專利名稱：用于治療蛋白質(zhì)缺乏病的聯(lián)合治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^將活性部位特異陪伴分子(ASSC)與蛋白質(zhì)替代治療聯(lián)合來提高所施用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功效的改良的蛋白質(zhì)替代療法。本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了包含純化蛋白質(zhì)和ASSC的組合物。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)缺乏病蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)根據(jù)特定基因的基因組核苷酸序列通過轉(zhuǎn)錄、翻譯和其它過程合成的。蛋白質(zhì)缺乏病可以由編碼基因的突變引起，該突變導(dǎo)致(i)蛋白質(zhì)不能合成；(ii)缺乏生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的合成；或(iii)包含正?；虿糠稚飳W(xué)活性、但不能夠適當(dāng)加工以達(dá)到蛋白質(zhì)的天然區(qū)室的蛋白質(zhì)的合成。源于遺傳突變的蛋白質(zhì)缺乏病也叫做遺傳病。
除了源于遺傳突變的蛋白質(zhì)缺乏病外，一些蛋白質(zhì)缺乏病可以由疾病或者疾病治療(例如化學(xué)療法)的副作用或者營養(yǎng)不量的后果引起。
當(dāng)前療法蛋白質(zhì)的缺乏會(huì)導(dǎo)致多種疾病，一些疾病是由突變的、錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)引起的(構(gòu)象疾病-下同)。用于治療蛋白質(zhì)缺乏病的一種當(dāng)前療法是蛋白質(zhì)替代療法，該方法一般涉及靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)灌注純化形式的相應(yīng)野生型蛋白質(zhì)，或者植入生物易蝕固體形式的蛋白質(zhì)以便持續(xù)釋放。由于所灌注的蛋白質(zhì)會(huì)被迅速地降解，所以蛋白質(zhì)替代療法的一個(gè)主要的復(fù)雜因素是蛋白質(zhì)治療有效量的實(shí)現(xiàn)和維持?？朔搯栴}的當(dāng)前方法是多次高成本的高劑量灌注。
蛋白質(zhì)替代療法具有幾個(gè)額外的限制，例如大規(guī)模產(chǎn)生、純化和貯藏正確折疊蛋白質(zhì)上的困難、得到糖基化的天然蛋白質(zhì)上的困難、抗蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生以及在具有明顯牽涉中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病中不能夠穿過血-腦屏障。
使用包含編碼功能蛋白質(zhì)的核酸序列的重組載體的基因治療，或者使用表達(dá)功能蛋白質(zhì)的經(jīng)遺傳修飾的人細(xì)胞的基因治療，也可以用來治療蛋白質(zhì)缺乏病和能從蛋白質(zhì)替代中受益的其它疾病。雖然該方法有希望，但由于技術(shù)難題使該方法受到了限制，例如載體不能夠感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)正在分裂的細(xì)胞、靶基因的低表達(dá)、以及基因一旦被遞送后對(duì)表達(dá)的調(diào)節(jié)。
第三，治療蛋白質(zhì)缺乏病的相對(duì)較新的方法涉及到小分子抑制劑的使用以降低所缺乏酶蛋白質(zhì)的天然底物，從而改善病理學(xué)。此種“底物剝奪”的方法已經(jīng)在稱作溶酶體貯積病或鞘糖脂貯積疾病的一類大約40種相關(guān)酶疾病中被具體地描述。這些可遺傳疾病的特征是缺乏能夠催化降解細(xì)胞內(nèi)糖脂的溶酶體酶，導(dǎo)致脂類不正常積累，這打亂了細(xì)胞的功能。計(jì)劃用于治療的小分子抑制劑對(duì)于抑制參與糖脂合成的酶是特異的，該種抑制降低了需要由所缺乏酶降解的細(xì)胞內(nèi)糖脂的量。該方法也受到了限制，因?yàn)樘侵瑢?duì)于生物學(xué)功能是必需的，并且過度的剝奪會(huì)引起副作用。具體而言，糖脂能夠被腦用來從神經(jīng)元的神經(jīng)節(jié)苷脂傳遞信號(hào)到其它神經(jīng)元。如果糖脂太少或太多，神經(jīng)元傳遞信號(hào)的能力受到阻礙。
如下作為特異陪伴分子進(jìn)行討論的第四種方法使突變型蛋白質(zhì)免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的降解。
蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的加工蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，并且新合成的蛋白質(zhì)以很大程度未折疊的狀態(tài)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的腔內(nèi)。通常，蛋白質(zhì)折疊受自組裝原則的控制。新合成的多肽根據(jù)它們的氨基酸序列折疊成它們的天然構(gòu)象(Anfinsen等，Adv.Protein Chem.1975；29205-300)。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)折疊是復(fù)雜的，因?yàn)榄h(huán)境溫度和高蛋白質(zhì)濃度的結(jié)合會(huì)刺激聚集過程，在該過程中通常埋于疏水核心內(nèi)的氨基酸會(huì)與它們相鄰的氨基酸發(fā)生非特異的相互作用。為了避免出現(xiàn)這種問題，通常通過特定的一組稱作分子侶伴的蛋白質(zhì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊，分子侶伴阻止了初生多肽鏈的聚集并且能夠結(jié)合到未折疊的蛋白質(zhì)上以致于蛋白質(zhì)以天然構(gòu)象重折疊(Hartl，Nature 1996；381571-580)。
分子侶伴實(shí)際上存在于所有類型的細(xì)胞和大部分細(xì)胞區(qū)室內(nèi)。一些參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)并且允許細(xì)胞在諸如熱休克和葡萄糖饑餓的應(yīng)激條件下存活(Gething等，Nature 1992；35533-45；Caplan，Trends Cell.Biol.1999；9262-268；Lin等，Mol.Biol.Cell.1993；4109-1119；Bergeron等，TrendsBiochem.Sci.1994；19124-128)。在分子侶伴中，Bip(免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，Grp78)是特征最清楚的ER的陪伴分子(Haas，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1991；16771-82)。像其它分子侶伴一樣，Bip與ER內(nèi)的許多分泌蛋白和膜蛋白在這些蛋白質(zhì)的整個(gè)成熟過程中發(fā)生相互作用，雖然在折疊平穩(wěn)進(jìn)行過程中這種相互作用通常很弱并且是短壽命的。一旦完成天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象，分子侶伴不再與蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)合到在折疊、裝配或正確糖基化方面失敗的蛋白質(zhì)上后的Bip變得穩(wěn)定，并且導(dǎo)致了蛋白質(zhì)通過ER相關(guān)途徑的降解。該過程作為ER內(nèi)的“質(zhì)量控制”系統(tǒng)起作用，保證了只有那些正確折疊和裝配的蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)出ER用于進(jìn)一步的成熟，并且錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)滯留其中進(jìn)行隨后的降解(Hurtley等，Annu.Rev.Cell.Biol.1989；5277-307)。
