同時(shí)關(guān)閉一些相關(guān)的基因。然而根據(jù)本發(fā)明，只選擇一個(gè)就足夠。在各種情況下，相關(guān)基因的單獨(dú)序列可以從例如下列可訪(fǎng)問(wèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GenBank(NationalCenterForBiotechnologyInformationNCBI，NationalInstituteofHealth，Bethesda，MD，USA；http//www3.ncbi.nlm.nih.gov)；EMBLEuropeanBio-informaticsInstitute(EBI)inCambridge，GreatBritain(http//www.ebi.ac.uk)；Swiss-Prot(GenevaBio-informatics(GeneBio)S.A.，GeneVa，Switzerland；http//www.genebio.com/sprot.html)；″Subtilist″or″Colibri″ofthePasteurInstitute，25，28rueduDocteurRoux，75724ParisCEDEX15，F(xiàn)ranceforgenesandfactorsfrom枯草桿菌orE.coli(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/orhttp//genolist.pasteur.fr/Colibri/)。此外，可以求助于通過(guò)在提及的數(shù)據(jù)庫(kù)交叉引用而獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)本發(fā)明，在各種情況下只需要鑒定和恰當(dāng)?shù)厥褂迷O(shè)計(jì)用于培養(yǎng)的菌株中轉(zhuǎn)位裝置的單個(gè)必需基因。本發(fā)明序列表中表明的不同微生物SecA因子的序列產(chǎn)生了另外的起點(diǎn)。這些能被直接使用(見(jiàn)下文優(yōu)選實(shí)施方案)或者用于鑒定基因庫(kù)中事先已經(jīng)設(shè)計(jì)用于所研究微生物的同源體。這些轉(zhuǎn)位酶或因子主要被理解為表示野生型分子。但是，如果有可能制備原理上在轉(zhuǎn)位裝置中具有與野生型酶相同作用的變體，則根據(jù)變體構(gòu)建的選擇體系另外地也包括在保護(hù)范圍內(nèi)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)的菌株，如果它不屬于本申請(qǐng)研究的種類(lèi)中的一種，則必需首先確認(rèn)是否至少一種因子對(duì)其是必需的。有可能以簡(jiǎn)單的方式實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)從菌株除去一種這些已知的基因，所述菌株是盡可能緊密相關(guān)的(例如相似的革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)，或借助于通?？蛇M(jìn)入的數(shù)據(jù)庫(kù)的條目而合成并將它整合到基因敲除的載體中。這類(lèi)方法通常是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的專(zhuān)業(yè)人員公知的。如果用所述載體轉(zhuǎn)化和隨后這些基因的同源重組物進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組具有致死效應(yīng)，優(yōu)選與轉(zhuǎn)化分開(kāi)啟動(dòng)，則該基因被認(rèn)為是必需的。根據(jù)本發(fā)明和特別地根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的模型，認(rèn)為是必需的基因可以用作選擇標(biāo)記。根據(jù)特征(a)進(jìn)行必需的失活，例如通過(guò)對(duì)已經(jīng)被引入到所研究微生物菌株細(xì)胞中的失活基因拷貝的同源重組，例如通過(guò)用合適的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。該方法本質(zhì)上是已知的。作為重組事件的結(jié)果，基因的染色體拷貝被完全或部分刪除，從而不會(huì)起作用。這可以通過(guò)例如已經(jīng)事先進(jìn)行致死性檢測(cè)的相同基因進(jìn)行。然而優(yōu)選，假定內(nèi)源同源染色體是已知的或可以用合理的花費(fèi)分離，那么其可用于達(dá)到高的重組成功率。失活是否成功對(duì)本發(fā)明的完成是決定性的。這個(gè)概念可以通過(guò)，例如，具有溫度敏感性的復(fù)制起點(diǎn)和待刪除的基因同源DNA區(qū)域被另外插入到其中的質(zhì)粒載體(刪除載體)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？赡娴氖Щ?，例如，將還可能通過(guò)可移動(dòng)的遺傳成分例如轉(zhuǎn)座子的整合作用進(jìn)入到靶基因中而實(shí)現(xiàn)。在本文中，在各種情況下均應(yīng)考慮特征(b)，即，甚至在重組或失活事件前，或最遲同時(shí)，在有關(guān)細(xì)胞中制備用于本發(fā)明選擇的基因完整的拷貝，因?yàn)?，否則的話(huà)所述細(xì)胞將不能從失活作用中存活。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生的缺陷通過(guò)載體來(lái)彌補(bǔ)，即載體能消除失活。在這方面，如上所述，優(yōu)選使用內(nèi)源性存在于宿主細(xì)胞并根據(jù)(a)刪除的基因。然而，還可以采用來(lái)自其他生物體的功能相同的基因，優(yōu)選相關(guān)的菌株，只要它們能夠消除所研究的缺陷。因此有可能，例如，通過(guò)提供來(lái)自肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)的secA基因消除枯草桿菌SecA的缺陷。還可能通過(guò)載體，消除第一個(gè)缺陷的另一種遺傳成分被帶進(jìn)細(xì)胞，例如功能基本相同但經(jīng)過(guò)突變修飾的因子的基因。在該細(xì)胞中，存在通過(guò)單獨(dú)的遺傳因子補(bǔ)償致死缺陷的情況是占優(yōu)勢(shì)的。所述單獨(dú)的遺傳因子的缺失將是致死的，所以這種細(xì)胞被迫在任何細(xì)胞分裂情況下將該元件傳遞給后代。在優(yōu)選實(shí)施方案中特征(c)利用這一點(diǎn)(見(jiàn)下文)，據(jù)上所述補(bǔ)償基因缺陷的載體攜帶所述轉(zhuǎn)基因，所研究蛋白的基因?qū)⒏鶕?jù)本發(fā)明的方法精確制備。在某種程度上內(nèi)源的選擇壓力占優(yōu)勢(shì)，無(wú)需添加外部必需的其他化合物例如重金屬或抗生素，即通過(guò)培養(yǎng)基來(lái)避免喪失具有轉(zhuǎn)基因的載體。另一方面，開(kāi)始論述為整合轉(zhuǎn)基因本身進(jìn)入染色體DNA而進(jìn)行復(fù)雜的修飾是不適用的。例如，已制備的微生物菌株使用類(lèi)似構(gòu)建的載體而用于新的轉(zhuǎn)化，其每次能利用相同的作用消除基因缺陷，其中制備所述的微生物菌株用于轉(zhuǎn)位裝置確定的失活，但在各種情況下攜帶不同的轉(zhuǎn)基因。因此可獲得非常實(shí)用且可以多種方式使用的選擇體系。根據(jù)本發(fā)明選擇方法的目的在于獲得在細(xì)胞中經(jīng)多個(gè)世代保持穩(wěn)定的遺傳元件。精確地講該元件是載體，通過(guò)其來(lái)補(bǔ)償必需轉(zhuǎn)位活性的失活，即消除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的選擇方法特征在于(c)根據(jù)(b)的載體攜帶轉(zhuǎn)基因。那么，這是選擇體系技術(shù)上最重要的應(yīng)用。經(jīng)多個(gè)世代穩(wěn)定的遺傳因子是攜帶轉(zhuǎn)基因的，特別地是其基因產(chǎn)物具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因。優(yōu)選的實(shí)施方案如下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的選擇過(guò)程的特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是以下因子中的一個(gè)SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。如表1中所述，這些因子或相關(guān)的基因是從大腸桿菌或從枯草桿菌已知必需的那些基因。因此，特別是在這兩種生物體中，而且在相關(guān)的乃至較少相關(guān)的種類(lèi)中，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)有關(guān)同源體建立選擇體系是顯而易見(jiàn)的。因?yàn)楸娝苤诟鞣N情況下即使是這些基因的單個(gè)構(gòu)件也可以代替另一個(gè)生物體中涉及的功能，就是說(shuō)超過(guò)了革蘭氏陰性/革蘭氏陽(yáng)性的限度，根據(jù)本發(fā)明至少甚至來(lái)自很遠(yuǎn)相關(guān)物種有關(guān)基因的單個(gè)構(gòu)件應(yīng)該可以使用。優(yōu)選，必需的轉(zhuǎn)位活性是蛋白前體轉(zhuǎn)位酶以下亞基中的一種SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優(yōu)選是SecA亞基。如圖1所示，在某種程度上這些因子代表轉(zhuǎn)位裝置的功能核心。對(duì)于SecA，正如已經(jīng)在上述中另外說(shuō)明的，該因子占據(jù)ATP酶活性的關(guān)鍵位置。因此，在本申請(qǐng)的實(shí)施例中，本發(fā)明還可以借助secA基因進(jìn)行變換。優(yōu)選，本發(fā)明選擇過(guò)程的特征在于根據(jù)(b)發(fā)生通過(guò)與失活的內(nèi)源性存在的必需轉(zhuǎn)位活性相同的活性而消除，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)的活性，特別地優(yōu)選通過(guò)同一活性。據(jù)反映由于通常有關(guān)因子在物種之間具有高同源值，來(lái)自較少密切相關(guān)物種的有關(guān)基因也具有應(yīng)用前景。然而，當(dāng)然來(lái)自更緊密相關(guān)的物種的基因和很特別地來(lái)自相同生物體的基因是更優(yōu)選的，因?yàn)榫褪Щ钏匦璧慕粨Q而言這些基因是最有前景的。可以再次指出只有單個(gè)基因適于失活對(duì)根據(jù)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)選擇是足夠的。如上所述，有關(guān)DNA和氨基酸序列可從通?？蛇M(jìn)入的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。例如，來(lái)自來(lái)自PasteurInstitute的″Subtilist″數(shù)據(jù)庫(kù)(參見(jiàn)上面)在SEQIDNO.1和2序列列表中表示的枯草桿菌SecA蛋白序列已經(jīng)除去(日期2003年2月3日)；上述序列與Swiss-Prot(參見(jiàn)上面)登記號(hào)碼為P28366的序列完全一致。序列表明SEQIDNO.3和4代表的來(lái)自大腸桿菌SecA蛋白的序列方案來(lái)源于PasteurInstitute的″Colibri″數(shù)據(jù)庫(kù)(參見(jiàn)上面；日期2003年2月3日)；這與Swiss-Prot(參見(jiàn)上面)登記號(hào)碼為P10408的序列完全一致。地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的SEQIDNO.5和6如本申請(qǐng)實(shí)施例1的描述從商業(yè)可購(gòu)買(mǎi)的菌株地衣芽孢桿(DSM13)中獲得(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，38124Brunswick；http//www.dsmz.de)。因?yàn)槲锓N枯草桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌是技術(shù)上最經(jīng)常采用的微生物，這些細(xì)菌對(duì)于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法特別重要。使用本申請(qǐng)的序列表，能夠利用來(lái)自這三個(gè)最重要生物體的同源secA基因，而不必將它們分離用于復(fù)制。通過(guò)這些基因，有可能例如鑒定其他微生物中的有關(guān)同源染色體，例如通過(guò)制備基因庫(kù)和使用這些基因中的一種作為探針進(jìn)行篩選。但特別是在有關(guān)的物種中，還有可能采用這些基因本身用于本發(fā)明的失活。因此優(yōu)選實(shí)施方案的特征在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)來(lái)自枯草桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌的secA基因的區(qū)域恢復(fù)轉(zhuǎn)位活性而實(shí)現(xiàn)，其分別見(jiàn)于SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表。優(yōu)選的方法特征還在于發(fā)生根據(jù)(a)的失活，以使在根據(jù)(a)失活的基因區(qū)域和載體上根據(jù)(b)的同源區(qū)域的重組被阻止，優(yōu)選完全失去包含在有關(guān)染色體基因中的基因區(qū)域。如果載體被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體，致死突變將被永久消除，而無(wú)需同時(shí)存在有關(guān)載體上的選擇壓力。通過(guò)這種方法，所真正關(guān)注的轉(zhuǎn)基因可能通過(guò)后續(xù)的細(xì)胞分離而喪失。在失活步驟(a)中的廣泛刪除可以防止這一點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)中，特別是出版物J.Biotechnol.，Volume19，221-240頁(yè)(1991)中J.Vehmaanper_etal.的“GeneticmanipulationofBacillusamyloliquefaciens”，描述了通過(guò)刪除載體進(jìn)行基因失活的方法。借助上述的描述，有可能在實(shí)施例3中從地衣芽孢桿菌成功地刪除secA基因。該刪除載體的復(fù)制起點(diǎn)的特點(diǎn)在于其是溫度依賴(lài)性的。因此，在相對(duì)低的溫度下首先選擇成功的轉(zhuǎn)化，然后通過(guò)提高溫度對(duì)成功的整合施加選擇壓力(即失活內(nèi)源基因)是非常簡(jiǎn)單的。類(lèi)似的，例如通過(guò)添加低分子量化合物構(gòu)建體用作對(duì)照也是可能的。因此根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法特征在于根據(jù)(a)的失活通過(guò)刪除載體而進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)具有外源可調(diào)控復(fù)制起點(diǎn)的刪除載體，特別優(yōu)選通過(guò)具有溫度依賴(lài)性的復(fù)制起點(diǎn)的刪除載體。如上所述，原理上有可能(b)包含轉(zhuǎn)基因的消除載體被整合到細(xì)菌染色體中。然而，這種情況下存在轉(zhuǎn)基因永久喪失的危險(xiǎn)，優(yōu)選的方法特征在于根據(jù)(b)的載體是在微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。