某些DNA突變導(dǎo)致氨基酸替代，這種替代進(jìn)一步阻止并且在許多情況下排除突變型蛋白質(zhì)的正確折疊。為了糾正這些錯(cuò)折疊，研究人員嘗試了使用多種分子。已經(jīng)表明在一些疾病中高濃度的甘油、二甲基亞砜(DMSO)、三甲胺-N-氧化物(TMAO)或者重水抑制降解途徑并增加突變型蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(Brown等，Cell Stress Chaperones 1996；1117-125；Burrows等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；971796-801)。雖然其功能機(jī)制還不清楚，但是這些化合物被認(rèn)為是能夠促進(jìn)一般蛋白質(zhì)折疊的非特異的化學(xué)陪伴分子。雖然它們對(duì)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊缺陷的生物化學(xué)檢查是有用處的，但起功效時(shí)要求該類化合物的高劑量使得它們?cè)谂R床上應(yīng)用困難或不適宜用于臨床。這些化合物還缺乏特異性。
特異的陪伴分子策略先前的專利和公開描述了拯救內(nèi)源性酶蛋白質(zhì)特別是錯(cuò)折疊的溶酶體酶免受通過ER質(zhì)量控制機(jī)制而降解的治療策略。該策略使用對(duì)與特定溶酶體病相關(guān)的缺陷溶酶體酶特異的小分子可逆競(jìng)爭性抑制劑。該策略如下由于突變型酶蛋白質(zhì)在ER內(nèi)不正確折疊(Ishii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220；812-815)，酶蛋白質(zhì)被滯留于正常的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(ER→高爾基體→內(nèi)體→溶酶體)并且被快速地降解。因此，促進(jìn)突變型蛋白質(zhì)正確折疊的功能性化合物將作為針對(duì)突變型蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異的陪伴分子而在促進(jìn)從ER質(zhì)量控制系統(tǒng)內(nèi)順利逃脫。由于已知酶的一些抑制劑占據(jù)酶的催化中心，導(dǎo)致了體外其構(gòu)象的穩(wěn)定。這些特異的陪伴分子可以稱作活性部位特異陪伴分子(ASSC)。
在Fan等的美國專利號(hào)6,274,597，6,583,158，6,589,964和6,599,919和2002年11月26日申請(qǐng)的待決美國申請(qǐng)系列號(hào)10/304,396(此處完全引用作為參考)中已經(jīng)專門闡述了參與溶酶體貯積病的酶的策略。例如，半乳糖的小分子衍生物，1-脫氧半乳糖野艽霉素(nojirimycin)(DGJ)，是一種突變型法布里(Fabry)酶α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的有效的競(jìng)爭性抑制劑，能夠有效提高中性pH下突變型α-Gal A(R301Q)的體外穩(wěn)定性并且增強(qiáng)從具有R301Q或者Q279E突變的法布里病人中建立的淋巴母細(xì)胞中突變型酶的活性。此外，過量表達(dá)突變型(R301Q)α-Gal A的轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)口施用DGJ會(huì)在主要器官大量地提高酶活性(Fan等，NatureMed.1999；5112-115)。對(duì)錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的成功拯救取決于特異抑制劑在體內(nèi)達(dá)到的濃度，該濃度低于酶的完全抑制濃度，相比之下底物剝奪方法中需要酶的抑制濃度。
除了溶酶體貯積病外，現(xiàn)在認(rèn)為大量并且多種疾病也是由于采用非天然蛋白質(zhì)構(gòu)象所導(dǎo)致的構(gòu)象疾病，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)在ER內(nèi)滯留并最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解(Kuznetsov等，N.Engl.J.Med.1998；3391688-1695；Thomas等，Trends Biochem.Sci.1995；20456-459；Bychkova等，F(xiàn)EBSLett.1995；3596-8；Brooks，F(xiàn)EBS Lett.1997；409115-120)。ASSC表現(xiàn)出拯救除了酶外的突變型蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，發(fā)現(xiàn)小的合成化合物會(huì)穩(wěn)定突變型形式的腫瘤抑制基因蛋白p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此允許蛋白質(zhì)維持活性構(gòu)象(Foster等，Science 1999；2862507-10)。已經(jīng)表明通過小分子受體拮抗物和配體可以拯救受體的合成(Morello等，J.Clin.Invest.2000；105887-95；Petaja-Repo等，EMBO J.2002；211628-37)。已經(jīng)證明甚至通過使用通道阻斷藥物或底物對(duì)膜通道蛋白質(zhì)和其它質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行藥學(xué)拯救(Rajamani等，Circulation 2002；1052830-5；Zhou等，J.Biol.Chem.1999；27431123-26；Loo等，J.Biol.Chem 1997；272709-12)。上述所有文獻(xiàn)顯示ASSC有能力特異地拯救包括但不限于酶、受體、膜通道蛋白質(zhì)和DNA轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的突變型蛋白質(zhì)。
除了突變型蛋白質(zhì)以外，ASSC還表現(xiàn)出能夠穩(wěn)定野生型蛋白質(zhì)，導(dǎo)致它們的產(chǎn)量和穩(wěn)定性提高。如在一個(gè)實(shí)例中，已經(jīng)證明特定ASSC即DGJ能夠增加用編碼野生型α-Gal A序列的載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞內(nèi)野生型α-Gal A的數(shù)量和活性。ASSC拯救過量表達(dá)的野生型酶，否則這些酶會(huì)滯留于ER質(zhì)量控制系統(tǒng)，因?yàn)樵贑OS-7細(xì)胞中所述酶的過量表達(dá)和過量產(chǎn)生超過了該系統(tǒng)的容量并且導(dǎo)致聚集和降解(見03年2月28日申請(qǐng)的美國申請(qǐng)系列號(hào)10/377,179)。
總之，當(dāng)應(yīng)用蛋白質(zhì)替代治療例如施用替代蛋白質(zhì)治療蛋白質(zhì)缺乏病或其它疾病時(shí)，本領(lǐng)域需要提高生物學(xué)功效和成本效率的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了增強(qiáng)純化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，該方法包括將于可藥用載體中的蛋白質(zhì)與活性部位特異陪伴分子相互接觸。
純化的蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)并且可以是保留活性的全長的或截短的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了通過將于可藥用載體中的蛋白質(zhì)與活性部位特異陪伴分子相互接觸使得蛋白質(zhì)在體外的貯存期限得到提高的方法。
可藥用載體中的蛋白質(zhì)可以是冷凍干燥的或者是水溶液。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了延長純化蛋白質(zhì)在用于可藥用載體中的蛋白質(zhì)施用的個(gè)體內(nèi)的半衰期和體內(nèi)活性的方法，該方法包括將蛋白質(zhì)與于可藥用載體中的活性部位特異陪伴分子相接觸。
本發(fā)明提供了用于對(duì)患有需要進(jìn)行蛋白質(zhì)替代的疾病(例如蛋白質(zhì)缺乏疾病)的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，其包括對(duì)個(gè)體施用純化的替代蛋白質(zhì)和能夠穩(wěn)定替代蛋白質(zhì)的活性部位特異陪伴分子(ASSC)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，替代蛋白質(zhì)是一種與構(gòu)象疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方案中，構(gòu)象疾病是溶酶體貯積病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，溶酶體貯積病是法布里病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶酶體貯積病是戈謝病。
本發(fā)明還提供了在蛋白質(zhì)替代治療的同時(shí)增強(qiáng)突變型內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法，該蛋白質(zhì)由于在ER內(nèi)的缺陷性的折疊和加工而變得缺乏。隨著所施用的對(duì)應(yīng)于突變型蛋白質(zhì)的替代蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加，內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和因此而來的活性增強(qiáng)了。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過將宿主細(xì)胞與包含針對(duì)蛋白質(zhì)的ASSC的培養(yǎng)基相接觸而增加由非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明進(jìn)一部提供了于可藥用載體中的包含純化蛋白質(zhì)和針對(duì)純化蛋白質(zhì)的ASSC的組合物。
附圖簡述

圖1表明使用部位特異陪伴分子1-脫氧半乳糖野艽霉素(DGJ，1μM)的野生型和突變型α-Gal A穩(wěn)定性分別提高，野生型α-Gal A是從用帶有人野生型α-Gal A cDNA的重組桿狀病毒感染的Sf-9細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化的，突變型α-Gal A是從過量表達(dá)人突變型(R301Q)α-Gal A的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟勻漿液中收集的。實(shí)驗(yàn)前，將小鼠用作為飲用水的0.5mM DGJ處理一周。將突變型(A)和野生型(B)的酶在濃度為1μM(○)，0.1μM(●)，0.03μM(◆)或0μM(沒有DGJ；◇)的DGJ存在的條件下，分別于37℃和42℃用0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.0)進(jìn)行預(yù)培育，對(duì)于突變型酶為37℃對(duì)于野生型酶為42℃。酶活性報(bào)導(dǎo)為與未進(jìn)行預(yù)培育的酶相比的相對(duì)值。DGJ可以作為穩(wěn)定劑防止突變型和野生型酶的變性/降解。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過將蛋白質(zhì)與活性部位特異陪伴分子(ASSC)相接觸有利地改進(jìn)了用于治療疾病或病癥的蛋白質(zhì)替代療法的療效。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在(a)提高非哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的效率；(b)增加治療蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為更長的貯存期限和更好的體內(nèi)半衰期和活性；(c)在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)包括跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)維持蛋白質(zhì)活性部位的結(jié)構(gòu)；和(d)拯救內(nèi)源性突變型蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在合成過程中發(fā)生錯(cuò)折疊并隨后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中清除掉。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含蛋白質(zhì)和特異性穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性部位特異陪伴分子(ASSC)的制劑。
本發(fā)明是以這樣的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即在遺傳病和其它疾病的治療中ASSC能夠作為蛋白質(zhì)替代療法的聯(lián)合治療而使用。使用本領(lǐng)域已知的方法可以對(duì)ASSC進(jìn)行篩選和鑒定。一旦鑒定出一種對(duì)特定疾病有用的ASSC，則可將ASSC施用于接受蛋白質(zhì)替代治療的病人，以增強(qiáng)替代蛋白質(zhì)在恰當(dāng)細(xì)胞區(qū)室中的吸收、提高循環(huán)中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，以及根據(jù)需要提高在轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞期間的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在制造、貯存和體內(nèi)使用過程中，陪伴分子可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性形式。
定義在每個(gè)術(shù)語所使用的本發(fā)明上下文中和其所使用的特定上下文中，本說明書中使用的術(shù)語通常具有本領(lǐng)域中其通常的含義。為了在描述本發(fā)明的組合物和方法以及怎樣使用它們方面對(duì)醫(yī)師提供額外的指導(dǎo)，一些術(shù)語在下面討論，或者在說明書的其它地方討論。
具體定義.術(shù)語“蛋白質(zhì)替代”是指將非天然的、純化的蛋白質(zhì)導(dǎo)入患有該蛋白質(zhì)缺乏病的個(gè)體中。所施用的蛋白質(zhì)可以從天然來源得到(例如用于治療RSV和單核細(xì)胞增多癥的人丙種球蛋白)或者通過重組表達(dá)得到(如下面比較詳細(xì)的描述)。該術(shù)語還指純化蛋白質(zhì)向個(gè)體的導(dǎo)入，此處所述的個(gè)體需要施用純化蛋白質(zhì)或者從純化蛋白質(zhì)的施用中受益，例如患有蛋白質(zhì)缺乏的個(gè)體。所導(dǎo)入的蛋白質(zhì)可以是純化的、經(jīng)體外產(chǎn)生的重組蛋白或者從諸如胎盤或動(dòng)物乳汁的離體組織或液體中或者植物中純化的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“通過蛋白質(zhì)缺乏表征的疾病”指存在由蛋白質(zhì)缺乏或數(shù)量不足導(dǎo)致的出現(xiàn)病理變化的任何疾病。該術(shù)語包含導(dǎo)致生物學(xué)失活蛋白質(zhì)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)折疊疾病，即構(gòu)象疾病。在傳染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺問題、放射病、營養(yǎng)缺乏、中毒、或其它環(huán)境或外部創(chuàng)傷中可涉及到蛋白質(zhì)不足。
術(shù)語“穩(wěn)定正確構(gòu)象”指化合物或肽或其它分子與在體外例如在制劑中和體內(nèi)與野生型蛋白質(zhì)或者能夠行使野生型功能的突變型蛋白質(zhì)結(jié)合從而使野生型或突變型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以維持其天然或正確形式的能力。這種作用通過(i)蛋白質(zhì)貯存期限的提高；(ii)每單位量的蛋白質(zhì)的較高的活性；或者(iii)體內(nèi)效能更強(qiáng)中的一種或多種實(shí)踐性地證明了。這通過表達(dá)時(shí)提高的從ER中的產(chǎn)量、對(duì)由于溫度提高或離液劑的存在所導(dǎo)致對(duì)解折疊的較大抗性以及通過相似的方法實(shí)驗(yàn)性地觀察到。