其可以在衍生的細(xì)胞系中復(fù)制其自身。如果該質(zhì)粒是多拷貝數(shù)(例如每細(xì)胞2到100)自我復(fù)制的質(zhì)粒則是非常有利的，優(yōu)選多拷貝數(shù)(每細(xì)胞大于100質(zhì)粒)。存在的拷貝數(shù)越多，消除越可能成功。此外，當(dāng)載體攜帶有編碼所研究蛋白的轉(zhuǎn)基因時(shí)，其可以通過(guò)基因劑量效應(yīng)增加該產(chǎn)品的產(chǎn)量。由于革蘭氏陰性細(xì)菌的重要性，特別是在基因或基因產(chǎn)物的克隆和定性時(shí)，優(yōu)選的選擇方法特征在于微生物是革蘭氏陰性的細(xì)菌菌株。其中，特別地，應(yīng)當(dāng)理解方法的特征在于涉及的是革蘭氏陰性大腸桿菌屬或克雷伯桿菌屬(Klebsiellaplanticola)的細(xì)菌，特別地是大腸桿菌K12，大腸桿菌B的衍生物或植生克雷伯桿菌的衍生物，以及非常特別地是E.coliBL21(DE3)、E.coliRV308，E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliXL-1或植生克雷伯桿菌(Klebsiellaplanticola)(Rf)的衍生物。這些是分子生物學(xué)中最常用的生物體。特別對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白而言，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是特別重要的。一定程度上這適用于分泌的蛋白。因此根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法特征在于微生物是革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌菌株。這些當(dāng)中，特別是在工業(yè)上，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)屬、棒狀桿菌(Corynebacteria)屬或芽孢桿菌(Bacillus)是已經(jīng)建立的，特別是肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，枯草桿菌(Bacillussubtilis)，地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，克魯伯氏芽孢桿菌(B.globigii)或緩慢芽孢桿菌(B.lentus)，及非常特別地，地衣芽胞桿菌或解淀粉芽孢桿菌的衍生物，這些決定了對(duì)應(yīng)優(yōu)選選擇方法的特征。特別感興趣的是涉及通過(guò)培養(yǎng)微生物而產(chǎn)生特定產(chǎn)物的本發(fā)明的方法。因此對(duì)應(yīng)地優(yōu)選的選擇方法是特征為根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因是編碼非酶蛋白的那些方法，特別是藥物相關(guān)蛋白，非常特別的是胰島素或降鈣素。然而，酶也是在工業(yè)上是非常重要的。因此，根據(jù)本發(fā)明這些方法還要求保護(hù)特征在于根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因是編碼酶的轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選編碼水解酶或氧化還原酶，特別優(yōu)選蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)素分解酶(cutinase)、氧化酶、過(guò)氧化物酶或漆酶。其中，優(yōu)選生產(chǎn)用于去污劑和清潔劑的代表性的酶闡述如下。一般來(lái)說(shuō)，這類(lèi)組合物可以用于提高現(xiàn)有技術(shù)中所有酶的去污或清潔效力。在這些蛋白酶中，枯草桿菌類(lèi)的酶是優(yōu)選的，例如緩慢芽孢桿菌的堿性蛋白酶。來(lái)自緩慢芽孢桿菌DSM5483(WO91/02792A1)的蛋白酶派生出使用BLAP_作為名稱(chēng)的變體，其詳細(xì)在WO92/21760A1，WO95/23221A1，WO02/088340A2和WO03/038082A2中描述。來(lái)自不同的芽孢桿菌屬sp.和克魯伯氏芽孢桿菌的另外的可根據(jù)本發(fā)明制備的蛋白酶從以下專(zhuān)利申請(qǐng)顯而易見(jiàn)地得到WO03/054185A1，WO03/056017A2，WO03/055974A2和WO03/054184A1?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明制備的淀粉酶的例子是來(lái)自地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪桿菌芽孢(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶，和它們改進(jìn)的進(jìn)一步發(fā)展，特別用于去污劑和清潔劑的應(yīng)用。此外在專(zhuān)利申請(qǐng)WO02/10356A2公開(kāi)了來(lái)自芽孢桿菌sp.A7-7(DSM12368)的α-淀粉酶和在申請(qǐng)WO02/44350A2中描述的來(lái)自B.agaradherens(DSM9948)大環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)重點(diǎn)用于此目的。此外，屬于α-淀粉酶序列部分的分解淀粉酶是本申請(qǐng)的重點(diǎn)，其在申請(qǐng)WO03/002711A2中定義，且在WO03/054177A2中有描述。同樣地，提及到分子的融合產(chǎn)物指例如來(lái)自申請(qǐng)DE10138753A1的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，還可以生產(chǎn)脂肪酶或角質(zhì)素分解酶，例如那些原先可從Humicolalanuginosa(Thermomyceslanuginosus)獲得的酶，或進(jìn)一步發(fā)展的脂肪酶，特別是那些具有氨基酸交換D96L的酶或其起始酶分離自門(mén)多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)和茄病鐮孢(Fusariumsolanii)的脂肪酶或角質(zhì)素分解酶。此外，其特別地設(shè)計(jì)用于紡織品的工業(yè)處理和用于依賴(lài)?yán)w維素酶例如葡聚糖內(nèi)切酶和/或纖維二糖水解酶的清潔劑。例如，也通過(guò)來(lái)自天然生產(chǎn)者生產(chǎn)的纖維素酶是來(lái)自芽孢桿菌sp.CBS670.93和CBS669.93的那些，如WO96/34092A2的公開(kāi)。此外，也可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)以術(shù)語(yǔ)半纖維素酶概括的另外的酶。這些包括，例如，甘露聚糖酶、黃原膠裂解酶、果膠裂解酶(＝果膠胸)、果膠酯酶、果膠酸鹽裂解酶(＝木聚糖酶)、支鏈淀粉酶和β-葡聚糖酶。去污劑和清潔劑酶同樣地包括氧化還原酶，例如氧化酶、氧酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶，例如鹽、氯、溴、木質(zhì)素、葡萄糖或錳過(guò)氧化物酶、二氧酶或漆酶(酚類(lèi)氧化酶、多酚氧化酶)或所有在現(xiàn)有技術(shù)描述用于這些應(yīng)用領(lǐng)域的其他酶。如同引言中解釋的，構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)明目的特別明顯地依賴(lài)于大規(guī)模發(fā)酵的背景。因?yàn)闇?zhǔn)確地講，其缺點(diǎn)表現(xiàn)為一方面，通過(guò)抗生素選擇是昂貴的和從環(huán)境觀(guān)點(diǎn)來(lái)看是有問(wèn)題的，另一方面根據(jù)代謝缺陷癥的營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以由于工業(yè)培養(yǎng)基的復(fù)雜性而得到補(bǔ)償。因此根據(jù)本發(fā)明的選擇方法轉(zhuǎn)化為大規(guī)模的方法是特別重要的，例如用于低分子量化合物例如抗生素或維生素的生產(chǎn)或很特別地用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程。通過(guò)培養(yǎng)微生物菌株細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的。它們基于的事實(shí)是以適合的方式培養(yǎng)細(xì)胞，其天然地或用有關(guān)基因轉(zhuǎn)化后生產(chǎn)所研究的蛋白，優(yōu)選被刺激以形成所研究的蛋白。因此通過(guò)培養(yǎng)微生物菌株細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方法形成本發(fā)明的另一個(gè)主題，特征為采用前述的選擇方法。這一點(diǎn)上，尤其是上述的實(shí)施方案強(qiáng)調(diào)消除載體本身包含轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因優(yōu)選編碼非酶蛋白或酶。其中，特別有必要了解商業(yè)上重要的蛋白。因此，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)胰島素被用于治療糖尿病，使用許多酶，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶以至氧化酶來(lái)生產(chǎn)去污劑和清潔劑。由于簡(jiǎn)單的工業(yè)操作性能，如果在載體上能獲得所研究的轉(zhuǎn)基因和消除基因，那些根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法是優(yōu)選的，其特征在于根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因編碼通過(guò)該方法生產(chǎn)的蛋白。原則上，細(xì)菌能被用在固體表面上。這對(duì)檢測(cè)它們的代謝性質(zhì)或在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模持續(xù)培養(yǎng)是特別重要的。為生產(chǎn)蛋白，另一方面，特征為微生物培養(yǎng)發(fā)生在液體培養(yǎng)基中優(yōu)選在發(fā)酵罐中的方法是優(yōu)選的。這類(lèi)技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是普遍的，并且準(zhǔn)確地通過(guò)本發(fā)明中由必需的轉(zhuǎn)位因子通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)選擇得到進(jìn)一步發(fā)展。特別重要的是特征為所研究的蛋白分泌到周?chē)橘|(zhì)中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。用這種方法獲得的產(chǎn)品的發(fā)展被顯著地促進(jìn)。然而本發(fā)明可能的替換方法也在于裂解所研究的細(xì)胞，其制備遵循實(shí)際生產(chǎn)的蛋白，從而獲得該產(chǎn)物。原則上，通過(guò)對(duì)微生物的各自分子生物學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生新的菌株。因此，新的微生物菌株還通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，確切地說(shuō)是通過(guò)特定的必需轉(zhuǎn)位活性的失活和通過(guò)供給相同作用的轉(zhuǎn)位因子消除而不同于起始菌株的那些菌株(更確切地說(shuō)不同于起始細(xì)胞)。因此使用本發(fā)明的選擇方法產(chǎn)生新的微生物。因此已經(jīng)通過(guò)前述的選擇方法獲得的微生物屬于本申請(qǐng)保護(hù)的范圍。特別有益的方面在于通過(guò)總是進(jìn)行相同類(lèi)型的失活和在消除載體上的消除來(lái)制備種群相關(guān)的微生物，但每次制備另一種轉(zhuǎn)基因。該方法一旦使用成功可用該方式轉(zhuǎn)移無(wú)數(shù)其他的選擇問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)尤其是上述解釋的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法，必要的是表達(dá)轉(zhuǎn)基因。通過(guò)這種方法，表征根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的微生物。這些特征當(dāng)中，根據(jù)上述關(guān)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的所述內(nèi)容，特征在于轉(zhuǎn)基因是分泌的微生物是優(yōu)選的。據(jù)上所述，只可能發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的選擇體系，其中編碼轉(zhuǎn)位活性的必需基因被認(rèn)為是這樣的，通過(guò)該基因可以進(jìn)行選擇。這些類(lèi)型基因的使用迄今仍然未被考慮，盡管許多這類(lèi)基因已知來(lái)自于大量微生物。準(zhǔn)確地講這些知識(shí)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的選擇體系是有利的，因?yàn)閷?shí)際上所有微生物基因能通過(guò)可實(shí)現(xiàn)的合適選擇方式來(lái)定義。為實(shí)現(xiàn)上述目的，它們只需如上所述失活，并被功能同源體在有關(guān)細(xì)胞中代替。因此本發(fā)明的一個(gè)主題是編碼微生物選擇的必需轉(zhuǎn)位活性的基因的應(yīng)用，其特征在于(a)內(nèi)源性存在于微生物中的該必需轉(zhuǎn)位活性被失活，和(b)根據(jù)(a)的必需轉(zhuǎn)位活性失活通過(guò)載體消除。對(duì)應(yīng)于上述的介紹，以下解釋的本發(fā)明該主題的實(shí)施方案因此是優(yōu)選的。(c)如果這些應(yīng)用的特征在于根據(jù)(b)的載體攜帶轉(zhuǎn)基因，那么其為特別的分子基因在技術(shù)上有意義。本發(fā)明的要點(diǎn)包括任何合適的應(yīng)用，其特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是以下因子之一SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。這些當(dāng)中，基于具有以下蛋白轉(zhuǎn)位酶亞基之一的必需轉(zhuǎn)位活性的任何應(yīng)用是優(yōu)選的SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優(yōu)選SecA亞基。有利的應(yīng)用在于進(jìn)行根據(jù)(b)的消除，其通過(guò)與失活的內(nèi)源性存在的必需轉(zhuǎn)位活性相同的活性進(jìn)行消除，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)的活性，特別優(yōu)選通過(guò)同一活性。為此，本申請(qǐng)能夠獲得一些合適的優(yōu)選起點(diǎn)，即，提及的應(yīng)用是可能的，其特征特別在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)來(lái)自枯草桿菌、大腸桿菌或地衣芽孢桿菌的基因secA的修復(fù)轉(zhuǎn)位活性的區(qū)域進(jìn)行，其分別顯示在SEQIDNO1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表中。