如此處所使用，術(shù)語“構(gòu)象病”或“構(gòu)象疾病”指采用的蛋白質(zhì)構(gòu)象所導(dǎo)致的疾病，其中所述的蛋白質(zhì)構(gòu)象不能被具有正常生物學(xué)活性的野生型蛋白質(zhì)在天然條件下正常地形成，這種疾病會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在ER中滯留和破壞。降低的蛋白質(zhì)水平導(dǎo)致生理性不平衡，其表現(xiàn)為一種疾病或病癥。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，構(gòu)象疾病是溶酶體貯積病。
如此處所使用，術(shù)語“活性部位”指蛋白質(zhì)具有一些特異生物學(xué)活性的區(qū)域。例如，它可以是結(jié)合底物或其它結(jié)合配偶體(partner)的部位和貢獻(xiàn)直接參與產(chǎn)生和打斷化學(xué)鍵的氨基酸殘基的部位。在本發(fā)明中活性部位可以包括酶的催化位點(diǎn)、抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)、受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、調(diào)節(jié)物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者分泌蛋白質(zhì)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；钚圆课贿€可以包括反式激活、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、或轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)物的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
如此處所使用，術(shù)語“活性部位特異陪伴分子”指能夠特異地與蛋白質(zhì)活性部位可逆相互作用并且增強(qiáng)穩(wěn)定分子構(gòu)象形成的包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、糖類在內(nèi)的任何分子。如此處所使用，“活性部位特異陪伴分子”不包括存在于細(xì)胞ER中的內(nèi)源性普通陪伴分子如Bip、鈣聯(lián)接蛋白或鈣網(wǎng)蛋白，或者通常的非特異化學(xué)陪伴分子如重水、DMSO或TMAO。
一般定義如此處所使用術(shù)語“純化的”指在降低或消除無關(guān)材料即污染物存在的條件下被分離的材料，其中所述無關(guān)材料包括最終所得材料之來源的天然材料。例如，純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選地基本上沒有在細(xì)胞內(nèi)能與其結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或核酸；純化的核酸分子優(yōu)選地基本上沒有在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或其它無關(guān)核酸分子。如此處所使用，術(shù)語“基本上沒有”在材料的分析測(cè)試上下文中可以操作性地使用。優(yōu)選地，基本上不含雜質(zhì)的純化的材料為至少95％的純度；更加優(yōu)選地，至少97％的純度，并且更加優(yōu)選地還可以至少99％的純度。純度可以通過層析、凝膠電泳、免疫測(cè)定、組成分析、生物學(xué)鑒定和本領(lǐng)域已知的其它方法估計(jì)出來。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，純化的意思是指污染物的水平低于施用于人或非人動(dòng)物的規(guī)管局所接受的水平。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“大約”和“約”通常指根據(jù)測(cè)量的性質(zhì)和精度而定的測(cè)量數(shù)量的可接受程度的誤差。一般地，例證的誤差程度在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選地在10％以內(nèi)，并且更加優(yōu)選地在5％以內(nèi)。備選地，并且尤其是在生物學(xué)系統(tǒng)中，術(shù)語“大約”和“約”可指給定數(shù)值的一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的數(shù)值，優(yōu)選地在10倍或5倍以內(nèi)，并且更加優(yōu)選地在2倍以內(nèi)。除非另外聲明，當(dāng)文中指出數(shù)字的量是近似的時(shí)，是指不進(jìn)行表述性的陳述而引用的術(shù)語“大約”或“約”。
“基因”是編碼功能性“基因產(chǎn)物”的核苷酸序列。通常，基因產(chǎn)物是功能性蛋白質(zhì)。然而，基因產(chǎn)物還可以是細(xì)胞內(nèi)其它類型的分子，例如RNA(例如tRNA或者rRNA)。為了本發(fā)明的目的，基因產(chǎn)物還指在細(xì)胞內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)的mRNA序列。
術(shù)語“表達(dá)”意思是指通過活化參與相應(yīng)基因或DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的細(xì)胞內(nèi)功能而允許或?qū)е禄蚧駾NA序列中的信息變成表現(xiàn)形式，例如產(chǎn)生RNA(例如rRNA或mRNA)或蛋白質(zhì)。DNA序列由細(xì)胞表達(dá)以形成諸如RNA(例如mRNA或rRNA)和蛋白質(zhì)的“表達(dá)產(chǎn)物”。表達(dá)產(chǎn)物本身例如最終的RNA或蛋白質(zhì)可以稱作被細(xì)胞“表達(dá)的”。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”意思是指將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意思是指將“外來的”(即外部的或細(xì)胞外的)基因、DNA或RNA序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞以致于宿主細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)入的基因或序列以產(chǎn)生目的物質(zhì)，其中所述的目的物質(zhì)在本發(fā)明中一般是指被所導(dǎo)入基因或序列編碼的RNA，也可以是被所導(dǎo)入基因或序列編碼的蛋白質(zhì)或酶。所導(dǎo)入的基因或序列還可以稱作“克隆的”或“外來的”基因或序列，可以包括調(diào)節(jié)或控制序列(例如被細(xì)胞的遺傳機(jī)制所使用的起始、終止、啟動(dòng)子、信號(hào)、分泌或其它序列)。基因或序列可包括非功能性序列或未知功能序列。接受并表達(dá)所導(dǎo)入DNA或RNA的宿主細(xì)胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)化了”并且是一個(gè)“轉(zhuǎn)化體”或“克隆”。導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA或RNA可以來自于許多來源，包括與宿主細(xì)胞同一屬或種的細(xì)胞或不同屬或種的細(xì)胞。
術(shù)語“載體”、“克隆載體”和“表達(dá)載體”意思是指運(yùn)載體，通過該運(yùn)載體將DNA或RNA序列(例如外來基因)導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而轉(zhuǎn)化宿主和促進(jìn)所導(dǎo)入序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。
術(shù)語“表達(dá)系統(tǒng)”意思是指在適宜條件下的宿主細(xì)胞和相容的載體，該適宜條件例如為了表達(dá)由載體攜帶的并已導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外來DNA所編碼的蛋白質(zhì)。常用的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌(E.coli)宿主細(xì)胞和質(zhì)粒載體、昆蟲宿主細(xì)胞例如Sf9、Hi5或S2細(xì)胞和桿狀病毒載體和表達(dá)系統(tǒng)、以及哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和載體。