特別有利的應(yīng)用特征在于根據(jù)(b)的載體是在微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。另外優(yōu)選的應(yīng)用特征在于質(zhì)粒是多于一個(gè)的拷貝數(shù)、優(yōu)選多重拷貝數(shù)的質(zhì)粒。最后本發(fā)明還通過(guò)提供有合適的載體而實(shí)現(xiàn)。因此攜帶必需轉(zhuǎn)位活性基因和能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的載體是想要的，但是，如果其作為單個(gè)的轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)，則不編碼抗生素抗性。在抗生素抗性的基因是除了根據(jù)本發(fā)明消除必需轉(zhuǎn)位活性失活的基因之外僅有的轉(zhuǎn)基因的情況下，排除該抗性基因目的是為了不在技術(shù)上對(duì)本申請(qǐng)加以限制。只有在現(xiàn)有技術(shù)中，準(zhǔn)確地講這些是已經(jīng)描述與根據(jù)本發(fā)明能被使用的轉(zhuǎn)位蛋白的特征有關(guān)，才予以考慮。當(dāng)然這還包括現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)最普遍的克隆載體已經(jīng)測(cè)序和克隆的基因，準(zhǔn)確地講是那些包含抗生素抗性基因作為標(biāo)記的載體。因此，只包含必需轉(zhuǎn)位酶和抗生素標(biāo)記的載體是現(xiàn)有技術(shù)已知的。對(duì)應(yīng)于上文所述，根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選特征在于其上包含的轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，編碼藥理學(xué)相關(guān)的非酶蛋白或水解酶或氧化還原酶。這些特征在于待表達(dá)的基因具備起作用的啟動(dòng)子。當(dāng)然，本發(fā)明中所有這類(lèi)構(gòu)造體被包括在保護(hù)范圍內(nèi)，其也可編碼藥理學(xué)有利的因子，假定這些載體的存在不通過(guò)該性質(zhì)選擇，而是通過(guò)必需轉(zhuǎn)位活性選擇時(shí)，其可以介導(dǎo)抗生素抗性。根據(jù)選擇體系的細(xì)節(jié)，某些載體還代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。這些包括特性在于其編碼的轉(zhuǎn)位活性能夠消除內(nèi)源性存在于微生物菌株中失活的必需轉(zhuǎn)位活性的適當(dāng)載體，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)活性，特別優(yōu)選通過(guò)同一活性。進(jìn)一步優(yōu)選，這些包括其特性在于必需的轉(zhuǎn)位活性是以下因子之一的適當(dāng)載體SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。其中，特性在于必需的轉(zhuǎn)位活性是蛋白前體轉(zhuǎn)位酶的以下亞基之一的載體是優(yōu)選的SecA、SecY、SecE、secD或SecF，優(yōu)選SecA亞基。根據(jù)本申請(qǐng)的教導(dǎo)，進(jìn)一步優(yōu)選的載體特性在于必需的轉(zhuǎn)位活性是來(lái)自枯草桿菌、大腸桿菌或地衣芽孢桿菌secA基因之一，分別顯示在SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表中。此外，若質(zhì)粒是在使用的微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒，這是根據(jù)本發(fā)明載體的有利性質(zhì)。就此而論，尤其是由于基因劑量效應(yīng)，如果質(zhì)粒特征在于它們是多于一個(gè)、優(yōu)選多重拷貝數(shù)質(zhì)粒的情況是特別有利的。實(shí)施例所有的分子生物學(xué)操作遵循標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在如Fritsch，Sambrook和Maniatis的″Molecularcloningalaboratorymanual″，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1989，和可比較的相關(guān)論文中表明的方法。根據(jù)各個(gè)生產(chǎn)商詳述使用酶和試劑盒。實(shí)施例1來(lái)自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的secA基因的分離地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)中secA位點(diǎn)的鑒定為鑒定地衣芽孢桿菌的secA/prfB位點(diǎn)，借助于枯草桿菌prfB-secA基因位點(diǎn)的已知序列通過(guò)PCR得到基因探針(Databank″Subtilist″ofthePasteurInstitute，25，28rueduDocteurRoux，75724ParisCEDEX15，F(xiàn)rance；http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/；日期2002年8月16日)。該基因位點(diǎn)還顯示于圖2。獲得的探針長(zhǎng)3113bp，并另外包括prfB基因氨基末端區(qū)域的開(kāi)始451bp。隨后，制備地衣芽孢桿菌的染色體DNA，其可從例如DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，38124Brunswick(http//www.dsmz.de)序號(hào)13獲得，并作為對(duì)照，枯草桿菌的染色體DNA使用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化，并使用提及的探針進(jìn)行Southern雜交。在用限制性?xún)?nèi)切酶MunI處理的地衣芽孢桿菌染色體DNA上，鑒定出大小約5.5kB的單個(gè)片段，而使用MunI消化地衣芽孢桿菌的染色體DNA產(chǎn)生地衣芽孢桿菌的期望的片段。來(lái)自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)DSM13的鑒定區(qū)域的克隆分離相同株系地衣芽孢桿菌的染色體DNA，預(yù)先使用MunI消化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離大約5.5kB的DNA片段，使用商業(yè)上可獲得的試劑盒從中提取核酸。MunI切割獲得的DNA片段的混合物被連接在與MunI匹配的低拷貝數(shù)載體pHSG575的EcoRI切割位置(在Gene(1987)，Volume61，pages(63-74)中S.Takeshita；M.Sato；M.Toba；W.Masahashi；T.Hashimoto-Gotoh的″High-copy-numberandlow-copy-numbervectorsforlaczalpha-complementationandchloramphenicol-orkanamycin-resistanceselection″)并轉(zhuǎn)化成大腸桿菌JM109(從Promega，Mannheim，Germany得到)。進(jìn)行載體編碼的抗性選擇。另外，藍(lán)/白篩選方法(含80μg/mlX-Gal的選擇板)被用于鑒定包含具有插入物載體的克隆。在該方法中獲得200個(gè)克隆，其中有可能通過(guò)集落雜交鑒定5個(gè)攜帶地衣芽孢桿菌secA基因的克隆。通過(guò)新鮮的Southern印跡分析使用如上所述的探針進(jìn)行核對(duì)，來(lái)源于包含攜帶地衣芽孢桿菌secA基因的MunI片段的pHSG575并包括5.5kB的載體的名稱(chēng)為pHMH1。限制性分析克隆的5.5kB區(qū)域首先通過(guò)限制性作圖來(lái)確定其特征。為此，使用不同的酶進(jìn)行pHMH1的單獨(dú)消化和雙消化，并通過(guò)Southern印跡分析鑒定那些攜帶secA/prfB操縱子部分的片段。由此限制性作圖的結(jié)果補(bǔ)充在5.5kB片段的完整序列之后(見(jiàn)下文)，并可以見(jiàn)于圖3。序列分析圖3顯示的5.5kB大小的片段根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)序到子序列。子序列顯示與以下來(lái)自枯草芽孢桿菌的基因具有強(qiáng)的同源性fliT(編碼鞭毛蛋白)、orf189/yvyD(功能未知)、secA(轉(zhuǎn)位酶結(jié)合亞基；ATP酶)和prfB(肽鏈釋放因子2)，與枯草芽孢桿菌具有完全相同的基因序列。這些同樣顯示于圖3。根據(jù)這些值，還可以假定來(lái)自地衣芽孢桿菌的SecA與來(lái)自枯草芽孢桿菌的SecA發(fā)揮相同的生化活性，并且從而承擔(dān)相同的生理功能。因此它被認(rèn)為是轉(zhuǎn)位所必需的酶。根據(jù)該實(shí)施例確定從此派生的DNA序列和氨基酸序列在SEQIDNO.5或6中給出。因此，翻譯在154位開(kāi)始，并且在2677到2679位為終止密碼子。從60到65位或從77到82位的子序列推測(cè)上被認(rèn)為是啟動(dòng)子區(qū)域，138到144位推測(cè)為核糖體結(jié)合位。實(shí)施例2含secA基因和枯草桿菌蛋白酶基因的質(zhì)粒的制備根據(jù)實(shí)施例1獲得的secA基因使用其自己的啟動(dòng)子通過(guò)PCR從地衣芽孢桿菌的染色體DNA開(kāi)始擴(kuò)增。為此，如圖4所示，借助于地衣芽孢桿菌基因的DNA序列選擇引物，其在各自的5’端具有BamHI限制酶切位點(diǎn)。通過(guò)這種方法，使用這些引物擴(kuò)增多片段被克隆到質(zhì)粒pCB56C的酶切位置處。這在專(zhuān)利申請(qǐng)WO91/02792A1中描述，并且包含來(lái)自緩慢芽孢桿菌(BLAP)的堿性蛋白酶基因。該克隆策略還顯示于圖4，產(chǎn)生大小為8319bp的pCB56CsecA載體，除了secA和BLAP基因外，還包含一個(gè)編碼四環(huán)素抗性的基因。載體pCB56CsecA和用于對(duì)照的起始載體pCB56C被轉(zhuǎn)化進(jìn)地衣芽孢桿菌，主要是pCB56C轉(zhuǎn)化進(jìn)能形成SecA的野生型地衣芽孢桿菌(secA)株系中。就pCB56CsecA而言，進(jìn)行轉(zhuǎn)化以同時(shí)失活內(nèi)源的secA。該方法描述于實(shí)施例3。在該方式中，獲得兩個(gè)菌株地衣芽孢桿菌(ΔSecA)pCB56CsecA和地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C，兩種都能表達(dá)質(zhì)粒編碼的堿性蛋白酶基因。它們?cè)趯?shí)施例4中進(jìn)一步研究。實(shí)施例3地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA菌株的制備通過(guò)刪除載體完成secA基因的關(guān)閉。該方法遵循J.Vehmaanper_等(1991)在J.Biotechnol.，Volume19，221-240頁(yè)的描述。選擇用于secA刪除的載體是在相同出版物中描述的pE194質(zhì)粒。該刪除載體的優(yōu)點(diǎn)在于它具有溫度依賴(lài)性的復(fù)制起點(diǎn)。在33℃時(shí)，pE194可以在細(xì)胞中復(fù)制，從而在該溫度首先選擇成功的轉(zhuǎn)化。隨后，包含該載體的細(xì)胞在42℃溫育。在這個(gè)溫度下，刪除載體不再?gòu)?fù)制，且通過(guò)兩個(gè)同源區(qū)域(secA的上游和下游區(qū)域)中的一個(gè)對(duì)質(zhì)粒整合到染色體中的整合作用施加選擇壓力。通過(guò)另一個(gè)(第二)同源區(qū)域的另外同源重組導(dǎo)致secA的刪除。第一個(gè)同源區(qū)域的重復(fù)重組也是可能的。就此而論，載體再次與染色體重組，因此保持染色體的secA。因此secA刪除必需在使用酶限制性消化染色體DNA或借助于PCR技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增區(qū)域的尺寸以后在Southern印跡中檢測(cè)。為構(gòu)建刪除載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增位于secA上游和下游的區(qū)域。擴(kuò)增用的引物和隨后克隆用的限制性酶切位點(diǎn)(XbaI和EcoRV)與這些借助于根據(jù)實(shí)施例1確定的地衣芽孢桿菌secA/prfB位點(diǎn)的DNA序列的選擇有關(guān)。就SecA刪除而言，應(yīng)該考慮到位于secA下游的prfB與secA處于同一操縱子，也就是說(shuō)沒(méi)有其自己的啟動(dòng)子(比較圖2)。prfB編碼RF2蛋白，其與蛋白生物合成保證蛋白從核糖體的脫離有關(guān)。為保證prfB的轉(zhuǎn)錄，其對(duì)蛋白生物合成是重要的，甚至在SecA刪除以后，orf189與其位于secA和下游的secA啟動(dòng)子之前的自己的終止子被擴(kuò)增，因此prfB可以在secA刪除以后直接從secA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄(圖5)。在對(duì)照步驟中，擴(kuò)增的區(qū)域(orf189′和prfB′)被克隆到大腸桿菌載體pBBRMCS2中。隨后orf189′prfB′構(gòu)建體的測(cè)序表明擴(kuò)增片段的克隆是正確的。在下一步orf189′prfB′構(gòu)建體被重克隆到選擇用于刪除的枯草芽孢桿菌DB104的pE194載體中(圖6)。關(guān)于這點(diǎn)，使用根據(jù)Chang&Cohen，1979的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，獲得攜帶刪除載體pEorfprfB的轉(zhuǎn)化體。所有的操作在33℃下進(jìn)行以保證載體的復(fù)制。在下一步，實(shí)施例2描述的pCB56CsecA載體被同樣地通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化進(jìn)攜帶pEorfprfB質(zhì)粒的地衣芽孢桿菌宿主菌株中。如此獲得和使用常規(guī)方法鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化體隨后在42℃時(shí)在選擇壓力(對(duì)pCB56CsecA的四環(huán)素和對(duì)pEorfprfB的紅霉素)下選擇兩個(gè)質(zhì)粒的存在。在該溫度下，刪除載體不再?gòu)?fù)制，只有其中載體整合到染色體上的細(xì)胞存活，該整合作用在同源或相同區(qū)域以最高概率發(fā)生。通過(guò)在33℃時(shí)無(wú)紅霉素選擇壓力下培養(yǎng)，隨后可誘導(dǎo)刪除載體的切除，染色體編碼的secA基因完全從染色體除去。pCB56CsecA質(zhì)粒保留在細(xì)胞中，其介導(dǎo)枯草桿菌蛋白酶合成的能力以及使必需的轉(zhuǎn)位因子secA可以利用。用這樣的方式獲得的菌株命名為地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA。實(shí)施例4質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究為鑒定攜帶secA枯草桿菌蛋白酶質(zhì)粒pCB56CsecA的遺傳穩(wěn)定性，根據(jù)實(shí)施例2和3獲得的兩個(gè)菌株地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C和地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA在不添加抗生素的條件下在搖瓶實(shí)驗(yàn)中的液體培養(yǎng)基中的研究。