術(shù)語“突變型”和“突變”意思是指遺傳物質(zhì)例如DNA中的任何可檢測(cè)的變化或此種變化的任何過程、機(jī)制或結(jié)果。它包括基因結(jié)構(gòu)(例如DNA序列)發(fā)生改變的基因突變、源于任何突變過程的基因或DNA、或由修飾的基因或DNA序列表達(dá)的任何表達(dá)產(chǎn)物(如RNA、蛋白質(zhì)或酶)。
如此處所使用術(shù)語“突變型蛋白質(zhì)”是指從含有能導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列改變的遺傳學(xué)突變的基因翻譯而來的蛋白質(zhì)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，此種突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)在通常存在于ER內(nèi)的條件下不能達(dá)到其天然構(gòu)象的能力。在實(shí)現(xiàn)此種構(gòu)象上的失敗導(dǎo)致了蛋白質(zhì)被降解，而不是通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中它們的正常途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的正常位置。其它突變可以導(dǎo)致活性的降低或周轉(zhuǎn)更快。
“野生型基因”指編碼在體內(nèi)具有正常生物學(xué)功能活性的蛋白質(zhì)的核酸序列。野生型核酸序列可含有不同于已知公布的、能導(dǎo)致對(duì)生物學(xué)活性影響很小或沒有的氨基酸替代的改變的、核苷酸的變化。術(shù)語野生型也可包括為了編碼相對(duì)于內(nèi)源或天然蛋白質(zhì)能夠提高或增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)而經(jīng)過改造的核酸序列。
“野生型蛋白質(zhì)”指由野生型基因編碼的蛋白質(zhì)，當(dāng)在體內(nèi)表達(dá)或?qū)霑r(shí)該蛋白質(zhì)具有功能性生物學(xué)活性。術(shù)語“正常的野生型活性”指蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的正常的生理功能。蛋白質(zhì)的功能性可通過已知的用于確定蛋白質(zhì)功能性的任何方法測(cè)試。
術(shù)語“經(jīng)遺傳修飾的”指在導(dǎo)入包含編碼基因產(chǎn)物的編碼序列和控制編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的核酸之后，表達(dá)特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞。核酸的導(dǎo)入可以通過包括基因?qū)ぐ泻屯粗亟M在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。如此處所使用，該術(shù)語還包括已經(jīng)經(jīng)過工程改造例如通過基因活化技術(shù)表達(dá)或過量表達(dá)內(nèi)源性基因或基因產(chǎn)物的細(xì)胞，此處所述的基因和基因產(chǎn)物不能由該細(xì)胞正常表達(dá)。
短語“可藥用”，不論其是否與本發(fā)明的藥用組合物聯(lián)合使用，指當(dāng)施用于人時(shí)能夠生理性耐受的并且一般不產(chǎn)生不利反應(yīng)的分子和組合物。優(yōu)選地，如此處所使用，術(shù)語“可藥用”意思是指聯(lián)邦政府或州政府規(guī)管局認(rèn)可的或者美國藥典或其它用于動(dòng)物的并且更加具體地用于人的一般公認(rèn)的藥典中列出的。術(shù)語“載體”指化合物與其一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥用運(yùn)載體可以是無菌液體例如水和油。水或水溶液、鹽溶液和水溶右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別是用于可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幱眠\(yùn)載體在E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”，第18版中進(jìn)行了描述。
術(shù)語“治療有效量”和“有效量”指足以導(dǎo)致治療反應(yīng)的化合物的量。在ASSC和蛋白質(zhì)以復(fù)合物形式施用的實(shí)施方案中，術(shù)語“治療有效量”和“有效量”指足以導(dǎo)致治療反應(yīng)的復(fù)合物的量。治療反應(yīng)可以是使用者(例如臨床醫(yī)生)所識(shí)別的作為對(duì)治療有效反應(yīng)的任何反應(yīng)。因此，治療反應(yīng)通常是疾病或病癥的一種或多種癥狀的緩解。
值得注意，為了本發(fā)明的目的，由于當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)ASSC的稀釋(和隨后的由于平衡的變化導(dǎo)致的結(jié)合轉(zhuǎn)換)、生物利用率和代謝，在純化的治療蛋白質(zhì)的體外產(chǎn)生、運(yùn)輸或貯存過程中呈抑制性效應(yīng)的ASSC濃度也可構(gòu)成“有效量”。
通過蛋白質(zhì)缺乏所表征的疾病當(dāng)前有大約1100種已知的遺傳性疾病是以蛋白質(zhì)缺乏或在特定的組織中喪失功能為特征的。理論上這些疾病可以通過蛋白質(zhì)替代治療來治療。本發(fā)明的方法著眼于對(duì)當(dāng)前適用于蛋白質(zhì)替代治療的蛋白質(zhì)的共治療(co-therapy)，該蛋白質(zhì)替代治療可以是現(xiàn)在可得的或者在將來是可得的。在此種疾病中，個(gè)體的一些細(xì)胞或所有細(xì)胞缺乏足夠功能的蛋白質(zhì)、包含失活形式的蛋白質(zhì)或者包含對(duì)于生物學(xué)功能而言不足夠的水平。
更進(jìn)一步，被鑒定為由能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)缺乏的蛋白質(zhì)折疊改變的突變和突變型蛋白質(zhì)在ER滯留所產(chǎn)生的構(gòu)象性失調(diào)的疾病名單正在增加。它們包括囊性纖維化、α1-抗胰蛋白酶缺乏、家族性高膽固醇血癥、法布里病、阿爾茨海默氏病(Selkoe，Annu.Rev.Neurosci.1994；17489-517)、成骨不全(Chessler等，J.Biol.Chem.1993；26818226-18233)、糖類缺乏的糖蛋白綜合癥(Marquardt等，Eur.J.Cell.Biol.1995；66268-273)、馬-蘭綜合癥(Bradford等，Biochem.J.1999；341193-201)、遺傳性盲(Kaushal等，Biochemistry 1994；336121-8)、格蘭茨曼血小板無力癥(Kato等，Blood 1992；793212-8)、遺傳性凝血因子VII缺乏病(Arbini等，Blood1996；875085-94)、眼皮膚白化病(Halaban等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；975889-94)和蛋白質(zhì)C缺乏病(Katsumi等，Blood 1996；874164-75)。最近，在X-連鎖的疾病腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)中一個(gè)突變導(dǎo)致缺陷的過氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的錯(cuò)折疊，它可以通過低溫培養(yǎng)受影響細(xì)胞來進(jìn)行拯救(Walter等，Am.J.Hum.Genet.2001；6935-48)。一般公認(rèn)的是突變?cè)诨虻恼麄€(gè)序列中均勻發(fā)生。因此，可以預(yù)測(cè)來源于所缺乏蛋白質(zhì)的錯(cuò)折疊的表型會(huì)存在于許多其它遺傳病中。
溶酶體貯積病許多遺傳性蛋白質(zhì)缺乏病是酶的缺乏。如上面所指出，一大類遺傳性酶的疾病涉及到溶酶體酶的突變并且稱作溶酶體貯積病(LSD)。溶酶體貯積病是一組由鞘糖脂、糖原、粘多糖積累導(dǎo)致的疾病。溶酶體疾病的例子包括但不限于戈謝病(Beutler等，The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease，第8版，2001；Scriver等著，3635-3668頁，McGraw-Hill，New York)、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂病(相同，3775-3810頁)、巖藻糖苷貯積癥(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，1995.Scriver，C.R.，Baudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.著，2529-2561頁，McGraw-Hill，New York)、粘多糖貯積病(相同，3421-3452頁)、龐皮病(相同，3389-3420頁)、胡-沙綜合癥(Hurler-Scheie disease)(Weismann等，Science 1970；169，72-74)、尼曼病A和B(The Metabolic and Molecular Bases of InheritedDisease，第8版，2001.Scriver等著，3589-3610頁，McGraw-Hill，New York)和法布里病(相同，3733-3774頁)。LSD和它們相關(guān)的缺乏酶的名單可以從下面的表1中找到。在下面具體討論了2種疾病。
法布里病法布里病是由溶酶體α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性缺乏所引起的鞘糖脂代謝的X-連鎖的先天性障礙(Desnick等，The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease，第8版，Scriver等著，3733-3774頁，McGraw-Hill，New York 2001；Brady等，N.Engl.J.Med.1967；276，1163-1167)。這種酶的缺陷導(dǎo)致具有α-半乳糖殘基的中性鞘糖脂主要是神經(jīng)酰胺己三糖苷(GL-3)在體液和組織的溶酶體中進(jìn)行性沉積。發(fā)病率估計(jì)在男性中為大約1∶40,000，并且在全世界范圍內(nèi)的不同人種群中均有報(bào)道。在典型的發(fā)病男性中，臨床表現(xiàn)形式包括血管角皮瘤、肢端感覺異常、少汗癥、以及特征性角膜和晶狀體渾濁(The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774頁，McGraw-Hill，New York)。發(fā)病男性的預(yù)期壽命縮短了，并且由于心臟、腦和/或腎臟的血管性疾病導(dǎo)致通常在第4個(gè)或第5個(gè)十年內(nèi)出現(xiàn)死亡。與此相比，患有溫和的“心臟變異”的患者具有正常α-Gal A酶活性的5-15％，并且存在左心室肥大和心肌癥。當(dāng)沒有這種心臟變異的人嚴(yán)重發(fā)病時(shí)而這種心臟變異患者基本上仍沒有癥狀。最近發(fā)現(xiàn)在帶有不可解釋的左心室肥大心肌癥的成年男性患者中有11％的人存在心臟變異，這表明法布里病的發(fā)病頻率比先前估計(jì)的要高(Nakao等，N.Engl.J.Med.1995；333，288-293)。α-Gal A基因位于Xq22(Bishop等，Am.J.Hum.Genet.1985；37A144)并且已經(jīng)報(bào)道了編碼α-Gal A的全長cDNA和完整的12-kb基因組序列(Calhoun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985；82；7364-7368；Bishop等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986；834859-4863；Tsuji等，Eur.J.Biochem.1987；165；275-280；和Kornreich等，NucleicAcids Res.1989；173301-3302)。對(duì)導(dǎo)致法布里病的突變的遺傳異質(zhì)性已經(jīng)進(jìn)行了標(biāo)記(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774頁，McGraw-Hill，New York.；Eng等，Am.J.Hum.Genet.1993；531186-1197；Eng等，Mol.Med.1997；3174-182；和Davies等，Eur.J.Hum.Genet.1996；4219-224)。到目前為止，除了小的缺失和插入和較大的基因重排外，多種錯(cuò)義、無義和剪接突變也已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)道。
戈謝病戈謝病是能夠破壞脂肪葡糖腦苷脂的溶酶體酶β-葡糖腦苷脂酶的缺乏病。于是脂肪主要在肝臟、脾臟和骨髓中積累。戈謝病能夠?qū)е峦?、疲勞、黃疸、骨損傷、貧血甚至死亡。戈謝病有三種臨床表型。具有在生命的早期或早期成年人出現(xiàn)的I型的患者由于貧血、低血小板數(shù)量、肝臟和脾臟的增大、骨骼的弱化和一些情況下的肺臟和腎的損傷，容易碰傷和出現(xiàn)疲勞。沒有涉及腦的征兆。在II型中，早期發(fā)作，在3個(gè)月時(shí)出現(xiàn)肝臟和脾臟增大并且廣泛涉及到腦。在2歲前的死亡率很高。III型的特征是肝臟和脾臟增大并且腦抽搐。β-葡糖腦苷脂酶基因定位于人1q21染色體。其蛋白質(zhì)前體包含536個(gè)氨基酸并且其成熟的蛋白質(zhì)長度是497個(gè)氨基酸。
雖然來源于任何人種群的個(gè)體都可能患此病，但是認(rèn)為在來源于東歐的猶太人(德系猶太人(Ashkenazi))的后代中戈謝病更加普遍。在德系猶太人的群體中，戈謝病是最常見的遺傳病，發(fā)病率大約1/450。在一般大眾中，大約在100,000人中有一個(gè)戈謝病患者。根據(jù)國家高雪氏基金(NationalGaucher Foundation)，2,500個(gè)美國人患有戈謝病。
其它酶缺乏疾病葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏病是最常見的X-連鎖的人類酶缺乏病。G6PD酶催化對(duì)于核糖的產(chǎn)生是必要的氧化還原反應(yīng)，而核糖是DNA和RNA的主要成分。G6PD還參與維持細(xì)胞內(nèi)NADPH的足夠水平。在許多生物合成反應(yīng)中NADPH是所需要的輔因子。帶有該種缺乏病的個(gè)體的臨床癥狀包括新生兒黃疸、腹痛和/或背痛、眩暈、頭痛、呼吸困難(不規(guī)則呼吸)和心悸。
除了遺傳病外，其它的酶缺乏病可以由來源于原發(fā)和繼發(fā)疾病的組織或器官損傷引起。例如，由酒精中毒引起的損傷的胰腺組織或胰腺炎導(dǎo)致缺乏消化中需要的胰酶。當(dāng)前，胰腺炎可以用酶替代治療來進(jìn)行治療。
表1溶酶體貯積病，與之相關(guān)的缺陷酶，以及小分子活性部位特異陪伴分子
表1(續(xù))
用蛋白質(zhì)替代治療的其它疾病除了由蛋白質(zhì)缺乏所表征的疾病外，一些疾病可以通過使用替代蛋白質(zhì)以增強(qiáng)或刺激生物學(xué)過程來進(jìn)行治療。例如對(duì)患有貧血癥的個(gè)體施用重組紅細(xì)胞生成素(EPOGEN，PROCRIT，EPOIETIN)以刺激產(chǎn)生紅細(xì)胞和增加向組織運(yùn)輸氧。此外，可以施用重組干擾素如干擾素α2b(INTRON A，PEG-INTRON或者REBETOL)和干擾素β1a(AVONEX，BETASERON)分別用來治療乙型肝炎和多發(fā)性硬化癥。還可以施用的其它蛋白質(zhì)有重組人DNA酶I(rhDNase-PULMOZYME)，該酶是用于改善患有囊性纖維化患者肺功能的選擇性斷裂DNA的酶；研發(fā)的用于在已經(jīng)進(jìn)行了幾乎全部或全部甲狀腺切除術(shù)并且因此而必須接受甲狀腺激素的甲狀腺癌患者中使用的重組促甲狀腺激素(THYROGEN)；用于治療由于化學(xué)療法導(dǎo)致的嗜中性白血球減少癥的重組G-CSF(NEUPOGEN)和患有胰腺炎個(gè)體中的消化酶。蛋白質(zhì)治療的另一個(gè)重要領(lǐng)域是用高度特異的、活性位點(diǎn)較明確的抗體治療傳染性疾病和癌癥?？贵w治療產(chǎn)品包括用于治療呼吸道合胞病毒的RESPIRGRAM，用于治療乳腺癌的HERCEPTIN，用于治療關(guān)節(jié)炎和炎性疾病的REMICAID和HUMIRA及其它。針對(duì)抗體的ASSC是眾所周知的，可以采用靶抗原或者結(jié)構(gòu)相關(guān)的類似物(例如，活性靶抗原的修飾形式或者模擬物)。當(dāng)前投放市場(chǎng)的或者正處于臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)的作為蛋白質(zhì)治療有用的蛋白質(zhì)的名單見下面的表2。