為此，各自從一個(gè)單獨(dú)的克隆開(kāi)始，在所有情況下過(guò)夜培養(yǎng)并使用該14mlLB培養(yǎng)基(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)配方)在600nm(OD600)光密度為0.05接種。在100mlErlenmeyer搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在各種情況下8-16小時(shí)后，培養(yǎng)物被接種到14ml新鮮的培養(yǎng)基中，并在其中依次設(shè)定OD600為0.05。培養(yǎng)進(jìn)行8晝夜，在該方法中培養(yǎng)物被接種共計(jì)16次。每天，稀釋液系列被平板涂布，隨機(jī)選擇獲得的克隆轉(zhuǎn)入到蛋白酶檢測(cè)平板中。結(jié)果顯示于表2和圖7。表2轉(zhuǎn)化子地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C(對(duì)照)和地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA的質(zhì)粒穩(wěn)定性，借助于具有蛋白酶活性克隆的各自比例進(jìn)行檢測(cè)對(duì)各培養(yǎng)時(shí)間而言，全部地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA菌株的克隆顯示蛋白酶活性，而地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C單獨(dú)的克隆不再具有任何蛋白酶活性。這被解釋為pCB56C質(zhì)粒的丟失，該丟失另外通過(guò)質(zhì)粒微制備來(lái)核對(duì)。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，因此可明確在沒(méi)有添加抗生素，尤其是沒(méi)有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上，該質(zhì)粒給予對(duì)所述抗生素的抗性，攜帶secA枯草桿菌蛋白酶的pCB56CsecA質(zhì)粒在ΔsecA菌株中是穩(wěn)定的，而枯草桿菌蛋白酶pCB56C質(zhì)粒在沒(méi)有染色體secA刪除的菌株中在培養(yǎng)過(guò)程中丟失。來(lái)自地衣芽孢桿菌的secA基因可以因此消除染色體secA在轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體中的不足，且用這樣的方式可以選擇表達(dá)另外蛋白基因的細(xì)菌培養(yǎng)，在這種情況下為堿性蛋白酶。序列表<110>漢高兩合股份公司<120>用作選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)位酶<130>SCT053012-46<140><141><150>DE10309557.8<151>2003-03-04<160>6<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>4148<212>DNA<213>Bacillussubtilis<220><221>CDS<222>(544)..(3069)<400>1gtccgaggtgcataacgaggatatgtacaacgcaattgatctcgcaacaaacaaactgga60acgtcaaatccgtaagcataaaacgaaagtaaaccgtaaattccgtgagcagggctctcc120aaaatatttattggcaaacggtcttggctctgatacagatattgcggttcaggatgacat180agaagaggaggagagcttggacatcgtccgtcagaaacgctttaatttaaagccgatgga240tagtgaagaagcgatcttgcaaatgaatatgctcggccataatttctttgttttcacaaa300tgcggaaacaaaccttacaaatgtcgtgtaccgcagaaatgacgggaaatatggcttaat360tgaaccgactgaataatgaagagaagccttccgtgatgtccgcggaaggtttttgttttt420cttatttgcaaattctttggaaataacaaaaggtatgatatgataatgagaggtatacat480ggactagtaaattatttatacatgcctctaaaataggcgtgtgatgatagaggagcgtta540taaatgcttggaattttaaataaaatgtttgatccaacaaaacgtacg588MetLeuGlyIleLeuAsnLysMetPheAspProThrLysArgThr151015ctgaatagatacgaaaaaattgctaacgatattgatgcgattcgcgga636LeuAsnArgTyrGluLysIleAlaAsnAspIleAspAlaIleArgGly202530gactatgaaaatctctctgacgacgcattgaaacataaaacaattgaa684AspTyrGluAsnLeuSerAspAspAlaLeuLysHisLysThrIleGlu354045tttaaagagcgtcttgaaaaaggggcgacaacggatgatcttcttgtt732PheLysGluArgLeuGluLysGlyAlaThrThrAspAspLeuLeuVal505560gaagctttcgctgttgttcgagaagcttcacgccgcgtaacaggcatg780GluAlaPheAlaValValArgGluAlaSerArgArgValThrGlyMet657075tttccgtttaaagtccagctcatggggggcgtggcgcttcatgacgga828PheProPheLysValGlnLeuMetGlyGlyValAlaLeuHisAspGly80859095aatatagcggaaatgaaaacaggggaagggaaaacattaacgtctacc876AsnIleAlaGluMetLysThrGlyGluGlyLysThrLeuThrSerThr100105110ctgcctgtttatttaaatgcgttaaccggtaaaggcgtacacgtcgtg924LeuProValTyrLeuAsnAlaLeuThrGlyLysGlyValHisValVal115120125actgtcaacgaatacttggcaagccgtgacgctgagcaaatggggaaa972ThrValAsnGluTyrLeuAlaSerArgAspAlaGluGlnMetGlyLys130135140attttcgagtttctcggtttgactgtcggtttgaatttaaactcaatg1020IlePheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyLeuAsnLeuAsnSerMet145150155tcaaaagacgaaaaacgggaagcttatgccgctgatattacttactcc1068SerLysAspGluLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyrSer160165170175acaaacaacgagcttggcttcgactatttgcgtgacaatatggttctt1116ThrAsnAsnGluLeuGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetValLeu180185190tataaagagcagatggttcagcgcccgcttcattttgcggtaatagat1164TyrLysGluGlnMetValGlnArgProLeuHisPheAlaValIleAsp195200205gaagttgactctattttaattgatgaagcaagaacaccgcttatcatt1212GluValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIleIle210215220tctggacaagctgcaaaatccactaagctgtacgtacaggcaaatgct1260SerGlyGlnAlaAlaLysSerThrLysLeuTyrValGlnAlaAsnAla225230235tttgtccgcacgttaaaagcggagaaggattacacgtacgatatcaaa1308PheValArgThrLeuLysAlaGluLysAspTyrThrTyrAspIleLys240245250255acaaaagctgtacagcttactgaagaaggaatgacgaaggcggaaaaa1356ThrLysAlaValGlnLeuThrGluGluGlyMetThrLysAlaGluLys260265270gcattcggcatcgataacctctttgatgtgaagcatgtcgcgctcaac1404AlaPheGlyIleAspAsnLeuPheAspValLysHisValAlaLeuAsn275280285caccatatcaaccaggccttaaaagctcacgttgcgatgcaaaaggac1452HisHisIleAsnGlnAlaLeuLysAlaHisValAlaMetGlnLysAsp290295300gttgactatgtagtggaagacggacaggttgttattgttgattccttc1500ValAspTyrValValGluAspGlyGlnValValIleValAspSerPhe305310315acgggacgtctgatgaaaggccgccgctacagtgaggggcttcaccaa1548ThrGlyArgLeuMetLysGlyArgArgTyrSerGluGlyLeuHisGln320325330335gcgattgaagcaaaggaagggcttgagattcaaaacgaaagcatgacc1596AlaIleGluAlaLysGluGlyLeuGluIleGlnAsnGluSerMetThr340345350ttggcgacgattacgttccaaaactacttccgaatgtacgaaaaactt1644LeuAlaThrIleThrPheGlnAsnTyrPheArgMetTyrGluLysLeu355360365gccggtatgacgggtacagctaagacagaggaagaagaattccgcaac1692AlaGlyMetThrGlyThrAlaLysThrGluGluGluGluPheArgAsn370375380atctacaacatgcaggttgtcacgatccctaccaacaggcctgttgtc1740IleTyrAsnMetGlnValValThrIleProThrAsnArgProValVal385390395cgtgatgaccgcccggatttaatttaccgcacgatggaaggaaagttt1788ArgAspAspArgProAspLeuIleTyrArgThrMetGluGlyLysPhe400405410415aaggcagttgcggaggatgtcgcacagcgttacatgacgggacagcct1836LysAlaValAlaGluAspValAlaGlnArgTyrMetThrGlyGlnPro420425430gttctagtcggtacggttgccgttgaaacatctgaattgatttctaag1884ValLeuValGlyThrValAlaValGluThrSerGluLeuIleSerLys435440445ctgcttaaaaacaaaggaattccgcatcaagtgttaaatgccaaaaac1932LeuLeuLysAsnLysGlyIleProHisGlnValLeuAsnAlaLysAsn450455460catgaacgtgaagcgcagatcattgaagaggccggccaaaaaggcgca1980HisGluArgGluAlaGlnIleIleGluGluAlaGlyGlnLysGlyAla465470475gttacgattgcgactaacatggcggggcgcggaacggacattaagctt2028ValThrIleAlaThrAsnMetAlaGlyArgGlyThrAspIleLysLeu480485490495ggcgaaggtgtaaaagagcttggcgggctcgctgtagtcggaacagaa2076GlyGluGlyValLysGluLeuGlyGlyLeuAlaValValGlyThrGlu500505510cgacatgaatcacgccggattgacaatcagcttcgaggtcgttccgga2124ArgHisGluSerArgArgIleAspAsnGlnLeuArgGlyArgSerGly515520525cgtcagggagacccggggattactcaattttatctttctatggaagat2172ArgGlnGlyAspProGlyIleThrGlnPheTyrLeuSerMetGluAsp530535540gaattgatgcgcagattcggagctgagcggacaatggcgatgcttgac2220GluLeuMetArgArgPheGlyAlaGluArgThrMetAlaMetLeuAsp545550555cgcttcggcatggacgactctactccaatccaaagcaaaatggtatct2268ArgPheGlyMetAspAspSerThrProIleGlnSerLysMetValSer560565570575cgcgcggttgaatcgtctcaaaaacgcgtcgaaggcaataacttcgat2316ArgAlaValGluSerSerGlnLysArgValGluGlyAsnAsnPheAsp580585590tcgcgtaaacagcttctgcaatatgatgatgttctccgccagcagcgt2364SerArgLysGlnLeuLeuGlnTyrAspAspValLeuArgGlnGlnArg595600605gaggtcatttataagcagcgctttgaagtcattgactctgaaaacctg2412GluValIleTyrLysGlnArgPheGluValIleAspSerGluAsnLeu610615620cgtgaaatcgttgaaaatatgatcaagtcttctctcgaacgcgcaatt2460ArgGluIleValGluAsnMetIleLysSerSerLeuGluArgAlaIle625630635gcagcctatacgccaagagaagagcttcctgaggagtggaagcttgac2508AlaAlaTyrThrProArgGluGluLeuProGluGluTrpLysLeuAsp640645650655ggtctagttgatcttatcaacacaacttatcttgatgaaggtgcactt2556GlyLeuValAspLeuIleAsnThrThrTyrLeuAspGluGlyAlaLeu660665670gagaagagcgatatcttcggcaaagaaccggatgaaatgcttgagctc2604GluLysSerAspIlePheGlyLysGluProAspGluMetLeuGluLeu675680685attatggatcgcatcatcacaaaatataatgagaaggaagagcaattc2652IleMetAspArgIleIleThrLysTyrAsnGluLysGluGluGlnPhe690695700ggcaaagagcaaatgcgcgaattcgaaaaagttatcgttcttcgtgcc2700GlyLysGluGlnMetArgGluPheGluLysValIleValLeuArgAla705710715gttgattctaaatggatggatcatattgatgcgatggatcagctccgc2748ValAspSerLysTrpMetAspHisIleAspAlaMetAspGlnLeuArg720725730735caagggattcaccttcgtgcttacgcgcagacgaacccgcttcgtgag2796GlnGlyIleHisLeuArgAlaTyrAlaGlnThrAsnProLeuArgGlu740745750tatcaaatggaaggttttgcgatgtttgagcatatgattgaatcaatt2844TyrGlnMetGluGlyPheAlaMetPheGluHisMetIleGluSerIle755760765gaggacgaagtcgcaaaatttgtgatgaaagctgagattgaaaacaat2892GluAspGluValAlaLysPheValMetLysAlaGluIleGluAsnAsn770775780ctggagcgtgaagaggttgtacaaggtcaaacaacagctcatcagccg2940LeuGluArgGluGluValValGlnGlyGlnThrThrAlaHisGlnPro785790795caagaaggcgacgataacaaaaaagcaaagaaagcaccggttcgcaaa2988GlnGluGlyAspAspAsnLysLysAlaLysLysAlaProValArgLys800805810815gtggttgatatcggacgaaatgccccatgccactgcggaagcgggaaa3036ValValAspIleGlyArgAsnAlaProcysHiscysGlySerGlyLys820825830aaatataaaaattgctgcggccgtactgaatagttcgccccggcaagtttact3089LysTyrLysAsncyscysGlyArgThrGlu835840gaacgcggcgcctgcaggctgcgatcttttaatgaggtgaatgaaatgaattatcagaaa3149ttagagcagagctcgaaaatatggcttctcgtttagcggactttagggggtctctttgac3209ctcgaatcaaaggaggcccgcattgctgagctagatgaacaaatggctgatccggaattc3269tggaatgatcagcaaaaagctcaaacggttataaatgaagcaaacggtttaaaggattat3329gtcaattcgtataaaaaattgaatgaatcccacgaagaattacaaatgactcatgatctt3389ttgaaagaagagccggacactgatctccagcttgagcttgaaaaagaactaaagtcatta3449acaaaagagttcaatgagtttgagcttcagcttcttctcagcgagccgtatgataaaaat3509aacgcgattttagaactgcaccctggtgctggcggtacagagtcacaggactggggctct3569atgcttcttagaatgtatacaagatggggagagcgccgcggctttaaagtagagactctc3629gattaccttccaggtgacgaggcgggaatcaagtcagtgacattgctcatcaaaggacac3689aacgcttacgggtatctcaaagcagaaaaaggtgttcatcgtcttgtgcggatctcacca3749tttgattcatcaggccgccgccacacatctttcgtttcatgtgaagtcatgcctgaattt3809aacgatgaaattgatattgatattcgtacggaggatattaaagttgacacgtaccgtgca3869agcggcgcgggcggacagcacgtcaatacgacggattcagccgttcggattactcacttg3929ccgacgaacgtagttgtgacatgccaaacggagcgctcacaaattaaaaaccgtgaaaga3989gccatgaaaatgctgaaggccaagctgtatcagcgcagaattgaagagcagcaggcagag4049ctggatgaaattcgcggtgaacaaaaagaaatcggctggggcagccaaatccgttcttat4109gtattccatccgtattccatggtaaaagaccatcgggac4148<210>2<211>841<212>PRT<213>Bacillussubtilis<400>2MetLeuGlyIleLeuAsnLysMetPheAspProThrLysArgThrLeu151015AsnArgTyrGluLysIleAlaAsnAspIleAspAlaIleArgGlyAsp202530TyrGluAsnLeuSerAspAspAlaLeuLysHisLysThrIleGluPhe354045LysGluArgLeuGluLysGlyAlaThrThrAspAspLeuLeuValGlu505560AlaPheAlaValValArgGluAlaSerArgArgValThrGlyMetPhe65707580ProPheLysValGlnLeuMetGlyGlyValAlaLeuHisAspGlyAsn859095IleAlaGluMetLysThrGlyGluGlyLysThrLeuThrSerThrLeu100105110ProValTyrLeuAsnAlaLeuThrGlyLysGlyValHisValValThr115120125ValAsnGluTyrLeuAlaSerArgAspAlaGluGlnMetGlyLysIle130135140PheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyLeuAsnLeuAsnSerMetSer145150155160LysAspGluLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyrSerThr165170175AsnAsnGluLeuGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetValLeuTyr180185190LysGluGlnMetValGlnArgProLeuHisPheAlaValIleAspGlu195200205ValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIleIleSer210215220GlyGlnAlaAlaLysSerThrLysLeuTyrValGlnAlaAsnAlaPhe225230235240ValArgThrLeuLysAlaGluLysAspTyrThrTyrAspIleLysThr245250255LysAlaValGlnLeuThrGluGluGlyMetThrLysAlaGluLysAla260265270PheGlyIleAspAsnLeuPheAspValLysHisValAlaLeuAsnHis275280285HisIleAsnGlnAlaLeuLysAlaHisValAlaMetGlnLysAspVal290295300AspTyrValValGluAspGlyGlnValValIleValAspSerPheThr305310315320GlyArgLeuMetLysGlyArgArgTyrSerGluGlyLeuHisGlnAla325330335IleGluAlaLysGluGlyLeuGluIleGlnAsnGluSerMetThrLeu340345350AlaThrIleThrPheGlnAsnTyrPheArgMetTyrGluLysLeuAla355360365GlyMetThrGlyThrAlaLysThrGluGluGluGluPheArgAsnIle370375380TyrAsnMetGlnValValThrIleProThrAsnArgProValValArg385390395400AspAspArgProAspLeuIleTyrArgThrMetGluGlyLy5PheLys405410415AlaValAlaGluAspValAlaGlnArgTyrMetThrGlyGlnProVal420425430LeuValGlyThrValAlaValGluThrSerGluLeuIleSerLysLeu435440445LeuLysAsnLysGlyIleProHisGlnValLeuAsnAlaLysAsnHis450455460GluArgGluAlaGlnIlerleGluGluAlaGlyGlnLysGlyAlaVal465470475480ThrIleAlaThrAsnMetAlaGlyArgGlyThrAspIleLysLeuGly485490495GluGlyValLysGluLeuGlyGlyLeuAlaValValGlyThrGluArg500505510HisGluSerArgArgIleAspAsnGlnLeuArgGlyArgSerGlyArg515520525GlnGlyAspProGlyIleThrGlnPheTyrLeuSerMetGluAspGlu530535540LeuMetArgArgPheGlyAlaGluArgThrMetAlaMetLeuAspArg545550555560PheGlyMetAspAspSerThrProIleGlnSerLysMetValSerArg565570575AlaValGluSerSerGlnLysArgValGluGlyAsnAsnPheAspSer580585590ArgLysGlnLeuLeuGlnTyrAspAspValLeuArgGlnGlnArgGlu595600605ValIleTyrLysGlnArgPheGluValIleAspSerGluAsnLeuArg610615620GluIleValGluAsnMetIleLysSerSerLeuGluArgAlaIleAla625630635640AlaTyrThrProArgGluGluLeuProGluGluTrpLysLeuAspGly645650655LeuValAspLeuIleAsnThrThrTyrLeuAspGluGlyAlaLeuGlu660665670LysSerAspIlePheGlyLysGluProAspGluMetLeuGluLeuIle675680685MetAspArgIleIleThrLysTyrAsnGluLysGluGluGlnPheGly690695700LysGluGlnMetArgGluPheGluLysValIleValLeuArgAlaVal705710715720AspSerLysTrpMetAspHisIleAspAlaMetAspGlnLeuArgGln725730735GlyIleHisLeuArgAlaTyrAlaGlnThrAsnProLeuArgGluTyr740745750GlnMetGluGlyPheAlaMetPheGluHisMetIleGluSerIleGlu755760765AspGluValAlaLysPheValMetLysAlaGluIleGluAsnAsnLeu770775780GluArgGluGluValValGlnGlyGlnThrThrAlaHisGlnProGln785790795800GluGlyAspAspAsnLysLysAlaLysLysAlaProValArgLysVal805810815ValAspIleGlyArgAsnAlaProCysHisCysGlySerGlyLysLys820825830TyrLysAsnCysCysGlyArgThrGlu835840<210>3<211>2706<212>DNA<213>Escherichiacoli<220><221>CDS<222>(1)..(2706)<400>3atgctaatcaaattattaactaaagttttcggtagtcgtaacgatcgc48MetLeuIleLysLeuLeuThrLysValPheGlySerArgAsnAspArg151015accctgcgccggatgcgcaaagtggtcaacatcatcaatgccatggaa96ThrLeuArgArgMetArgLysValValAsnIleIleAsnAlaMetGlu202530ccggagatggaaaaactctccgacgaagaactgaaagggaaaaccgca144ProGluMetGluLysLeuSerAspGluGluLeuLysGlyLysThrAla354045gagtttcgtgcgcgtctggaaaaaggcgaagtgctggaaaatctgatc192GluPheArgAlaArgLeuGluLysGlyGluValLeuGluAsnLeuIle505560ccggaagctttcgccgtggtgcgtgaggcaagtaagcgcgtctttggt240ProGluAlaPheAlaValValArgGluAlaSerLysArgValPheGly65707580atgcgtcacttcgacgttcagttactcggcggtatggttcttaacgaa288MetArgHisPheAspValGlnLeuLeuGlyGlyMetValLeuAsnGlu859095cgctgcatcgccgaaatgcgtaccggtgaaggtaaaaccctgaccgca336ArgCysIleAlaGluMetArgThrGlyGluGlyLysThrLeuThrAla100105110acgctgcctgcttacctgaacgcactaaccggtaaaggcgtacacgta384ThrLeuProAlaTyrLeuAsnAlaLeuThrGlyLysGlyValHisVal115120125gttaccgtcaacgactacctggcgcaacgtgacgccgaaaacaaccgt432ValThrValAsnAspTyrLeuAlaGlnArgAspAlaGluAsnAsnArg130135140ccgctgtttgaattccttggcctgactgtcggtatcaacctgccgggc480ProLeuPheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyIleAsnLeuProGly145150155160atgccagcaccggcaaagcgtgaagcctacgctgctgacatcacttac528MetProAlaProAlaLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyr165170175ggtacgaacaacgaatacggctttgactacctgcgcgacaacatggca576GlyThrAsnAsnGluTyrGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetAla180185190ttcagccctgaagaacgtgtacaacgtaaactgcactatgcgctggtg624PheSerProGluGluArgValGlnArgLysLeuHisTyrAlaLeuVal195200205gacgaagtggactccatcctcatcgatgaagcgcgtacaccgctgatc672AspGluValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIle210215220atttccggcccagcagaagacagctcggaaatgtataaacgcgtgaat720IleSerGlyProAlaGluAspSerSerGluMetTyrLysArgValAsn225230235240aaaattattccgcacctgatccgtcaggaaaaagaagactccgaaacc768LysIleIleProHisLeuIleArgGlnGluLysGluAspSerGluThr245250255ttccagggcgaaggccacttctcggtggatgaaaaatctcgccaggtg816PheGlnGlyGluGlyHisPheSerValAspGluLysSerArgGlnVal260265270aacctgaccgaacgtggtctggttctgattgaagaactgctggttaaa864AsnLeuThrGluArgGlyLeuValLeuIleGluGluLeuLeuValLys275280285gaaggcatcatggatgaaggtgagtctctgtactctccggccaacatc912GluGlyIleMetAspGluGlyGluSerLeuTyrSerProAlaAsnIle290295300atgctgatgcaccacgtaacggcggcgctgcgcgctcatgcgctgttt960MetLeuMetHisHisValThrAlaAlaLeuArgAlaHisAlaLeuPhe305310315320acccgcgacgtcgactacatcgttaaagatggtgaagttatcatcgtt1008ThrArgAspValAspTyrIleValLysAspGlyGluValIleIleVal325330335gacgaacacaccggtcgtaccatgcagggccgtcgctggtccgatggt1056AspGluHisThrGlyArgThrMetGlnGlyArgArgTrpSerAspGly340345350ctgcaccaggctgtggaagcgaaagaaggtgtgcagatccagaacgaa1104LeuHisGlnAlaValGluAlaLysGluGlyValGlnIleGlnAsnGlu355360365aaccagacgctggcttcgatcaccttccagaactacttccgtctgtat1152AsnGlnThrLeuAlaSerIleThrPheGlnAsnTyrPheArgLeuTyr370375380gaaaaactggcggggatgactggtactgctgataccgaagctttcgaa1200GluLysLeuAlaGlyMetThrGlyThrAlaAspThrGluAlaPheGlu385390395400ttcagctccatctataagctggatactgtcgttgttccgaccaaccgt1248PheSerSerIleTyrLysLeuAspThrValValValProThrAsnArg405410415ccaatgattcgtaaagatctgccggacctggtctacatgactgaagcg1296ProMetIleArgLysAspLeuProAspLeuValTyrMetThrGluAla420425430gaaaaaattcaggcgatcattgaagatatcaaagaacgtactgcgaaa2344GluLysIleGlnAlaIleIleGluAspIleLysGluArgThrAlaLys435440445ggccagccggtgctggtgggtacaatctccatcgaaaaatcggagctg1392GlyGlnProValLeuValGlyThrIleSerIleGluLysSerGluLeu450455460gtgtcaaatgaactgaccaaagccggtattaagcacaacgtcctgaac1440ValSerAsnGluLeuThrLysAlaGlyIleLysHisAsnValLeuAsn465470475480gccaaattccatgccaacgaagcggcgattgttgctcaggcaggttat1488AlaLysPheHisAlaAsnGluAlaAlaIleValAlaGlnAlaGlyTyr485490495ccggctgcggtgactatcgcgaccaacatggcgggtcgtggtaccgat1536ProAlaAlaValThrIleAlaThrAsnMetAlaGlyArgGlyThrAsp500505510attgtgctcggtggtagctggcaggcagaagttgccgcgctggaaaat1584IleValLeuGlyGlySerTrpGlnAlaGluValAlaAlaLeuGluAsn515520525ccgactgcagagcaaattgaaaaaattaaagccgactggcaggtacgt1632ProThrAlaGluGlnIleGluLysIleLysAlaAspTrpGlnValArg530535540cacgatgcggtactggcagcaggtggcctgcatatcatcggtactgaa1680HisAspAlaValLeuAlaAlaGlyGlyLeuHisIleIleGlyThrGlu545550555560cgtcacgaatcccgtcgtatcgatasccagctgcgcggtcgttctggt1728ArgHisGluSerArgArgIleAspAsnGlnLeuArgGlyArgSerGly565570575cgtcagggggatgctggttcttctcgtttctacctgtcgatggaagat1776ArgGlnGlyAspAlaGlySerSerArgPheTyrLeuSerMetGluAsp580585590gcgctgatgcgtatttttgcttccgaccgagtatccggcatgatgcgt1824AlaLeuMetArgIlePheAlaSerAspArgValSerGlyMetMetArg595600605aaactgggtatgaagccaggcgaagccattgagcacccgtgggtgacc1872LysLeuGlyMetLysProGlyGluAlaIleGluHisProTrpValThr610615620aaagcgattgccaacgcccagcgtaaagttgaaagccgtaacttcgac1920LysAlaIleAlaAsnAlaGlnArgLysValGluSerArgAsnPheAsp625630635640attcgtaagcaactgctggaatatgatgacgtggctaacgatcagcgt1968IleArgLysGlnLeuLauGluTyrAspAspValAlaAsnAspGlnArg645650655cgcgccatttactcccagcgtaacgaactgctggatgtcagcgatgtg2016ArgAlaIleTyrSerGlnArgAsnGluLeuLeuAspValSerAspVal660665670agcgaaaccatcaacagcattcgtgaagatgtgttcaaagcgaccatt2064SerGluThrIleAsnSerIleArgGluAspValPheLysAlaThrIle675680685gatgcctacattccgccacagtcgctggaagaaatgtgggatattccg2112AspAlaTyrIleProProGlnSerLeuGluGluMetTrpAspIlePro690695700gggctgcaggaacgtctgaagaacgatttcgacctcgatttgccaatt2160GlyLeuGlnGluArgLeuLysAsnAspPheAspLeuAspLeuProIle705710715720gccgagtggctggataaagaaccagaactgcatgaagagacgctgcgt2208AlaGluTrpLeuAspLysGluProGluLeuHisGluGluThrLeuArg725730735gagcgcattctggcgcagtccatcgaagtgtatcagcgtaaagaagaa2256GluArgIleLeuAlaGlnSerIleGluValTyrGlnArgLysGluGlu740745750gtggttggtgctgagatgatgcgtcacttcgagaaaggcgtcatgctg2304ValValGlyAlaGluMetMetArgHisPheGluLysGlyValMetLeu755760765caaactctcgactctctgtggaaagagcacctggcagcgatggactat2352GlnThrLeuAspSerLeuTrpLysGluHisLeuAlaAlaMetAspTyr770775780ctgcgtcagggtatccacctgcgtggctatgcacagaaagatccgaag2400LeuArgGlnGlyIleHisLeuArgGlyTyrAlaGlnLysAspProLys785790795800caggaatacaaacgtgaatcgttctccatgtttgcagcgatgctggag2448GlnGluTyrLysArgGluSerPheSerMetPheAlaAlaMetLeuGlu805810815tcgttgaaatatgaagttatcagtacgctgagcaaagttcaggtacgt2496SerLeuLysTyrGluValIleSerThrLeuSerLysValGlnValArg820825830atgcctgaagaggttgaggagctggaacaacagcgtcgtatggaagcc2544MetProGluGluValGluGluLeuGluGlnGlnArgArgMetGluAla835840845gagcgtttagcgcaaatgcagcagcttagccatcaggatgacgactct2592GluArgLeuAlaGlnMetGlnGlnLeuSerHisGlnAspAspAspSer850855860gcagccgcagctgcactggcggcgcaaaccggtgaacgcaaagtagga2640AlaAlaAlaAlaAlaLeuAlaAlaGlnThrGlyGluArgLysValGly865870875880cgtaacgatccttgcccgtgtggttctggtaaaaaatacaagcagtgc2688ArgAsnAspProCysProCysGlySerGlyLysLysTyrLysGlnCys885890895catggccgcctgcaataa2706HisGlyArgLeuGln900<210>4<211>901<212>PRT<213>Escherichiacoli<400>4MetLeuIleLysLeuLeuThrLysValPheGlySerArgAsnAspArg151015ThrLeuArgArgMetArgLysValValAsnIleIleAsnAlaMetGlu202530ProGluMetGluLysLeuSerAspGluGluLeuLysGlyLysThrAla354045GluPheArgAlaArgLeuGluLysGlyGluValLeuGluAsnLeuIle505560ProGluAlaPheAlaValValArgGluAlaSerLysArgValPheGly65707580MetArgHisPheAspValGlnLeuLeuGlyGlyMetValLeuAsnGlu859095ArgCysIleAlaGluMetArgThrGlyGluGlyLysThrLeuThrAla100105110ThrLeuProAlaTyrLeuAsnAlaLeuThrGlyLysGlyValHisVal115120125ValThrValAsnAspTyrLeuAlaGlnArgAspAlaGluAsnAsnArg130135140ProLeuPheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyIleAsnLeuProGly145150155160MetProAlaProAlaLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyr165170175GlyThrAsnAsnGluTyrGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetAla180185190PheSerProGluGluArgValGlnArgLysLeuHisTyrAlaLeuVal195200205AspGluValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIle210215220IleSerGlyProAlaGluAspSerSerGluMetTyrLysArgValAsn225230235240LysIleIleProHisLeuIleArgGlnGluLysGluAspSerGluThr245250255PheGlnGlyGluGlyHisPheSerValAspGluLysSerArgGlnVal260265270AsnLeuThrGluArgGlyLeuValLeuIleGluGluLeuLeuValLys275280285GluGlyIleMetAspGluGlyGluSerLeuTyrSerProAlaAsnIle290295300MetLeuMetHisHisValThrAlaAlaLeuArgAlaHisAlaLeuPhe305310315320ThrArgAspValAspTyrIleValLysAspGlyGluValIleIleVal325330335AspGluHisThrGlyArgThrMetGlnGlyArgArgTrpSerAspGly340345350LeuHisGlnAlaValGluAlaLysGluGlyValGlnIleGlnAsnGlu355360365AsnGlnThrLeuAlaSerIleThrPheGlnAsnTyrPheArgLeuTyr370375380GluLysLeuAlaGlyMetThrGlyThrAlaAspThrGluAlaPheGlu385390395400PheSerSerIleTyrLysLeuAspThrValValValProThrAsnArg405410415ProMetIleArgLysAspLeuProAspLeuValTyrMetThrGluAla420425430GluLysIleGlnAlaIleIleGluAspIleLysGluArgThrAlaLys435440445GlyGlnProValLeuValGlyThrIleSerIleGluLysSerGluLeu450455460ValSerAsnGluLeuThrLysAlaGlyIleLysHisAsnValLeuAsn465470475480AlaLysPheHisAlaAsnGluAlaAlaIleValAlaGlnAlaGlyTyr485490495ProAlaAlaValThrIleAlaThrAsnMetAlaGlyArgGlyThrAsp500505510IleValLeuGlyGlySerTrpGlnAlaGluValAlaAlaLeuGluAsn515520525ProThrAlaGluGlnIleGluLysIleLysAlaAspTrpGlnValArg530535540HisAspAlaValLeuAlaAlaGlyGlyLeuHisIleIleGlyThrGlu545550555560ArgHisGluSerArgArgIleAspAsnGlnLeuArgGlyArgSerGly565570575ArgGlnGlyAspAlaGlySerSerArgPheTyrLeuserMetGluAsp580585590AlaLeuMetArgIlePheAlaSerAspArgValSerGlyMetMetArg595600605LysLeuGlyMetLysProGlyGluAlaIleGluHisProTrpValThr610615620LysAlaIleAlaAsnAlaGlnArgLysValGluSerArgAsnPheAsp625630635640IleArgLysGlnLeuLeuGluTyrAspAspValAlaAsnAspGlnArg645650655ArgAlaIleTyrSerGlnArgAsnGluLeuLeuAspValSerAspVal660665670SerGluThrIleAsnSerIleArgGluAspValPheLysAlaThrIle675680685AspAlaTyrIleProProGlnSerLeuGluGluMetTrpAspIlePro690695700GlyLeuGlnGluArgLeuLysAsnAspPheAspLeuAspLeuProIle705710715720AlaGluTrpLeuAspLysGluProGluLeuHisGluGluThrLeuArg725730735GluArgIleLeuAlaGlnSerIleGluValTyrGlnArgLysGluGlu740745750ValValGlyAlaGluMetMetArgHisPheGluLysGlyValMetLeu755760765GlnThrLeuAspSerLeuTrpLysGluHisLeuAlaAlaMetAspTyr770775780LeuArgGlnGlyIleHisLeuArgGlyTyrAlaGlnLysAspProLys785790795800GlnGluTyrLysArgGluSerPheSerMetPheAlaAlaMetLeuGlu805810815SerLeuLysTyrGluValIleSerThrLeuSerLysValGlnValArg820825830MetProGluGluValGluGluLeuGluGlnGlnArgArgMetGluAla835840845GluArgLeuAlaGlnMetGlnGlnLeuSerHisGlnAspAspAspSer850855860AlaAlaAlaAlaAlaLeuAlaAlaGlnThrGlyGluArgLysValGly865870875880ArgAsnAspProCysProCysGlySerGlyLysLysTyrLysGlnCys885890895HisGlyArgLeuGln900<210>5<211>2706<212>DNA<213>Bacilluslicheniformis<220><221>CDS<222>(154)..(2679)<400>5gatccccctcccggatcttccgcagaggggattttttccgttcccccgcggtaaattgtt60tggaaatgacaaaaggtatgatatgatattgcatatataaaaattactgtttactcatgc120ttaaacaaggaaattaaagaggagcgttattctatgcttggaattttaaataaa174MetLeuGlyIleLeuAsnLys15gtgtttgatccgacaaaacgcacgctcagccgttatgaaaagaaagcg222ValPheAspProThrLysArgThrLeuSerArgTyrGluLysLysAla101520aacgagattgatgcgctcaaggcagatatagagaagctttcagacgaa270AsnGluIleAspAlaLeuLysAlaAspIleGluLysLeuSerAspGlu253035gctttgaagcaaaagacgatcgagttcaaagagcgccttgaaaaaggc318AlaLeuLysGlnLysThrIleGluPheLysGluArgLeuGluLysGly40455055gaaacggttgacgatcttttggttgaagcgtttgccgttgtcagggaa366GluThrValAspAspLeuLeuValGluAlaPheAlaValValArgGlu606570gcttcccggcgcgtgacaggcatgtttccgtttaaggttcagctgatg414AlaSerArgArgValThrGlyMetPheProPheLysValGlnLeuMet758085gggggcgtcgcccttcatgaagggaatatcgccgaaatgaaaacgggg462GlyGlyValAlaLeuHisGluGlyAsnIleAlaGluMetLysThrGly9095100gaaggtaaaacgctgacttccacaatgcccgtttacttgaacgctctg510GluGlyLysThrLeuThrSerThrMetProValTyrLeuAsnAlaLeu105110115tcagggaaaggcgttcacgtcgtgacggtcaacgaatacctggcgagc558SsrGlyLysGlyValHisValValThrValAsnGluTyrLeuAlaSer120125130135cgcgacgctgaagagatggggaaaatctttgagtttctcgggctgacg606ArgAspAlaGluGluMetGlyLysIlePheGluPheLeuGlyLeuThr140145150gtcggcctaaacctgaacagcctgtcaaaagacgagaagcgtgaagcc654ValGlyLeuAsnLeuAsnSerLeuSerLysAspGluLysArgGluAla155160165tatgcagcagatattacgtattctacgaataatgagcttggctttgac702TyrAlaAlaAspIleThrTyrSerThrAsnAsnGluLeuGlyPheAsp170175180tacttgcgcgacaacatggtgctttataaagagcagatggttcagcgc750TyrLeuArgAspAsnMetValLeuTyrLysGluGlnMetValGlnArg185190195ccgcttcattttgcggtcatcgatgaagtcgactccattttgatcgat798ProLeuHisPheAlaValIleAspGluValAspSerIleLeuIleAsp200205210215gaagcaagaacgccgctcatcatttctggacaagcggccaaatccacc846GluAlaArgThrProLeuIleIleSerGlyGlnAlaAlaLysSerThr220225230aagctttatgttcaggccaatgcgtttgtccgcacgctaaaagcggat894LysLeuTyrValGlnAlaAsnAlaPheValArgThrLeuLysAlaAsp235240245caggactacacatacgatgtgaaaacaaaaggcgttcagctgactgaa942GlnAspTyrThrTyrAspValLysThrLysGlyValGlnLeuThrGlu250255260gaggggatgacaaaagctgaaaaggcatttggcatcgaaaacttgttt990GluGlyMetThrLysAlaGluLysAlaPheGlyIleGluAsnLeuPhe265270275gacgtccgccatgtcgccttaaaccatcatattgcccaggcgctgaaa1038AspValArgHisValAlaLeuAsnHisHisIleAlaGlnAlaLeuLys280285290295gcccatgcggcgatgcataaagacgtcgactacgtcgtcgaagacggt1086AlaHisAlaAlaMetHisLysAspValAspTyrValValGluAspGly300305310caggtcgttatcgtcgactcttttacaggccgtttgatgaaaggccgc1134GlnValValIleValAspSerPheThrGlyArgLeuMetLysGlyArg315320325cgctacagcgacggacttcaccaggccattgaagcgaaggaaggcctt1182ArgTyrSerAspGlyLeuHisGlnAlaIleGluAlaLysGluGlyLeu330335340gagatccaaaatgagagcatgacgctcgcgacgatcaccttccagaac1230GluIleGlnAsnGluSerMetThrLeuAlaThrIleThrPheGlnAsn345350355tatttccgaatgtatgaaaaattggctggaatgacgggtaccgcaaaa1278TyrPheArgMetTyrGluLysLeuAlaGlyMetThrGlyThrAlaLys360365370375acggaagaagaagaattccgcaacatctacaacatgcaggttgttacg1326ThrGluGluGluGluPheArgAsnIleTyrAsnMetGlnValValThr380385390attccgaccaacaagccgattgcccgcgatgaccgaccggatttaatt1374IleProThrAsnLysProIleAlaArgAspAspArgProAspLeuIle395400405taccggaccatggaaggaaaatttaaagctgttgcagaggatgtcgcc1422TyrArgThrMetGluGlyLysPheLysAlaValAlaGluAspValAla410415420cagcgctatatggtcggacagccggtacttgtcggtacggttgcggtt1470GlnArgTyrMetValGlyGlnProValLeuValGlyThrValAlaVal425430435gaaacatctgaattgatatcaaggctccttaaaaataaaggaatcccg1518GluThrSerGluLeuIleSerArgLeuLeuLysAsnLysGlyIlePro440445450455catcasgtgttgaacgcgaaaaaccatgagcgggaagctcagattatc1566HisGlnValLeuAsnAlaLysAsnHisGluArgGluAlaGlnIleIle460465470gaagatgccgggcaaaaaggcgcggtcaccatcgcgaccaacatggcg1614GluAspAlaGlyGlnLysGlyAlaValThrIleAlaThrAsnMetAla475480485ggccgcggaacggacatcaagcttggcgaaggtgtaaaagagcttggc1662GlyArgGlyThrAspIleLysLeuGlyGluGlyValLysGluLeuGly490495500ggactggccgtcatcggtacggaacgccatgaatcaaggcggattgac1710GlyLeuAlaValIleGlyThrGluArgHisGluSerArgArgIleAsp505510515aaccagctgcgcggacgttcaggccgtcagggggaccctggtatcacc1758AsnGlnLeuArgGlyArgSerGlyArgGlnGlyAspProGlyIleThr520525530535caattttatctgtccatggaagatgaattaatgaaacgcttcggcgca1806GlnPheTyrLeuSerMetGluAspGluLeuMetLysArgPheGlyAla540545550gagcggacgatggcgatgcttgaccgcttcggaatggacgattcgacg1854GluArgThrMetAlaMetLeuAspArgPheGlyMetAspAspSerThr555560565ccgatacagagcaagatggtttcaagagcggtcgaatcttcacagaag1902ProIleGlnSerLysMetValSerArgAlaValGluSerSerGlnLys570575580cgtgtggaaggcaacaactttgatgcccgtaagcagcttctgcaatac1950ArgValGluGlyAsnAsnPheAspAlaArgLysGlnLeuLeuGlnTyr585590595gatgacgtgctccgccagcagcgcgaagtcatctataaacagcgcttt1998AspAspValLeuArgGlnGlnArgGluValIleTyrLysGlnArgPhe600605610615gaggtcatcgattccgataacctccgctccatcgtcgaaaatatgatt2046GluValIleAspSerAspAsnLeuArgSerIleValGluAsnMetIle620625630aaagcttcactcgagcgggctgttgcttcatatacgccgaaggaagat2094LysAlaSerLeuGluArgAlaValAlaSerTyrThrProLysGluAsp635640645ctgcctgaagagtggaatcttgacggccttgtggagcttgtaaatgcg2142LeuProGluGluTrpAsnLeuAspGlyLeuValGluLeuValAsnAla650655660aatttccttgatgaaggtggagtggagaaaagcgacattttcggaaaa2190AsnPheLeuAspGluGlyGlyValGluLysSerAspIlePheGlyLys665670675gagcccgaggagattacagagctcatttacgaccgcatcaaaacgaaa2238GluProGluGluIleThrGluLeuIleTyrAspArgIleLysThrLys680685690695tacgatgagaaagaagagcggtacggctctgaacaaatgcgcgaattt2286TyrAspGluLysGluGluArgTyrGlySerGluGlnMetArgGluPhe700705710gagaaagtcatcgttctccgcgaagtggatacgaaatggatggatcac2334GluLysValIleValLeuArgGluValAspThrLysTrpMetAspHis715720725atcgatgcgatggatcagctgcggcaaggaattcatctgcgcgcttat2382IleAspAlaMetAspGlnLeuArgGlnGlyIleHisLeuArgAlaTyr730735740gctcagacaaacccgctccgcgagtatcagatggaaggctttgcaatg2430AlaGlnThrAsnProLeuArgGluTyrGlnMetGluGlyPheAlaMet745750755tttgaaaacatgatcgcggcgattgaagatgatgtagccaaattcgtc2478PheGluAsnMetIleAlaAlaIleGluAspAspValAlaLysPheVal760765770775atgaaggctgaaatcgaaaacaaccttgagcgcgaagaggtcattcaa2526MetLysAlaGluIleGluAsnAsnLeuGluArgGluGluValIleGln780785790ggacagacgacagcccatcagccgaaagaaggcgatgaggaaaaacaa2574GlyGlnThrThrAlaHisGlnProLysGluGlyAspGluGluLysGln795800805gcgaagaaaaaaccggtccgcaaagcggtggatatcggacgcaatgat2622AlaLysLysLysProValArgLysAlaValAspIleGlyArgAsnAsp810815820ccttgctactgcggaagcggaaaaaaatataaaaactgctgcggaaga2670ProCysTyrCysGlySerGlyLysLysTyrLysAsnCysCysGlyArg825830835acagaataaaaagaggtgcacgcctctttttatttg2706ThrGlu840<210>6<211>841<212>PRT<213>Bacilluslicheniformis<400>6MetLeuGlyIleLeuAsnLysValPheAspProThrLysArgThrLeu151015SerArgTyrGluLysLysAlaAsnGluIleAspAlaLeuLysAlaAsp202530IleGluLysLeuSerAspGluAlaLeuLysGlnLysThrIleGluPhe354045LysGluArgLeuGluLysGlyGluThrValAspAspLeuLeuValGlu505560AlaPheAlaValValArgGluAlaSerArgArgValThrGlyMetPhe65707580ProPheLysValGlnLeuMetGlyGlyValAlaLeuHisGluGlyAsn859095IleAlaGluMetLysThrGlyGluGlyLysThrLeuThrSerThrMet100105110ProValTyrLeuAsnAlaLeuSerGlyLysGlyValHisValValThr115120125ValAsnGluTyrLeuAlaSerArgAspAlaGluGluMetGlyLysIle130135140PheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyLeuAsnLeuAsnSerLeuSer145150155160LysAspGluLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyrSerThr165170175AsnAsnGluLeuGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetValLeuTyr180185190LysGluGlnMetValGlnArgProLeuHisPheAlaValIleAspGlu195200205ValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIleIleSer210215220GlyGlnAlaAlaLysSerThrLysLeuTyrValGlnAlaAsnAlaPhe225230235240ValArgThrLeuLysAlaAspGlnAspTyrThrTyrAspValLysThr245250255LysGlyValGlnLeuThrGluGluGlyMetThrLysAlaGluLysAla260265270PheGlyIleGluAsnLeuPheAspValArgHisValAlaLeuAsnHis275280285HisIleAlaGlnAlaLeuLysAlaHisAlaAlaMetHisLysAspVal290295300AspTyrValValGluAspGlyGlnValValIleValAspSerPheThr305310315320GlyArgLeuMetLysGlyArgArgTyrSerAspGlyLeuHisGlnAla325330335IleGluAlaLysGluGlyLeuGluIleGlnAsnGluSerMetThrLeu340345350AlaThrIleThrPheGlnAsnTyrPheArgMetTyrGluLysLeuAla355360365GlyMetThrGlyThrAlaLysThrGluGluGluGluPheArgAsnIle370375380TyrAsnMetGlnValValThrIleProThrAsnLysProIleAlaArg385390395400AspAspArgProAspLeuIleTyrArgThrMetGluGlyLysPheLys405410415AlaValAlaGluAspValAlaGlnArgTyrMetValGlyGlnProVal420425430LeuValGlyThrValAlaValGluThrSerGluLeuIleSerArgLeu435440445LeuLysAsnLysGlyIleProHisGlnValLeuAsnAlaLysAsnHis450455460GluArgGluAlaGlnIleIleGluAspAlaGlyGlnLysGlyAlaVal465470475480ThrIleAlaThrAsnMetAlaGlyArgGlyThrAspIleLysLeuGly485490495GluGlyValLysGluLeuGlyGlyLeuAlaValIleGlyThrGluArg500505510HisGluSerArgArgIleAspAsnGlnLeuArgGlyArgSerGlyArg515520525GlnGlyAspProGlyIleThrGlnPheTyrLeuSerMetGluAspGlu530535540LeuMetLysArgPheGlyAlaGluArgThrMetAlaMetLeuAspArg545550555560PheGlyMetAspAspSerThrProIleGlnSerLysMetValSerArg565570575AlaValGluSerSerGlnLysArgValGluGlyAsnAsnPheAspAla580585590ArgLysGlnLeuLeuGlnTyrAspAspValLeuArgGlnGlnArgGlu595600605ValIleTyrLysGlnArgPheGluValIleAspSerAspAsnLeuArg610615620SerIleValGluAsnMetIleLysAlaSerLeuGluArgAlaValAla625630635640SerTyrThrProLysGluAspLeuProGluGluTrpAsnLeuAspGly645650655LeuValGluLeuValAsnAlaAsnPheLeuAspGluGlyGlyValGlu660665670LysSerAspIlePheGlyLysGluProGluGluIleThrGluLeuIle675680685TyrAspArgIleLysThrLysTyrAspGluLysGluGluArgTyrGly690695700SerGluGlnMetArgGluPheGluLysValIleValLeuArgGluVal705710715720AspThrLysTrpMetAspHisIleAspAlaMetAspGlnLeuArgGln725730735GlyIleHisLeuArgAlaTyrAlaGlnThrAsnProLeuArgGluTyr740745750GlnMetGluGlyPheAlaMetPheGluAsnMetIleAlaAlaIleGlu755760765AspAspValAlaLysPheValMetLysAlaGluIleGluAsnAsnLeu770775780GluArgGluGluValIleGlnGlyGlnThrThrAlaHisGlnProLys785790795800GluGlyAspGluGluLysGlnAlaLysLysLysProValArgLysAla805810815ValAspIleGlyArgAsnAspProCysTyrCysGlySerGlyLysLys820825830TyrLysAsnCysCysGlyArgThrGlu835840權(quán)利要求1.一種選擇微生物的方法，特征在于(a)編碼必需轉(zhuǎn)位活性的內(nèi)源性存在的基因被失活，和(b)根據(jù)(a)的轉(zhuǎn)位活性的失活通過(guò)載體消除。2.如權(quán)利要求1的方法，特征在于(c)根據(jù)(b)的載體攜帶轉(zhuǎn)基因。3.如權(quán)利要求1或2的方法，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列因子之一SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。4.如權(quán)利要求3的方法，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列蛋白前體轉(zhuǎn)位酶的亞基之一SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優(yōu)選SecA亞基。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)作用與失活的內(nèi)源性存在的必需轉(zhuǎn)位活性相同的活性進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)的活性，特別優(yōu)選通過(guò)同一活性。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)來(lái)自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtili)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)的SecA基因區(qū)域恢復(fù)轉(zhuǎn)位活性而進(jìn)行，其分別顯示于SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5表示的序列中。7.如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的方法，特征在于進(jìn)行根據(jù)(a)的失活以阻止根據(jù)(a)失活的基因區(qū)域和根據(jù)(b)載體上同源區(qū)域間的重組，優(yōu)選包含在有關(guān)染色體基因中的基因片段完全丟失。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(a)的失活通過(guò)刪除載體進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)刪除具有外源性可調(diào)控復(fù)制起點(diǎn)的載體進(jìn)行，特別優(yōu)選通過(guò)刪除具有溫度依賴(lài)型復(fù)制起點(diǎn)的載體進(jìn)行。9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(b)的載體是在微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。10.如權(quán)利要求9的方法，特征在于所述質(zhì)粒是多于一個(gè)拷貝數(shù)，優(yōu)選多個(gè)拷貝數(shù)。11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，特征在于所述微生物是革蘭氏陰性細(xì)菌株。12.權(quán)利要求11的方法，特征在于涉及的是大腸桿菌(E.coli)屬或克雷伯菌(Klebsiella)屬的革蘭氏陰性細(xì)菌株，特別是大腸桿菌K12，大腸桿菌B或植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)的衍生物，和非常特別地是大腸桿菌株BL21(DE3)，大腸桿菌RV308，大腸桿菌DH5α，大腸桿菌JM109，E.coliXL-1或植生克雷伯菌(Rf)菌株。13.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，特征在于微生物是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。14.如權(quán)利要求13的方法，其特征在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌株是葡萄球菌(Staphylococcus)，棒狀桿菌(Corynebacteria)或芽孢桿菌(Bacillus)屬，特別地是肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)，谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，克魯伯氏芽孢桿菌(B.globigii)或緩慢芽孢桿菌(B.lentus)，和非常特別地是地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌菌株的衍生物。15.如權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因是編碼非酶蛋白的轉(zhuǎn)基因，特別地是編碼藥物相關(guān)蛋白，非常特別地是編碼胰島素或降鈣素的轉(zhuǎn)基因。16.如權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)的方法，特征在于根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因是編碼酶的轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選編碼水解酶或氧化還原酶，特別優(yōu)選編碼蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)素分解酶(cutinase)、氧化酶、過(guò)氧化物酶或漆酶。17.一種通過(guò)培養(yǎng)微生物菌株細(xì)胞制備蛋白的方法，特征在于權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的選擇方法。18.如權(quán)利要求17的方法，特征在于權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)的選擇方法，根據(jù)(c)的轉(zhuǎn)基因編碼通過(guò)該方法制備的蛋白。19.如權(quán)利要求17或18的方法，特征在于微生物的培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，優(yōu)選在發(fā)酵罐中進(jìn)行。20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，特征在于所述的蛋白被分泌到周?chē)囵B(yǎng)基中。21.一種微生物，通過(guò)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法獲得。22.如權(quán)利要求21的微生物，其特征在于轉(zhuǎn)基因被表達(dá)。23.如權(quán)利要求22的微生物，其特征在于轉(zhuǎn)基因被分泌。24.編碼必需轉(zhuǎn)位活性的基因在微生物選擇中的應(yīng)用，特征在于(a)內(nèi)源性存在于微生物中所述的必需轉(zhuǎn)位活性被失活，和(b)根據(jù)(a)被失活的必需轉(zhuǎn)位活性通過(guò)載體消除。25.如權(quán)利要求24的應(yīng)用，特征在于(c)根據(jù)(b)的載體攜帶轉(zhuǎn)基因。26.如權(quán)利要求24或25的應(yīng)用，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列因子之一SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。27.如權(quán)利要求26的應(yīng)用，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列蛋白前體轉(zhuǎn)位酶的亞基之一SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優(yōu)選為SecA亞基。28.如權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)的應(yīng)用，特征在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)作用與失活的內(nèi)源必需轉(zhuǎn)位活性相同的活性進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)的活性，特別優(yōu)選通過(guò)同一活性。29.如權(quán)利要求24-28中任一項(xiàng)的應(yīng)用，特征在于根據(jù)(b)的消除通過(guò)來(lái)自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌的SecA基因區(qū)域恢復(fù)轉(zhuǎn)位活性而進(jìn)行，其分別顯示于SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5表示的序列中。30.如權(quán)利要求24-29中任一項(xiàng)的應(yīng)用，特征在于根據(jù)(b)的載體是在微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。31.如權(quán)利要求30的應(yīng)用，特征在于該質(zhì)粒是多于一個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，優(yōu)選是多拷貝數(shù)的。32.一種攜帶必需轉(zhuǎn)位活性基因和轉(zhuǎn)基因的載體，如果其是唯一的轉(zhuǎn)基因，則不編碼抗生素抗性。33.如權(quán)利要求32的載體，特征在于轉(zhuǎn)基因編碼藥物相關(guān)的非酶蛋白或水解酶或氧化還原酶。34.如權(quán)利要求32或33的載體，特征在于其編碼的轉(zhuǎn)位活性能消除失活的必需內(nèi)源性存在于微生物菌株中的轉(zhuǎn)位活性，優(yōu)選通過(guò)遺傳相關(guān)的活性，特別優(yōu)選通過(guò)同一活性。35.如權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)的載體，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列因子之一SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號(hào)肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。36.如權(quán)利要求35的載體，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是下列蛋白前體轉(zhuǎn)位酶的亞基之一SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優(yōu)選為SecA亞基。37.如權(quán)利要求32-36之一的載體，特征在于必需的轉(zhuǎn)位活性是來(lái)自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌的secA基因之一的基因，其分別顯示于SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列中。38.如權(quán)利要求32-37中任一項(xiàng)的載體，特征在于涉及的是在微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。39.如權(quán)利要求38的載體，特征在于所述的質(zhì)粒超過(guò)一個(gè)拷貝數(shù)，優(yōu)選為多拷貝數(shù)。全文摘要本發(fā)明涉及一種選擇微生物的體系，其主要失活轉(zhuǎn)位酶，并通過(guò)相同的因子恢復(fù)所述的失活，其中所述的因子通過(guò)載體可用于各個(gè)細(xì)胞。所述的發(fā)明體系特別適用于通過(guò)微生物菌株的細(xì)胞培養(yǎng)制備蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的選擇體系、位于恢復(fù)載體上的各種轉(zhuǎn)基因。所述的發(fā)明還涉及各種有機(jī)體以及轉(zhuǎn)錄酶基因和載體的用途，特別是革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性細(xì)菌的<I＜secA＜/I>基因，例如<i>地衣芽孢桿菌。文檔編號(hào)C12N1/20GK1756835SQ200480005764公開(kāi)日2006年4月5日申請(qǐng)日期2004年2月27日優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日發(fā)明者馬倫·欣茨,羅朗德·弗羅伊德?tīng)?約爾格·費(fèi)舍,羅朗德·布雷韋斯申請(qǐng)人:漢高兩合股份公司