表2在相關(guān)疾病中施用的替代蛋白質(zhì)
表2(續(xù))
蛋白質(zhì)缺乏癥和其它疾病的治療如上簡述，研發(fā)了基因治療、蛋白質(zhì)替代治療和小分子抑制劑治療作為治療策略以治療源于蛋白質(zhì)缺乏的遺傳病和從替代蛋白質(zhì)施用中受益的疾病。
蛋白質(zhì)替代治療通過使用灌注手段，外源性導(dǎo)入野生型或生物學(xué)功能性蛋白質(zhì)以增加蛋白質(zhì)的量。此種治療已經(jīng)研發(fā)用于多種遺傳病包括如上面所提到的戈謝病和法布里病。從重組細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞-見Desnick等的美國專利號(hào)5,580,757；Selden等的美國專利號(hào)6,395,884和6,458,574；Calhoun等的美國專利號(hào)6,461,609；Miyamura等的美國專利號(hào)6,210,666；Selden等的美國專利號(hào)6,083,725；Rasmussen等的美國專利號(hào)6,451,600；Rasmussen等的美國專利號(hào)5,236,838和Ginns等的美國專利號(hào)5,879,680)中純化了野生型酶。灌注后，預(yù)期外源性酶可通過非特異或者受體特異的機(jī)制被組織吸收。通常，吸收效率不高，并且外源蛋白質(zhì)的循環(huán)時(shí)間短(Ioannu等，Am.J.Hum.Genet.2001；6814-25)。此外，外源性蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的并且容易在細(xì)胞內(nèi)快速降解。
除了蛋白質(zhì)替代和基因治療外，已經(jīng)描述了使用酶抑制劑的小分子治療來治療LSD，即小分子抑制劑對(duì)于上面提到的缺乏酶前體的底物剝奪是有用的。已經(jīng)描述小分子抑制劑可以用于治療包括法布里病、戈謝病、龐皮病、泰-薩病、桑德霍夫病、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥的LSD(見Platt等的美國專利號(hào)5,472,969，5,580,884，5,798,366和5,801,185)。
使用ASSC和蛋白質(zhì)替代的共治療本發(fā)明通過共施用針對(duì)蛋白質(zhì)的ASSC來增強(qiáng)體外制劑或組合物中和體內(nèi)的純化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)替代治療的效果。使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法可以篩選針對(duì)靶蛋白質(zhì)的適當(dāng)?shù)腁SSC，所述的方法例如在2003年2月28日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)10/377,179中所述，此處引用作為參考。
替代蛋白質(zhì)的產(chǎn)生使用本發(fā)明的方法能夠治療的疾病包括但不限于LSD、葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、遺傳性肺氣腫、家族性高膽固醇血癥、家族性肥厚型心肌病、苯丙酮尿癥、貧血癥、乙型肝炎和多發(fā)性硬化。
使用本領(lǐng)域常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)可以分離和純化對(duì)于本發(fā)明方法有用的替代蛋白質(zhì)。例如使用如文獻(xiàn)所述的重組DNA表達(dá)可以分離編碼替代蛋白質(zhì)的核酸。見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(文中為“Sambrook等，1989”)；DNA CloningA Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover著，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.EHiggins著，1985)；Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins著，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney著，1986)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；B.EPerbal，A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等著，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons，Inc.(1994)。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以是全長的也可以是截短的，只要基因能夠編碼具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)即可。例如在Miyamura等的美國專利號(hào)6,210,666中所描述的具有生物學(xué)活性的截短形式的α-Gal A，該酶是法布里病相關(guān)缺陷酶。
將經(jīng)鑒定并分離的編碼靶蛋白質(zhì)的基因插入到恰當(dāng)?shù)目寺≥d體中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾多的載體-宿主系統(tǒng)?？赡艿妮d體包括但不限于質(zhì)?；蛘呓?jīng)修飾的病毒，但是載體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞相容。載體的例子包括但不限于大腸桿菌、諸如λ衍生物的噬菌體、諸如pBR322衍生物或者pUC質(zhì)粒衍生物例如pGEX載體、pmal-c、pFLAG等的質(zhì)粒。例如通過將DNA片段連接到具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體上實(shí)現(xiàn)對(duì)克隆載體的插入。然而，如果用于使DNA片段化的互補(bǔ)限制性酶切位點(diǎn)不存在于克隆載體上時(shí)，可以對(duì)DNA分子末端進(jìn)行酶性修飾。備選地，通過將核酸序列(接頭)連接到DNA末端可以產(chǎn)生目的位點(diǎn)，這些連接上去的接頭可以含有編碼限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的特異的化學(xué)合成寡核苷酸。通過遺傳操作例如包括在N端加上利于分泌的信號(hào)肽和加上含有多聚腺苷酸位點(diǎn)的3′非轉(zhuǎn)錄序列可以將重組蛋白的產(chǎn)量最大化。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞的構(gòu)建體是病毒來源的載體，包括但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、辛德比斯病毒和痘苗病毒。
通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等等方法可以將重組分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生多拷貝的基因序列。優(yōu)選地，所克隆基因包含于穿梭載體質(zhì)粒上，所述的質(zhì)粒用于在諸如大腸桿菌的克隆細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和方便的純化，以便于當(dāng)希望插入到恰當(dāng)表達(dá)細(xì)胞系中時(shí)可以在隨后插入到恰當(dāng)表達(dá)細(xì)胞系中。
有效的宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于用病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如痘苗病毒、腺病毒等等)；用病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)(例如，桿狀病毒)；諸如含有酵母載體的酵母微生物；或者用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或者粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性是可變的。根據(jù)所使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用許多適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。不同的宿主細(xì)胞具有特色的和特異的蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工和修飾(例如糖基化、剪切[例如信號(hào)肽的剪切])機(jī)制。為了保證對(duì)表達(dá)的外來蛋白質(zhì)進(jìn)行目的修飾和加工例如糖基化、唾液酸化和磷酸化，可以選擇恰當(dāng)?shù)募?xì)胞系或者宿主系統(tǒng)。例如，在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)可以用于生產(chǎn)非糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。然而，在細(xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是非正確折疊的。在酵母中進(jìn)行表達(dá)可以產(chǎn)生糖基化的產(chǎn)物。在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)提高了異源蛋白質(zhì)的“天然”糖基化和折疊的可能性。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)提供了一種用于重構(gòu)或者構(gòu)建蛋白質(zhì)的工具。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)不同程度地影響加工反應(yīng)例如蛋白酶剪切。通過使用如美國專利號(hào)6,274,597所述的特異的陪伴分子和上述公開的相關(guān)家族成員可以提高表達(dá)效率。
使用本領(lǐng)域已知的方法例如硫酸銨沉淀、含有疏水相互作用樹脂、陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂和層析聚焦樹脂的柱層析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)重組表達(dá)蛋白質(zhì)地純化。備選地，使用能夠與蛋白質(zhì)或者與重組蛋白融合的標(biāo)簽特異結(jié)合的恰當(dāng)多克隆或單克隆抗體的免疫親和層析可以對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的重組蛋白的純度至少為95％，優(yōu)選地為97％并且最優(yōu)選地大于98％。
替代蛋白質(zhì)的施用可以采用多種方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取和靶向替代蛋白質(zhì)。已經(jīng)鑒定出能夠介導(dǎo)膜轉(zhuǎn)運(yùn)并且因此而提供多肽向細(xì)胞質(zhì)遞送的肽序列。例如，可從觸角足(Antennapedia)同源域螺旋3獲得此種肽以產(chǎn)生膜轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)載體，例如細(xì)胞膜穿透肽(penetratin)(PCT公開WO 00/29427；也見Fischer等，J.Pept.Res.2000；55163-72；DeRossi等，Trends in Cell Biol.1998；884-7；Brugidou等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1995；214685-93)，從單純皰疹病毒來源的VP22蛋白質(zhì)(Phelan等，Nat.Biotechnol.1998；16440-3)和HIV TAT轉(zhuǎn)錄激活子。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括觸角足結(jié)構(gòu)域和HIVTAT結(jié)構(gòu)域(見Vives等，J.Biol.Chem.1997；27216010-17)具有特征性的正電荷，這導(dǎo)致研發(fā)出能夠用于轉(zhuǎn)移治療蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)入細(xì)胞的陽離子12-mer肽(Mi等，Mol.Therapy 2000；2339-47)。上面提到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域通過化學(xué)共價(jià)交聯(lián)共價(jià)連接到靶蛋白質(zhì)上或者作為融合蛋白質(zhì)而產(chǎn)生。更進(jìn)一步，Active MotifInc.(Carlsbad，CA)新近研發(fā)出了非共價(jià)的、人工合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。所述的結(jié)構(gòu)域通過疏水相互作用與靶蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，并且一旦蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞則該結(jié)構(gòu)域從蛋白質(zhì)上方便地解離下來(Morris等，Nat.Biotechnol.2001；191173-6)。此外，最近研究表明脂類運(yùn)載體除了具有遞送裸DNA的確定用途之外還可以遞送蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞(Zelphati等，J.Biol.Chem.2001；27635103-10)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)綜述見Bonetta，The Scientist 2002；16(7)38。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的替代蛋白質(zhì)是與溶酶體貯積病相關(guān)的酶(見表1)。編碼野生型的此種酶的核酸序列可以在文獻(xiàn)或者諸如GenBank的公開數(shù)據(jù)庫中找到，例如對(duì)于α-Gal A(AGA)為X14448，對(duì)于人葡糖腦苷脂酶(GCB)為J03059，對(duì)于人α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)為M74715，對(duì)于人酸性α-葡糖苷酶(GAA)為M34424，對(duì)于人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)為AF011889和對(duì)于人酸性鞘磷脂酶(ASM)為M59916。
在LSD中的酶替代當(dāng)前，在歐洲和美國可以得到針對(duì)LSD的幾種替代酶。替代酶包括用于治療戈謝病的葡糖腦苷脂酶的重組形式Cerezyme、α半乳糖苷酶A重組形式的Fabrazyme、用于治療MPS1的重組酶AldurazymeTM(以上所有均可從Genzyme Corp.得到)以及用于治療龐皮病病人的重組α葡糖苷酶(Van den Hout等，Lancet 2000；56397-8)。
活性部位特異的陪伴分子本發(fā)明所考慮的ASSC包括但不限于小分子(例如，分子量小于約2kD，更加優(yōu)選地小于約1kD的有機(jī)或無機(jī)分子)，包括底物或結(jié)合配偶體模擬物、小的配體衍生肽或其模擬物、諸如DNA、RNA的核酸、包括Fv和單鏈抗體的抗體和Fab片段、大分子(例如分子量大于約2kD的分子)和來自于諸如D-和/或L-構(gòu)型氨基酸分子庫的組合化學(xué)來源的庫的成員、磷酸肽諸如隨機(jī)或部分簡并的定向磷酸肽庫中的成員(見，例如Songyang等，Cell 1993，72767-778)。
合成庫(Needels等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，9010700-4；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，9010922-10926；Lam等，PCT
發(fā)明者樊建強(qiáng) 申請(qǐng)人:紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院